CN102586309A - 适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子，具体构建了同时适用于转基因大豆DP-356043、DP-305423、GTS40-3-2的品系特异性检测的通用型标准质粒分子，其包含转基因大豆DP-356043、DP-305423、GTS40-3-2的品系特异性序列和大豆内源标准基因Lectin的特异性片段，对所述的标准质粒分子在转基因大豆PCR检测中的适用性进行了验证表明，所述的标准质粒分子高度特异于上述三个转基因大豆品系的检测。

Description

适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子

技术领域

本发明涉及一种适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子，属于生物技术领域。

背景技术

基因工程技术的出现和应用为农业、医学等领域开辟了一个全新的发展时代。转基因产品越来越进入人们的生活，据国际农业生物技术应用署(ISAAA)的最新资料表明，自1996年到2010年，全球的转基因作物种植总面积增加了87倍，达到了1.48亿公顷。目前，世界各国进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、棉花、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜等，其中转基因大豆种植面积居第二位，达到了9000万英亩。随着遗传改良作物的广泛种植，转基因作物的生态风险,可能带来的环境问题、转基因产品作为食品、饲料对人类及动物的可能带来健康问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界性的广泛关注,国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良作物及其产品实施标识制度。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，并在2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标示和进口安全管理三个配套管理办法。

为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，建立高效、快速、特异的检测技术十分必要，它是各国际组织和国家管理遗传改良作物的有力技术支撑。目前已经发展并广泛应用的转基因产品检测方法有两类：一类是基于核酸水平的检测，另一类是基于蛋白质水平的免疫学检测。基于核酸的聚合酶链反应（PCR）检测技术因具有高灵敏度和特异性强的优点，已成为目前最重要、应用最广泛的遗传改良作物及其产品检测技术。目前基于核酸的检测技术中，最常用的检测方法之一是定性PCR技术。通过对样品中可能含有的外源基因进行扩增，再利用琼脂糖电泳进行鉴定，如果电泳结果含有特异的条带，说明样品中含有转基因成分；反之则没有。转基因PCR检测方法建立时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照，以确保检测过程的有效和检测结果的可靠性。阳性对照是指由阳性标准物质即特定的转基因作物中提取的DNA作为PCR反应体系的模板得到的结果。由于转基因作物存在生物安全性的问题，所以有些转基因作物的阳性样品很难获得。目前，用于转基因检测的阳性标准物质主要是用纯合的转基因植物材料配置的，位于比利时的欧盟联合研究中心下属的标准物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)专业配制和提供用于转基因定量PCR检测的阳性标准品。到目前为止在市场上销售打的遗传改良作物的标准物质仅有十几种。但这类来源于农产品的标准物质，其必须有专门的研究机构来制备，贮存和测定过程受很多因素影响，很难维持恒定的量，而且，这些标准物质的转基因含量范围一般是从0.1%到5%，而实际检测的样品中的转基因含量可能会超出这个范围。标准物质的缺乏已成为检测方法建立和应用的瓶颈，阻碍了转基因产品标识制度的顺利实施。

为了解决这个问题，国内外科研机构做了大量的研究工作。目前，以质粒作为阳性标准物质在国际转基因检测中得到了公认。质粒分子的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个标准分子可以同时包含多个外源目的基因和内标准基因，经济高效。近年来，越来越受到各国转基因检测专家和学者们的重视，并逐渐取代传统阳性标准品用于转基因品系及其加工产品的PCR检测。

目前全世界有10多个转基因大豆品系进入商品化种植，其中包括孟山都公司开发的GTS40-3-2，先锋公司开发的DP-356043和DP-305423。我国虽然不种植转基因大豆，但每年都进口几千万吨转基因大豆用于食品或饲料的加工原料。迄今为止，还没有同时适用于以上三种转基因大豆检测的标准质粒分子的报道。为了给中国转基因大豆品系监管提供必要的技术支撑，有必要开发适用于以上三种转基因大豆品系特异性检测的、稳定可靠的通用型标准质粒分子。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子；本发明的目的在于提供可同时适用于转基因大豆品系DP-356043、DP-305423、GTS40-3-2品系特异性检测的通用标准质粒分子、其构建方法及应用。

本发明所提供的标准质粒分子，其包含以下序列片段： DP-356043品系特异性片段、 DP-305423品系特异性片段、GTS40-3-2品系特异性序列和大豆内源标准基因Lectin的特异序列片段。 

