CN101935694B

CN101935694B - 检测含有筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片及其应用

Info

Publication number: CN101935694B
Application number: CN2010101237016A
Authority: CN
Inventors: 路兴波; 武海斌; 孙红炜; 韩伟; 李凡
Original assignee: Institute of Plant Protection Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Lu Bao Technology Development Co., Ltd.
Priority date: 2010-03-15
Filing date: 2010-03-15
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2030-03-15
Also published as: CN101935694A

Abstract

本发明公开了检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片，包括表面醛基化修饰的载玻片和阵列涂布于其上的筛选基因CaMV35S探针以及核酸固定的阳性对照(HEX)、杂交阳性对照(PC)、阳性质控探针(18S rRNA)、阴性质控探针、空白对照；所述的筛选基因CaMV35S探针序列为：NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGA。本发明的检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片，具有很好的特异性，灵敏度高，为含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的检测分析提供了基于简单、可靠的测定方法，可以用于转基因植物及其产品的检测。

Description

检测含有筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测含有筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片及其应用，属于生物芯片技术领域。

背景技术

近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获得批准种植和生产，有的被加工成食品、饲料或用做食物添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，40多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。

各国转基因标识制度的相继建立，对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求，各种转基因检测技术也成为研究热点。常用的转基因检测方法有聚合酶链式反应(PCR)法，外源蛋白检测法，基因芯片检测技术。虽然国外对转基因作物检测方法研究已有十几年，但由于转基因作物的种类多、数量大，一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后，转基因成分部分或完全降解，所以检测难度大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新检测方法。

但不容乐观的是，设计PCR反应引物是一个棘手的问题，必须确保反应中两条引物有相近的熔接温度，引物之间不会发生相互作用，另外还要注意非特异性扩增，特别是当非特异性扩增带与目的带相近时，就会出现假阳性问题，从而干扰结果的判断。随着GMO检测技术的发展情况及研究趋势，基因芯片技术在此展示了更大的优势。基因芯片检测原理是利用带有荧光标记的样品同探针特异杂交，从而产生阳性信号。因而非目的带的扩增只要不产生阳性信号，就不会干扰，而且芯片检测不依据电泳条带。并且基因芯片可根据任何已知基因组序列设计特异性探针，以人工合成的方法快速制备芯片，且高度并行性、高通量、微型化、自动化、高准确度和灵敏度等优点具有广泛的应用前景。

经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现关于CaMV35S基因的基因芯片检测技术的专利报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足和实际检测的需要，本发明提供了一种能够特异性地检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片，包括表面醛基化修饰的载玻片和阵列涂布于其上的筛选基因CaMV35S探针以及核酸固定的阳性对照(HEX)、杂交阳性对照(PC)、阳性质控探针(18S rRNA)、阴性质控探针、空白对照；

其中，所述阳性对照和杂交阳性对照均为北京博奥生物技术有限公司的产品，晶

核酸固定阳性对照(HEX)产品号为：502000，晶

杂交阳性对照(PC)产品号为：503000。

所述阳性质控探针为18S rRNA，其探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG；

所述阴性质控探针为SHDC-人类表达特异蛋白基因，其探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

ATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC；

所述阳性质控探针和阴性质控探针序列均来源于许小丹，文思远等(检测及鉴定转基因大豆寡核苷酸芯片的制备.农业生物技术学报，2005，13(4)：429-434)的报道；

所述空白对照为点样液为双蒸水；

所述的筛选基因CaMV35S探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGA。

所述芯片的阵列布局为人为规定，可以任意布局，比如图1所示的布局。

所述载玻片上还可以涂布有探针对照，探针对照包括转基因玉米Bt176转化体特异性探针、转基因玉米Bt11转化体特异性探针、转基因玉米TC1507转化体特异性探针、转基因玉米Mon810转化体特异性探针和转基因玉米GA21转化体特异性探针。

