CN104114716A - 用于识别和定量化单链靶核酸的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于识别和定量化至少一种单链靶核酸(9)的方法和用于检测样品中至少一种单链靶核酸(9)的试剂盒。该方法包括使至少一个固态载体(1)与至少一种互补链寡核苷酸7)、至少一种单链靶核酸(9)和至少一种具有标记(13)报道基因寡核苷酸(11)接触，其中在所述固态载体(1)上已经固定有至少一种俘获寡核苷酸(5)，并且通过读取载体(1)上的报道基因寡核苷酸(11)的标记(13)来识别所述靶核酸(9)。

Description

用于识别和定量化单链靶核酸的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及用于识别和定量化至少一种单链靶核酸的方法，并涉及用于检测样品中的至少一种单链靶核酸的试剂盒。
发明背景
细胞中的基因表达受到严格控制并由多种分子过程调节。除复杂的基因转录调节之外，在转录后水平上(即在mRNA水平上)的机理也是很重要的。特别地，短的、非编码的核酸分子可以通过以下方式来干预基因表达：以高度特异性的方式连接mRNA分子的互补序列并从而调节mRNA的翻译以生成相应的蛋白质。这种短核酸分子通常是所谓的微RNA(microRNAs)(简称“miRNAs”)，近年来分子生物学和医学对其的研究兴趣日益浓厚。例如，证明一些miRNA与某些癌症例如乳腺癌、肺癌和白血病的发展直接有关联是可能的。在这些癌症中，癌细胞具有增多或减少的特异性miRNA数量。在免疫性疾病(例如风湿病)的情况下，某些miRNA也出现浓度变化。人们认为，仅在人类中就存在超过1000种不同的miRNA。
鉴于miRNA的日益增加的重要性和多样化，需要用于具体识别和定量化它们的方法。
已知有各种用于检测miRNA的方法，例如借助实时PCR装置的miRNA测序(Sequenzierung)或miRNA扩增。
US6,322,971描述了一种用于检测核酸的基于杂交的方法。在该方法中，在两个核酸已经附着(lanlagern)于固定的相反链寡核苷酸(Gegenstrang-Oligonukleotid)并且已经由DNA聚合酶填充待检测的核酸和经标记的核酸之间缺失的核苷酸之后，使待检测的核酸与第二种标记核酸共价键合。通过提高温度除去未键合的标记核酸。
US6,344,316描述了一种检测核酸的方法，其中在寡核苷酸作为相反链附着于待检测的核酸之后，使固定的俘获寡核苷酸与第二种标记核酸共价键合。通过高温洗涤除去待检测核酸之后，共价键合的标记得以保留。
现有技术出现各种问题。例如，miRNA检测的特异性和灵敏度是不足够的。在基于杂交的方法情形下，低特异性特别是因为识别过程不要求miRNA的完全杂交。由于所述方法的低灵敏度，通常在检测之前需要扩增miRNA。扩增期间，引入错误的核苷酸可能会发生，从而甚至进一步限制miRNA检测的特异性。此外，该方法必须在低温下实施，因为miRNA杂交的长度小与低解链温度相关。因此，miRNA检测既不是特别稳定的(robust)也不是可定量分析的。此外，许多方法要求分析前的miRNA标记，这必然伴有不准确的结果和矫作物(Artefakten)的风险。
发明内容
因此，本发明的目的之一在于提供解决这些问题的方法以及用来实施该方法的试剂盒。
该目的是通过具有如权利要求1所要求保护的特征的方法和具有如权利要求10所要求保护的特征的试剂盒来实现的。
本发明用于识别和定量化至少一种单链靶核酸的方法包括以下步骤：提供至少一种在其上固定至少一种俘获寡核苷酸的固态载体；在第一反应条件下使所述载体与至少一种相反链寡核苷酸、至少一种单链靶核酸以及具有标记的至少一种报道基因寡核苷酸(Reporter-Oligonukleotid)接触，所述相反链寡核苷酸包括与所述俘获寡核苷酸至少部分互补的寡核苷酸序列、与所述靶核酸互补的寡核苷酸序列和与所述报道基因寡核苷酸至少部分互补的寡核苷酸序列，以使所述俘获寡核苷酸和所述报道基因寡核苷酸各自至少部分地与所述相反链寡核苷酸杂交，并且使靶核酸与所述相反链寡核苷酸杂交，从而靶核酸的第一末端和俘获寡核苷酸的自由端与相反链寡核苷酸的相邻核苷酸形成碱基对，并且靶核酸的第二末端和报道基因寡核苷酸的第一末端与相反链寡核苷酸的相邻核苷酸形成碱基对。接下来的步骤是：在第一反应条件下培育载体，从而连接(Ligieren)靶核酸的第一末端和俘获寡核苷酸的自由端以使靶核酸共价键合俘获寡核苷酸，并从而连接靶核酸的第二末端与报道基因寡核苷酸的第一末端以使靶核酸共价键合报道基因寡核苷酸；在第二反应条件下以如下方式培育载体：仅在靶核酸的两端被连接的情况下使报道基因寡核苷酸和载体保持连接，并且读取载体上的报道基因寡核苷酸的标记。