所述转基因玉米Bt176转化体特异性探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

TGCCCGTCACCGAGATCTGATGTTCTCTCCTCCATTGATG。

所述转基因玉米Bt11转化体特异性探针的序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

TGTATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGATTTTTGGTGGAG。

所述转基因玉米TC1507转化体特异性探针的序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

GCGGAACACAAGAACGAAAGCACCTTTTCATTCTTTCATA。

所述转基因玉米Mon810转化体特异性探针的序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-ACCTGAACGAGGACTTTCGGTAGCCTTCTTTCATTTCCGA。

所述转基因玉米GA21转化体特异性探针的序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-ATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGGGTCCG。

上述的GA21、Bt11、Bt176、TC1507、和Mon810的特异性探针对照均来源于路兴波，武海斌等(转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片检测方法的研制.作物学报，2009，35(8)：1432-1438)的报道。

所述阳性对照、杂交阳性对照、阳性质控探针、阴性质控探针、空白对照、探针对照的点样浓度均为25μmol/L。

所述筛选基因CaMV35S探针的点样浓度为25μmol/L。

本发明的基因芯片的的应用方法为：提取待测植物或待测产品的基因组DNA，然后在二重荧光PCR反应体系中扩增，然后取PCR产物，与杂交液混匀后，于PCR仪中95℃热变性10min，冰浴骤冷后加样于芯片上的点样区，盖玻片封片；42℃水浴杂交2h；杂交后，芯片分别在42℃的洗液I和洗液II中各清洗4min，500r/min离心甩干，用晶LuxScanTM 10K激光共聚焦扫描仪进行扫描，波长532nm；PMT为850∨，Power为90∨，产生分析精度为10μm的16位TIFF图像；用LuxScan3.0软件进行数据采集和图像分析，分析扫描图像的荧光强度值以确定待测植物是否含有CaMV35S基因；

所述杂交液包括：3×SSC，0.2％SDS，25％甲酰胺，5×Denhart’s，33nmol/L PC杂交阳性对照样品；

所述洗液I包括：2×SSC，0.1×SDS；

所述洗液II为0.2×SSC。

所述荧光染料为Cy3-Amidite。

本发明的芯片的制备原理是：以含有CaMV35S的转基因玉米Bt11为阳性对照材料，以转基因玉米GA21、Bt176和MIR604，转基因大豆GTS40-3-2、非转基因玉米郑单958、非转基因大豆1138-2、非转基因棉花中49等作为对照，根据CaMV35S序列，利用Primer premier5.0引物设计软件设计特异性引物，并对引物进行筛选和优化。荧光标记引物在5，端用Cy3-Amidite进行荧光标记。利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件设计40mer OligoCaMV35S备选探针，探针在5’端以氨基己烷修饰，氨基和探针序列之间以间隔臂poly(dT15)相连，使最终探针长度为55bp。

可以利用本发明设计的基因芯片对含有筛选基因CaMV35S的转基因植物及其产品进行特异性检测。

本发明的检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片，具有很好的特异性，灵敏度高，为含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的检测分析提供了基于简单、可靠的测定方法，可以用于转基因植物及其产品的检测。本发明为转基因标识提供了一种有用的参考，为转基因产品的控制提供了必要的手段，可以满足我国在进出口检验、种子市场抽检、转基因作物监控监测等方面的检测需求，提高我国转基因生物的监管水平。

附图说明

图1为本发明的基因芯片阵列分布图；

其中：a1～a5-核酸固定的阳性对照(HEX)，a6～a10、b6～b10、c6～c10、d1～d5、d6～d10、e1～e5、e6～e10-空白对照(点样液)；b1～b5-杂交阳性对照(PC)；c1～c5-CaMV35S探针；f1～f5，g6～g10-阳性质控探针(18S rRNA)；f6～f10，g1～g5-阴性质控探针(SHDC-人类表达特异蛋白基因)；

图2为本发明的实施例1中的基因芯片阵列分布图；

其中，A1～A5-核酸固定的阳性对照(HEX)；A6～A10，B6～B10-空白对照(点样液)；B1～B5-杂交阳性对照(PC)；C1～C5-CaMV35S探针；C6～C10-GA21；D1～D5-TC1507；D6～D10-Mon810；E1～E5-Bt11；E6～E10-Bt176；F1～F5，G6～G10-阳性质控探针(18SrRNA)；F6～F10，G1～G5-阴性质控探针(SHDC-人类表达特异蛋白基因)。