术语“靶核酸”是指长度为约10～约30个核苷酸的单链核酸。所述核酸可以是RNA或DNA。优选天然存在的核酸和以化学的方法或重组产生的核酸作为靶核酸。
对本发明的方法来说，首先提供至少一个固态载体。在一项优选的实施方式中，所述固态载体为芯片、优选硅芯片。硅芯片的制造成本低廉，并且提供了在芯片上容易地集成附加元件(例如电极、温度传感器或冷却加热元件)的可能性。
在特别优选的实施方式中，至少一个电极、优选金电极集成在载体的表面上。核酸和寡核苷酸能够容易于固定于金表面。电极可被用于对标记的电化学读取，特别用于测量电流。
在一项优选的实施方式中，固态载体具有温控单元或温度传感器。这使得调整或测量固态载体的温度成为可能。在另一项实施方式中，固态载体包括用于冷却或加热载体的冷却和/或加热单元。
至少一种俘获寡核苷酸固定于固态载体上。术语“寡核苷酸”是指核酸。该术语涵盖单链和双链核酸。该术语涵盖RNA分子(所谓的寡核糖核苷酸)和DNA分子(所谓的寡脱氧核糖核苷酸)。
俘获寡核苷酸包括与相反链寡核苷酸至少部分互补的寡核苷酸序列。俘获寡核苷酸中序列与相反链寡核苷酸互补的片段(section)优选长度最大为约30个核苷酸。
在一项优选的实施方式中，俘获寡核苷酸为单链的俘获寡核苷酸。
在一项优选的实施方式中，俘获寡核苷酸为寡脱氧核糖核苷酸。
在另一项实施方式中，俘获寡核苷酸通过硫醇基固定于载体上。
在一项优选的实施方式中，通过隔片(Spacer)将俘获寡核苷酸固定在载体上。隔片的应用使得俘获寡核苷酸与相反链寡核苷酸有效杂交。隔片优选由胸腺嘧啶核苷酸(Thymidinnukleotiden)构成。可通过硫醇基将其固定于载体上。
在本发明的方法中，载体随后在第一反应条件下与至少一种相反链寡核苷酸、至少一种单链靶核酸和至少一种具有标记的报道基因寡核苷酸接触。
报道基因寡核苷酸包括与相反链寡核苷酸至少部分互补的寡核苷酸序列。报道基因寡核苷酸中序列与相反链寡核苷酸互补的片段长度优选最大为约30个核苷酸。
在一项优选的实施方式中，报道基因寡核苷酸为单链的报道基因寡核苷酸。
在一项优选的实施方式中，报道基因寡核苷酸为寡脱氧核糖核苷酸。
报道基因寡核苷酸具有标记。该标记能够例如为酶、特别是酯酶或荧光染料。该标记能够附着于报道基因寡核苷酸的第二末端。该标记还可连接至在报道基因寡核苷酸的两端之间的报道基因寡核苷酸，例如与碱基键合。
相反链寡核苷酸为包括至少以下的寡核苷酸序列的单链寡核苷酸：与俘获寡核苷酸至少部分互补的寡核苷酸序列、与靶核酸互补的寡核苷酸序列和与报道基因寡核苷酸至少部分互补的寡核苷酸序列。因此，在各自的情形下俘获寡核苷酸和报道基因寡核苷酸与相反链寡核苷酸能够至少部分杂交，并且靶核酸与相反链寡核苷酸能够杂交。
相反链寡核苷酸中序列与俘获寡核苷酸或报道基因寡核苷酸互补的片段长度分别优选最大为约30个核苷酸。
术语“杂交”是指随着氢键在各个互补性碱基之间的形成，单链的RNA或DNA附着于至少部分互补的单链RNA或DNA，从而碱基对在两个核酸分子间的彼此互补的片段中形成。术语“碱基对”涵盖了沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对和非沃森-克里克碱基对，例如所谓的摆动碱基对(Wobble-Basenpaarung)。典型的摆动碱基对是鸟嘌呤与尿嘧啶的碱基对，其例如能够在DNA附着至RNA时形成。
在一项优选的实施方式中，与靶核酸互补的相反链寡核苷酸的寡核苷酸序列与该靶核酸完全互补。因此，该靶核酸可以与相反链寡核苷酸完全杂交。完全杂交是指靶核酸的每个单独碱基与相反链寡核苷酸形成碱基对，并因此不会有单独碱基的错配。