图3为筛选基因CaMV35S特异性PCR检测示意图；

其中：M-分子量Marker；1-阴性对照DNA模板；2-阳性对照DNA模板；3-非转基因玉米郑单958基因组DNA模板；4-非转基因大豆1138-2基因组DNA模板；5-非转基因棉花中49基因组DNA模板；6-转基因玉米Bt176基因组DNA模板；7-转基因玉米GA21基因组DNA模板；8-转基因玉米MIR604基因组DNA模板；9-转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA模板；10-空白对照。

图4(a)为筛选基因CaMV35S特异性芯片杂交信号图；

图4(b)为非转基因植物及其产品的芯片杂交信号图(为图4(a)的对照)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1：

1、引物和探针的设计

引物在5’端用Cy3-Amidite进行荧光标记。引物由上海博亚生物公司合成，引物稀释成10μmol/L备用。

利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件根据CaMV35S的序列设计40mer Oligo备选探针，设计一般原则为：(1)具有较相近的TM值，上下波动范围为5℃；(2)GC含量为45％～55％之间，否则将增加非特异性杂交背景；(3)重复的单一碱基连续不超过4个；(4)探针分子最稳定二级结构配对碱基长度不大于4bp。探针在5’端以氨基己烷修饰，氨基和探针序列之间以间隔臂poly(dT15)相连，使最终探针长度为55bp。所有探针在上海博亚生物公司合成。

2、芯片制备

将探针溶解在芯片点样液中，稀释成25μmol/L，取20μL转移到384孔板，用博奥生物芯片有限公司晶SmartArrayerTM-16芯片点样仪点样。先预点40点后再点至醛基化玻片上，点间距为350μm，点样后的芯片进行处理备用。每种样品点样重复5次，并同时点有核酸固定的阳性对照(HEX)，杂交阳性对照(PC)，阳性质控探针(18S rRNA)，阴性质控探针(SHDC-人类表达特异蛋白基因)，空白对照(点样液)，探针对照。以保证信号的重复性及稳定性。图2为本实施例所制备芯片阵列示意图，除包括筛选基因CaMV35S的特异性探针外，还包括GA21、Bt176、Bt11、Mon810、及TC1507的特异性探针。

3、应用方法

1)应用特异性引物序列进行筛选基因CaMV35S特异性定性PCR检测方法：

所引用的引物序列如下(NY/T 675-2003)：

CaMV35S-F：5’GCT CCT ACA AAT GCC ATC ATT GC 3’

CaMV35S-R：5’GAT AGT GGG ATT GTG CGT CAT CCC 3’。

用博日Biospin植物基因组DNA提取试剂盒，分别取转基因玉米Bt11、MIR604和GA21等转基因玉米，转基因大豆GTS40-3-2、非转基因玉米郑单958、非转基因大豆1138-2、非转基因棉花中49的基因组DNA为模板，应用引物进行PCR扩增。在20μL反应体系中以100ng不同来源的基因组DNA为模板，其他各组分终浓度为，PCR Buffer 2×(含有1U Taq DNA聚合酶，10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，250μM dNTPs)，引物各为0.5μM。反应条件为，95℃5min预变性，95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，循环35次，72℃保温2分钟。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。

2)利用本发明中所设计的特异性探针序列进行转基因植物及其产品筛选基因CaMV35S特异性基因芯片检测方法：

所述的筛选基因CaMV35S探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCCAAAGA。

GA21、Bt11、Mon810、TC1507和Bt176的特异性探针均来源于路兴波，武海斌等(转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片检测方法的研制.作物学报，2009，35(8)：1432-1438)的报道，属公知技术，在此不再赘述。