与俘获寡核苷酸至少部分互补的相反链寡核苷酸的寡核苷酸序列直接邻接互补于靶核酸的寡核苷酸序列。由此，靶核酸的第一末端和俘获寡核苷酸的自由端与随后直接邻近的相反链寡核苷酸的核苷酸形成碱基对。与报道基因寡核苷酸至少部分互补的寡核苷酸序列直接邻接于与靶核酸互补的寡核苷酸序列的另一端。由此，靶核酸的第二末端和报道基因寡核苷酸的第一末端与随后直接邻近的相反链寡核苷酸的核苷酸形成碱基对。这导致了待连接的各种核酸分子的末端被相邻排列并且使得它们彼此直接连接而不会预先填充缺失的核苷酸。因为为了连接各种核酸分子不需要填充缺失的核苷酸，所以能以特别简便且快速的方式实施该方法。
在一项优选的实施方式中，靶核酸完全互补于相反链寡核苷酸的对应核苷酸序列，并由此能够高特异性地识别和/或定量化靶核酸。
在一项优选的实施方式中，相反链寡核苷酸包括与俘获寡核苷酸完全互补的寡核苷酸序列和/或与报道基因寡核苷酸完全互补的寡核苷酸序列。这实现了相反链寡核苷酸与俘获寡核苷酸和/或与报道基因寡核苷酸的特别稳定的杂交。这有助于对靶核酸可信的识别和定量化。
在一项优选的实施方式中，相反链寡核苷酸为寡脱氧核糖核苷酸。
在一项特别优选的实施方式中，相反链寡核苷酸、俘获寡核苷酸和报道基因寡核苷酸为寡脱氧核糖核苷酸，而靶核酸为RNA，并且由此在杂交过程中至少部分形成热力学上非常稳定的RNA/DNA双链体。
术语“反应条件”是指在实施所述方法步骤中的至少一个时的至少一个参数或参数的组合。该参数优选包括温度、盐浓度、离子强度、pH和/或试剂补充物(例如甲酰胺)。在一项优选的实施方式中，反应条件是指解链俘获寡核苷酸、靶核酸、报道基因寡核苷酸和相反链寡核苷酸的碱基对的适当条件。
反应条件特别指温度。
第一反应条件是在该反应条件下俘获寡核苷酸和报道基因寡核苷酸至少部分与其互补的相反链寡核苷酸的相应部分杂交并且靶核酸与其互补的相反链寡核苷酸的相应部分杂交的反应条件。第一反应条件优选根据寡核苷酸和靶核酸的序列和长度来选择。第一反应条件可能额外地取决于寡核苷酸和靶核酸是否是RNA和/或DNA分子。
在一项优选的实施方式中，第一反应条件包括温度为42℃、在50mMTris HCl(pH7.5)、300mM NaCl、10mM MgCl2、5mM EDTA和0.025％Tween20中。
在另一项实施方式中，第一反应条件包括温度为37℃、在66mM TrisHCl(pH7.6)、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT、1mM ATP和7.5％PEG6000中。
本发明的方法还包括在第一反应条件下培育载体。
本发明的方法进一步包括连接靶核酸的第一末端和俘获寡核苷酸的自由端以使靶核酸和俘获寡核苷酸共价键合，并且连接靶核酸的第二末端和报道基因寡核苷酸的第一末端以使靶核酸和报道基因寡核苷酸共价键合。术语“连接”(“Ligieren”和“Ligation”)是指在糖-磷酸骨架上的两个单链寡核苷酸之间形成共价化学键。该术语涵盖了单链RNA或DNA的3'-羟基末端与第二个RNA或DNA的5'-磷酰基末端的键合，其也涵盖了RNA和DNA的连接。通过酶、所谓的连接酶、优选DNA连接酶能够催化共价键的生成，并且共价键的生成是ATP依赖性的。
本发明的方法进一步包括在第二反应条件下以如下方式培育载体：只在两端连接有靶核酸的情况下使报道基因寡核苷酸和载体保持连接。第二反应条件是解链相反链寡核苷酸与俘获寡核苷酸、靶核酸和报道基因寡核苷酸的碱基的反应条件。在该解链过程中，各个配对碱基之间的氢键断裂。如果靶核酸不是在两端连接，那么报道基因寡核苷酸就会从载体上脱离。
在一项优选的实施方式中，第二反应条件包括比第一反应条件更高的温度和/或更小的离子强度。这有利于在第二反应条件下在各个配对碱基之间的氢键的断裂。
在一项实施方式中，相反链的寡核苷酸通过从俘获寡核苷酸、靶核酸和报道基因寡核苷酸脱离而从载体脱离。
在一项优选的实施方式中，相反链寡核苷酸保留在载体上。为了实现这一点，相比于相反链寡核苷酸从载体上脱离的反应条件，第二反应条件优选具有较低的温度和/或较大的离子强度。
由于作为这两次连接反应(ligation)的结果的能量增益(energy gain)，通过碱基对与俘获寡核苷酸、靶核酸和报道基因寡核苷酸连接的相反链寡核苷酸的存在具有能量稳定的效果。与不存在相反链寡核苷酸的情况相比，这种稳定使得在更温和的条件下实施载体上标记的读取成为可能。
在一项优选的实施方式中，第二反应条件包括温度为52℃、在50mMTris HCl(pH7.5)和150mM NaCl中。
在另一项实施方式中，第二反应条件包括温度为50℃、在25mM TrisHCl(pH7.5)和25mM NaCl中。
本发明的方法进一步包括读取载体上的报道基因寡核苷酸的标记。使用载体上存在的标记，检测到靶核酸在两端处已经被连接，靶核酸的第一末端已经连接至俘获寡核苷酸的自由端，并且靶核酸的第二末端已经连接至报道基因寡核苷酸的第一末端。由于只有在两端连接的靶核酸存在下报道基因寡核苷酸才与载体保持连接，通过检测载体上的报道基因寡核苷酸的标记识别靶核酸。对载体上标记的检测也能够起到定量化靶核酸的作用。
本发明方法的步骤顺序不是固定的，即还可以以不同于权利要求1所限定的顺序来实施各个步骤。
在一项优选的实施方式中，以如权利要求1所限定的顺序实施所述步骤。
在一项优选的实施方式中，本发明方法的两个或多个步骤结合在一起。因此，能特别有效地实施该方法。在一项优选的实施方式中，使步骤b)和步骤d)结合在一起。为了这一目的，用于连接所需的试剂(例如连接酶)可以在步骤b)中预先加入载体中。在另一项实施方式中，在单个步骤中实施步骤b)和步骤c)。
本发明方法的优势在于，直接识别和/或定量化靶核酸。特别地，不需要以化学或酶促的方式修饰靶核酸。由于优选修饰某些靶核酸，经修饰的靶核酸的定量化可能导致不准确的结果。通过直接检测靶核酸避免了这些不准确性。此外，也避免了在修饰靶核酸过程可能产生的矫作物。
本发明的方法是非常灵敏的，并从而甚至能够检测到低含量的靶核酸。因此，没有必要在识别前扩增靶核酸，并从而也不会将错误的核苷酸整合至靶核酸中。这提高了该方法的特异性。
鉴于靶核酸的两端同时参与其识别这一事实，本发明的方法具有高选择性。
由于这两次连接反应，通过靶核酸和俘获寡核苷酸将报道基因寡核苷酸共价键合至载体。这意味着报道基因寡核苷酸的标记的检测与寡核苷酸和靶核酸的序列和长度无关，这导致报道基因寡核苷酸、靶核酸和俘获寡核苷酸附着于相反链寡核苷酸是温度依赖性的。因此，最好调节读取标记时的温度至所使用标记的性质。这有助于该方法的高灵敏度。此外，报道基因寡核苷酸和载体之间稳定的共价键允许对标记稳健地且定量化地分析读数。
在一项优选的实施方式中，在步骤d)之前和/或在步骤e)中和/或在步骤f)之前额外地实施载体的清洗。清洗从载体除去脱离的相反链寡核苷酸。还从载体去除了未键合的报道基因寡核苷酸和未键合的核酸。这避免了在读取标记的过程中相反链寡核苷酸再次附着于俘获寡核苷酸和报道基因寡核苷酸再次附着于相反链寡核苷酸。这使得载体上标记检测的特异性增加并因此增加了靶核酸识别的特异性。
在一项优选的实施方式中，在严格的反应条件下于步骤d)之前对载体进行清洗。
术语“严格的反应条件”是指在该反应条件下只有完全杂交的靶核酸才与相反链寡核苷酸保持连接，而相对于对应的相反链寡核苷酸的寡核苷酸序列，序列具有一个或多个碱基错配的靶核酸分子从相反链寡核苷酸上脱离。连接反应前通过在严格的反应条件下清洗载体，实现了该方法的高特异性。
在一项优选的实施方式中，靶核酸为RNA，优选微小RNA(miRNA)。miRNA是长度为约17～约25个核酸的、非编码的、单链的RNA，其在基因表达的转录后调节中是有效的。miRNA高特异性地附着至mRNA分子的互补序列上，并因此调节mRNA的翻译以生成相应的蛋白质
在另一项实施方式中，靶核酸是单链的小分子干扰RNA(small interferingRNA)(siRNA)。与miRNA类似，siRNA也可以通过特异性地附着于mRNA分子的互补序列并调节mRNA的翻译以生成相应的蛋白质来参与基因表达的转录后调节。
在一项优选的实施方式中，T4DNA连接酶用于连接反应。T4DNA连接酶是在双链的DNA、RNA/DNA或RNA分子中催化第一核酸分子的3'-羟基端和随后直接邻近的第二核酸分子的5'-磷酰基端的ATP依赖型的连接反应的酶。这种催化反应产生了共价型磷酸二酯键。