在30μL二重荧光PCR反应体系中以100ng待测植物的基因组DNA为模板，其他各组分终浓度为，PCR Buffer 2×(含有1U Taq DNA聚合酶，10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，250μM dNTPs)，0.4μM上下游玉米引物，0.04μM的18S rRNA的上下游引物。反应条件为，95℃5min预变性，95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，循环35次，72℃保温5分钟。取7μL PCR产物与8μL杂交液(3×SSC，0.2％SDS，25％甲酰胺，5×Denhart’s，33nmol/L PC杂交阳性对照样品)混匀后，于PCR仪中95℃热变性10min，冰浴骤冷后加样于芯片上的点样区，盖玻片封片。42℃水浴杂交2h。杂交后，芯片分别在42℃的洗液I(2×SSC，0.1×SDS)和洗液II(0.2×SSC)中各清洗4min，500r/min离心甩干，用晶

LuxScanTM 10K激光共聚焦扫描仪进行扫描(波长532nm)。PMT为850∨，Power为90∨，产生分析精度为10μm的16位TIFF图像。用LuxScan3.0软件进行数据采集和图像分析。所有的反应都重复3次。以非转基因玉米的基因组DNA作为对照。

3、实验结果

应用引物以提取的基因组为模板进行PCR扩增，结果如图3所示。由图可见，只有阳性对照，含有筛选基因CaMV35S的Bt176和GTS40-3-2基因组成功扩增出特异性195bp PCR产物，而其他转基因和非转基因样品做模板时都没有扩增产物可观察到。

2)利用本发明中所设计的特异性探针序列进行筛选基因CaMV35S特异性基因芯片检测方法：

针对外源基因与玉米基因组连接区域设计相应的探针，利用二重荧光PCR产物与芯片杂交，经反复对杂交温度、杂交时间等条件的优化，验证是否产生预期的有效信号。并且无其他探针产生非特异性信号来说明探针的特异性。结果如图4(a)、(b)所示。探针特异性检验结果表明，针对转化体特异性基因所设计的探针符合预期设计的目的，核酸固定的阳性对照(HEX)，杂交阳性对照(PC)，阳性质控探针(18S rRNA)和筛选基因CaMV35S特异性相应探针点样位置均有阳性信号，而阴性质控探针(SHDC-人类表达特异蛋白基因)，空白对照(点样液)及其他转基因玉米探针对照均无阳性信号出现，说明所设计的探针具有很好的特异性，所建立的芯片检测平台是可靠的。

以上结果可以看出，本发明为转基因植物及其产品筛选基因CaMV35S特异性基因芯片检测分析提供了基于简单、可靠的测定方法，可以用于转基因植物及其产品筛选基因CaMV35S的检测。本发明为转基因标识提供了一种有用的参考，为转基因产品的控制提供了必要的手段。

序列表

<110>山东省农业科学院植物保护研究所

<120>检测含有筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片及其应用

<130>无

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>筛选基因CaMV35S探针

<222>(1)..(40)

<400>1

ctatcgttca agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga 40

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>阳性质控探针

<222>(1)..(40)

<400>2

atggtggtga cgggtgacgg agaattaggg ttcgattccg 40

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>阴性质控探针

<222>(1)..(40)

<400>3

attgccagaa gacatcctta cttttatgcc ccggaactcc 40

Claims

1.一种检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片，其特征在于：包括表面醛基化修饰的载玻片和阵列涂布于其上的筛选基因CaMV35S探针以及核酸固定的阳性对照、杂交阳性对照、阳性质控探针、阴性质控探针、空白对照；

其中，所述阳性质控探针为18S rRNA，其探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG；

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

ATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC；

所述空白对照为点样液，其成分为双蒸水；

所述的筛选基因CaMV35S探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

CTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGA。

2.根据权利要求1所述的检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片，其特征在于：所述载玻片上还涂布有探针对照，探针对照包括转基因玉米Bt176转化体特异性探针、转基因玉米Bt11转化体特异性探针、转基因玉米TC1507转化体特异性探针、转基因玉米Mon810转化体特异性探针和转基因玉米GA21转化体特异性探针。

3.根据权利要求1或2所述的检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片，其特征在于：所述阳性对照、杂交阳性对照、阳性质控探针、阴性质控探针、探针对照的点样浓度均为25μmol/L；所述筛选基因CaMV35S特异性探针的点样浓度为25μmol/L。

4.权利要求1所述的检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及产品的基因芯片在特异性检测含筛选基因CaMV35S的转基因植物及其产品中的应用。