在一项优选的实施方式中，对靶核酸、俘获寡核苷酸和/或报道基因寡核苷酸的一端实施磷酸化。术语“磷酸化”是指磷酸基部分附着于RNA或DNA的5'-羟基末端。两个随后直接邻近的寡核苷酸或核酸分子的连接反应需要第二核酸分子上的5'-磷酰基端。第二核酸分子的5'-磷酰基端的存在特别取决于其合成方法。作为磷酸化的结果，能够附着缺失的5'-磷酰基端，从而能够使俘获寡核苷酸连接至靶核酸并且靶核酸连接至报道基因寡核苷酸。
在一项优选的实施方式中，磷酸化是酶促磷酸化。
在一项优选的实施方式中，通过使待磷酸化的分子与T4多核苷酸激酶(T4Polynukleotidkinase)接触来实施磷酸化。T4多核苷酸激酶是一种催化RNA或DNA分子的5'-羟基端磷酸化的酶。
在一项优选的实施方式中，报道基因寡核苷酸的标记是酶。
在一项特别优选的实施方式中，所述酶是酯酶、特别是热稳定的酯酶。由于热稳定性，在方法过程中所述酯酶的酶促活性甚至在高温下也得以保留。因此，优选地，在早至该方法开始时能够使经酯酶标记的报道基因寡核苷酸接触载体，而只在该方法的最后步骤中实施标记的读取。
在一项优选的实施方式中，酯酶是来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的热稳定性酯酶2。所述酯酶2是由单一的蛋白链构成并因此能够容易地偶联至报道基因寡核苷酸。
在一项优选的实施方式中，所述酶以共价键的方式键合于报道基因寡核苷酸。由此，所述酶稳定地连接于报道基因寡核苷酸，并且不会由于清洗过程或变化的温度而从报道基因寡核苷酸上脱离。因此，能够确保靶核酸被可信地识别和定量化。
在一项优选的实施方式中，所述酶通过硫醇基与报道基因寡核苷酸的氨基键合。特别地，来自于酸热脂环酸芽孢杆菌的酯酶2通过半胱氨酸以直接的方式键合至报道基因寡核苷酸。这种直接键合确保了酯酶2的活性位点能接近底物。本领域技术人员能够从例如Wang et al.,Biosensors andBioelectronics22,2007,1798-1806中获知酯酶2直接共价键合至寡核苷酸。
在另一项实施方式中，所述标记为优选与报道基因寡核苷酸共价键合的荧光染料。该荧光染料的应用允许特别简单且快速地读取标记。此外，读取过程不需要底物，并从而该方法能够以特别划算的方式实施。
在一项优选的实施方式中，以电化学的方式来读取标记。在电化学读取过程中，在优选是酶的标记上底物被转化成氧化还原活性的反应产物，从而使得在电极处测量电流或电压变化成为可能。
在一项优选的实施方式中，通过对氨基苯酚(p-Aminophenol)和醌亚胺(Quinonimin)的氧化还原循环来实现读取。为此，该标记优选为将底物对氨基苯基丁酸酯(p-Aminophenylbutyrat)水解成氧化还原活性反应的产物对氨基苯酚的酶。通过反转电极电势的极性，实现了对氨基苯酚和醌亚胺的氧化还原循环，其中不断产生电子。因此，能够在电极处测量电流。该电流表示了酶标记的检测并且也是在酶标记上底物转化成反应产物的度量。因此，通过测量电流电化学读取标记能够用于识别和/或定量化靶核酸。
在另一项实施方式中，在读取温度下对载体上的标记进行读取。读取温度是在酶具有高度酶活性的范围内。如果使用来自酸热脂环酸芽孢杆菌的酯酶2作为标记，那么该读取温度优选为约30℃。
在另一项实施方式中，以光学的方式实施载体上标记的读取。光学读取标记是简单的且划算的。如果标记是酶，那么酶的读物和由反应而获得的反应产物优选具有不同的光学特性。特别地，反应产物相对于底物具有不同的吸光度。然后，例如能够使用分光光度计检测反应产物。如果标记是荧光染料，那么优选可以使用荧光光度计读取该标记。
在一项特别优选的实施方式中，以位置特定(positionsspezifisch)的方式实施标记的读取。因此，在单一方法中能够平行地识别和/或定量化多种不同的靶核酸。因此，也可使用单一方法分析待研究的多种样品。
在一项优选的实施方式中，在步骤d)和/或e)之前进行载体上标记的第一次读取，和/或在步骤f)中进行载体上标记的第二次读取。对标记的第一次读取获得了参照值，而对标记的第二次读取获得测量值。优选使测量值归一化至参照值。由此，能够相互比较从不同载体获得的数据。所述参照值可以例如是固定于载体上的俘获寡核苷酸的数量的度量。如果固定于第一载体上的俘获寡核苷酸少于在第二载体上的俘获寡核苷酸，那么第一载体的参照值和测量值均较小。因此，能够对各个载体进行校准。
由测量值和参照值所形成的商数在不同载体上有不同数量的固定化的俘获寡核苷酸的情况下保持约为恒定。由此，可消除由不同载体所获得的测量值的散射。因此，对于在读取标记过程中所获得的值还实现了更好地重现性和更小的标准偏差。
此外，使得在相同载体上的各个位置的校准成为可能。
在一项特别优选的实施方式中，在相同的反应条件下进行第一次读取和第二次读取。这确保了依赖于反应条件(特别是温度)的酶活性在第一次和第二次读取的过程中是相同的。
本发明还提供了一种用于检测样品中的至少一种单链靶核酸的试剂盒，其包括至少一种表面固定有至少一种俘获寡核苷酸的固态载体、至少一种具有标记的报道基因寡核苷酸、至少一种相反链寡核苷酸，所述相反链寡核苷酸包括与所述俘获寡核苷酸至少部分互补的寡核苷酸序列、与样品中的靶核酸互补的寡核苷酸序列和与所述报道基因寡核苷酸至少部分互补的寡核苷酸序列，以使在各种情形下所述俘获寡核苷酸和所述报道基因寡核苷酸至少部分地与相反链寡核苷酸杂交，并使所述靶核酸与相反链寡核苷酸杂交，从而靶核酸的第一末端和俘获寡核苷酸的自由端与相反链寡核苷酸的邻近核苷酸形成碱基对，且靶核酸的第二末端和报道基因寡核苷酸的第一末端与相反链寡核苷酸的邻近核苷酸形成碱基对，其中所述报道基因寡核苷酸的标记表明样品中存在靶核酸。
所述样品可以是靶核酸和其它核酸和/或蛋白质的混合物。所述样品额外可以是由细胞获得的溶胞产物(Lysat)。在这种情况下，该细胞可以是人、动物、植物或细菌的细胞。在一项优选的实施方式中，所述细胞来源于取自病人的活检(Biopsie)。如果病人患有疾病或者患有靶核酸特异性地出现增多或减少的现象的疑似病症，那么所述试剂盒就可用于活检中靶核酸的诊断性检测。在一项优选的实施方式中，所述疾病为癌症，特别是乳腺癌、肺癌或白血病。在另一项实施方式中，所述疾病是由免疫系统紊乱造成的。
在一项优选的实施方式中，所述试剂盒额外地包括至少一种核酸连接酶、优选T4DNA连接酶，用于将靶核酸的第一末端连接至俘获寡核苷酸的自由端以使靶核酸与俘获寡核苷酸共价键合，同时用于将靶核酸的第二末端连接至报道基因寡核苷酸的第一末端以使靶核酸与报道基因寡核苷酸共价键合。
在一项优选的实施方式中，所述标记为酶并且所述试剂盒额外地包括专用于所述酶的至少一种底物。
在一项优选的实施方式中，所述靶核酸为RNA、优选miRNA。
附图说明
图1示出了使用本发明的方法对单链靶核酸进行识别的示意图。
图2示出了在使用序列与待识别的miR-16的序列不匹配的核酸的情况下的本发明方法的示意图。
图3示出了在使用序列与待识别的miR-16的序列只是部分匹配的核酸的情况下的本发明方法的示意图。
图4示出了本发明方法的包括校准载体的优选实施方式。
具体实施方式
参照示意性附图，下面将阐述本发明方法的优选实施方式。
图1示出了使用本发明的方法对单链靶核酸(9)进行识别的示意图。所述单链靶核酸(9)为miR-16。miR-16是在淋巴细胞中能够抑制的抗凋亡蛋白(antiapoptotischen Protein)Bcl-2表达的miRNA。使用集成有两个金电极的硅芯片作为固态载体(1)，在所述载体上通过隔片(3)固定单链的俘获寡核苷酸(5)。首先，设定42℃的第一温度，在该温度下使相反链寡核苷酸(7)、miR-16和单链的报道基因寡核苷酸(11)与载体(1)接触。所述报道基因寡核苷酸(11)具有作为标记(13)的来自酸热脂环酸芽孢杆菌的热稳定性酯酶2，其与该报道基因寡核苷酸(11)共价键合。所述相反链寡核苷酸(7)包括以彼此直接邻接的方式排列的三个寡核苷酸序列。
一个寡核苷酸序列与所述俘获寡核苷酸(5)完全互补。与其毗邻的是与所述miRNA完全互补的寡核苷酸序列。后接是与所述报道基因寡核苷酸(11)完全互补的寡核苷酸序列。将载体(1)于42℃的温度培育20分钟，从而使俘获寡核苷酸(5)、miR-16和报道基因寡核苷酸(11)与和其互补的相反链寡核苷酸(7)的各自部分完全杂交。如图1所示，寡核苷酸序列在相反链寡核苷酸(7)的排列结果为miR-16的下端和俘获寡核苷酸(5)的自由上端还有miR-16的上端和报道基因寡核苷酸(11)的下端分别与相反链寡核苷酸(7)的邻近的核苷酸杂交。在下一个步骤中，使T4DNA连接酶与载体(1)接触，所述连接酶在第一连接反应(15)中将俘获寡核苷酸(5)和the miR-16的邻近端连接在一起，并且在第二连接反应(17)中将miR-16和报道基因寡核苷酸(11)的邻近端连接在一起。因此，miR-16在下端与俘获寡核苷酸(5)共价键合，而在上端与报道基因寡核苷酸(11)共价键合。随后，将载体(1)于52℃的第二温度下培育10分钟。这解链了相反链寡核苷酸(7)与俘获寡核苷酸(5)、miRNA和报道基因寡核苷酸(11)的碱基对，从而使相反链寡核苷酸(7)脱离。用含盐的缓冲溶液于52℃下洗涤载体(1)以除去脱离的相反链寡核苷酸(7)。随后，将载体(1)设置于30℃的读取温度，在该温度下分析载体(1)上的酯酶2。以电化学的方式实施读取。为此，使载体(1)与酯酶2的底物(19)对氨基苯基丁酯接触。酯酶2将对-氨基苯基丁酯转化成氧化还原活性的反应产物(21)对氨基苯酚。由于对氨基苯酚和醌亚胺的氧化还原循环，产生在金电极处被测量的电流。电流测量起到检测载体(1)上的酯酶2并指示miR-16存在的作用。
图2和图3示出了在使用序列与待识别的miR-16的序列不匹配或只是部分匹配的核酸(23,25)(分别对应于图2和图3)的情况下的本发明方法的示意图。该核酸(23,25)作为用于验证本发明的方法的阴性对照使用。图2示出了序列与miR-16的序列不匹配的核酸(23)在42℃下的载体(1)的培育过程中没有与相反链寡核苷酸(7)杂交。因此，T4DNA连接酶不能使俘获寡核苷酸(5)和报道基因寡核苷酸(11)的末端与核酸(23)的末端连接。在52℃下的载体(1)的培育和清洗过程中，相反链寡核苷酸(7)从俘获寡核苷酸(5)和报道基因寡核苷酸(11)脱离。由于报道基因寡核苷酸(11)缺少通过靶核酸(9)和俘获寡核苷酸(5)与载体(1)的共价键合，该报道基因寡核苷酸(11)被从载体(1)上除去，从而不会有酯酶2保留在载体(1)上。因此，在读取酯酶2时，测量不到电流。
图3示出了序列部分地匹配miR-16的序列的核酸(23)在42℃下的载体(1)的培育过程中与在该匹配miRNA的序列的片段中的相反链寡核苷酸(7)杂交，但并不完全。核酸(25)的第一末端和俘获寡核苷酸(5)的自由端与相反链寡核苷酸(7)的邻近核苷酸杂交，从而在下一个步骤中，T4DNA连接酶将俘获寡核苷酸(5)和核酸(25)的邻近末端连接在一起。这使核酸(25)与俘获寡核苷酸(5)共价键合。由于缺乏互补性，核酸(25)的第二末端没有与相反链寡核苷酸(7)杂交，从而T4DNA连接酶没有将核酸(25)的第二末端与报道基因寡核苷酸(11)的第一末端相连接。在52℃下的载体(1)的培育和清洗过程中，相反链寡核苷酸(7)脱离俘获寡核苷酸(5)、核酸(25)和报道基因寡核苷酸(11)。由于报道基因寡核苷酸(11)缺少与核酸(25)的共价键合，报道基因寡核苷酸(11)也从载体(1)除去，从而不会有酯酶2保留在载体(1)上。因此，在读取酯酶2时，测量不到电流。
图4示出了本发明方法的包括校准载体(1)的优选实施方式。为此，在俘获寡核苷酸(5)、miR-16和报道基因寡核苷酸(11)的各自邻近末端的连接反应之后，设定30℃的读取温度，并首次分析载体(1)上的酯酶2。在这次分析中得到了参照值。随后，在52℃下培育载体(1)，在该温度下相反链寡核苷酸(7)与俘获寡核苷酸(5)、miR-16和报道基因寡核苷酸(11)分离。再次设定30℃的温度并第二次分析载体(1)上的酯酶2。在这次分析中获得测量值。使测量值归一化至参照值，从而从各种载体获得的数据能够相互比较。

Claims (10)

1.一种用于识别和定量化至少一种单链靶核酸(9)的方法，包括以下步骤：
a)提供至少一种固态载体(1)，在所述固体载体(1)上固定有至少一种俘获寡核苷酸(5)；
b)在第一反应条件下使所述载体(1)与至少一种相反链寡核苷酸(7)、至少一种单链靶核酸(9)和至少一种具有标记(13)的报道基因寡核苷酸(11)接触，所述相反链寡核苷酸(7)包括与所述俘获寡核苷酸(5)至少部分互补的寡核苷酸序列、与所述靶核酸(9)互补的寡核苷酸序列和与所述报道基因寡核苷酸(11)至少部分互补的寡核苷酸序列，以使所述俘获寡核苷酸(5)和所述报道基因寡核苷酸(11)各自至少部分地与所述相反链寡核苷酸(7)杂交，以及使所述靶核酸(9)与所述相反链寡核苷酸(7)杂交，从而靶核酸(9)第一末端和俘获寡核苷酸(5)的自由端与相反链寡核苷酸(7)的相邻核苷酸形成碱基对，并且靶核酸(9)的第二末端和报道基因寡核苷酸(11)的第一末端与相反链寡核苷酸(7)的相邻核苷酸形成碱基对；
c)在所述第一反应条件下培育所述载体(1)；
d)连接靶核酸(9)的第一末端和俘获寡核苷酸(5)的自由端以使靶核酸(9)和俘获寡核苷酸(5)共价键合，并且连接靶核酸(9)的第二末端和报道基因寡核苷酸(11)的第一末端以使靶核酸(9)和报道基因寡核苷酸(11)共价键合；
e)在第二反应条件下以如下方式培育载体(1)，使得仅在所述靶核酸(9)的两端被连接的情况下报道基因寡核苷酸(11)与载体(1)保持连接；
f)读取载体(1)上的报道基因寡核苷酸(11)的标记(13)。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤d)之前和/或在步骤e)中和/或在步骤f)之前还对所述载体(1)进行清洗。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于在严格的反应条件下于步骤d)之前对所述载体(1)进行清洗。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述靶核酸(9)是RNA、优选miRNA。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于使所述靶核酸(9)、俘获寡核苷酸(5)和/或报道基因寡核苷酸(11)的一末端进行磷酸化。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述标记(13)是一种优选与所述报道基因寡核苷酸(11)共价键合的酶、优选酯酶、特别是热稳定的酯酶。
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于通过电化学的方式、优选通过对氨基苯酚和醌亚胺的氧化还原循环来读取所述标记(13)。
8.前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于在步骤d)和/或e)之前对所述载体(1)上的标记(13)实施第一次读取，和/或在步骤f)中对所述载体(1)上的标记(13)实施第二次读取。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于在相同的反应条件下实施所述第一次读取和所述第二次读取。
10.一种用于检测样品中的至少一种单链靶核酸(9)的试剂盒，其包括：
至少一种固态载体(1)，在所述固态载体(1)上固定有至少一种俘获寡核苷酸(5)；
至少一种具有标记(13)的报道基因寡核苷酸(11)；
至少一种相反链寡核苷酸(7)，所述相反链寡核苷酸(7)包括与所述俘获寡核苷酸(5)至少部分互补的寡核苷酸序列、与所述样品中的靶核酸(9)互补的寡核苷酸序列和与所述报道基因寡核苷酸(11)至少部分互补的寡核苷酸序列，以使所述俘获寡核苷酸(5)和所述报道基因寡核苷酸(11)各自至少部分地与所述相反链寡核苷酸(7)杂交，并且使所述靶核酸(9)与所述相反链寡核苷酸(7)杂交，从而靶核酸(9)的第一末端和俘获寡核苷酸(5)的自由端与相反链寡核苷酸(7)的相邻核苷酸形成碱基对，并且靶核酸(9)的第二末端和报道基因寡核苷酸(11)的第一末端与相反链寡核苷酸(7)的相邻核苷酸形成碱基对，其中所述报道基因寡核苷酸(11)的标记(13)指示所述样品中靶核酸(9)的存在。
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