所述的DP-356043的品系特异性序列，指的是转基因大豆品系DP-356043的外源插入载体与大豆基因组邻接区的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的DP-305423的品系特异性序列，指的是转基因大豆品系DP-305423的外源插入载体与大豆基因组邻接区的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的GTS40-3-2的品系特异性序列，指的是转基因大豆品系GTS40-3-2的外源插入载体与大豆基因组邻接区的DNA序列如SEQ ID NO:3所示。

所述大豆内源标准基因Lectin特异性片段，指的是大豆凝集素基因片段，其DNA序列如SEQ ID NO:4所示。

所述的标准质粒分子的骨架质粒是pMD18-T。

所述的用于转基因大豆检测的标准质粒分子，其中用于构建标准质粒分子的引物序列如下（表1）：  

表1 构建标准质粒分子的PCR引物

所述的用于转基因大豆检测的标准质粒分子的构建方法，包括以下步骤：

以转基因大豆品系DP-356043、 DP-305423、GTS40-3-2基因组DNA为模板，以上表中设计的引物进行PCR扩增；反应体系为：总体积为50μl，其中10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl,上下游引物（20μM）各1μl，模板5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 50秒， 60-55℃ 50秒,72℃ 60秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为：P_DP356043（其序列如SEQ ID No:13所示）、P_DP305423（其序列如SEQ ID No:14所示）、P_GTS40（其序列如SEQ ID No:15所示）、P_Lectin（其序列如SEQ ID No:16所示）;

利用重叠延伸PCR将P_DP356043与P_DP305423相连接,分两步进行扩增：

第一步：取P_DP356043与P_DP305423各5μl，10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟，然后进入以下循环94℃ 1分钟， 60℃ 4分钟，共7个循环；

第二步：取10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，第一步的反应产物50μl，引物DP356-F 1μl，引物DP305-R 1μl，用ddH₂O补足至100μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 55℃ 2分钟 72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为： P_{DP356043+DP305423}（其序列如SEQ ID No:17所示）。

利用重叠延伸PCR将P_{DP356043+DP305423}与P _GTS40相连接,分两步进行扩增：

第一步：取P_{DP356043+DP305423}与P _GTS40各5μl，10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟，然后进入以下循环94℃ 1分钟， 60℃ 4分钟，共7个循环；

第二步：取10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，第一步的反应产物50μl，引物DP356-F 1μl，引物GTS40-R 1μl，用ddH₂O补足至100μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 55℃ 2分钟 72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为： P_{DP356043+DP305423+GTS40}（其序列如SEQ ID No:18所示）。

将P_{DP356043+DP305423+GTS40}和P_Lectin克隆进pMD18-T载体，分两步进行：

第一步：用限制性内切酶BamH I和EcoRⅠ将P_{DP356043+DP305423+GTS40}（其序列如SEQ ID No:18所示）和pMD18-T载体分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接，获得含有P_{DP356043+DP305423+GTS40}片段的pMD18-T重组质粒；

第二步：用限制性内切酶BamH I和PstⅠ将P_Lectin片段（SEQ ID No:16）和含有P_{DP356043+DP305423+GTS40}片段的pMD18-T重组质粒分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接；获得将转基因大豆品系GTS40-3-2、DP-356043、 DP-305423品系特异性序列片段及大豆内源标准基因Lectin特异性片段融合在pMD18-T上的标准质粒分子，将其命名为pGDP（其序列如SEQ ID No:19所示）,将pGDP转化大肠杆菌JM109即可长期保存使用。

本发明提供所述的标准质粒分子的用途是作为阳性标准物质，检测转基因大豆DP-356043品系、DP-305423品系和GTS40-3-2品系。

本发明同时提供一种检测转基因大豆GDP-356043品系、DP-305423品系和GTS40-3-2品系的方法，所述的方法包括：以所述的标准质粒分子为阳性标准物质，测定待测大豆样品中相应的转基因大豆DP-356043品系和DP-305423、GTS40-3-2品系的存在与否。

若待测大豆样品中存在DP-356043的品系特异性序列，则表明该样品含有DP-356043品系。

若待测大豆样品中存在DP-305423的品系特异性序列，则表明该样品含有DP-305423品系。

若待测大豆样品中存在GTS40-3-2的品系特异性序列，则表明该样品含有GTS40-3-2品系。

具体的检测方法是，采用PCR的方法扩增待测大豆或其来源样品中DP-305423品系特异性序列，DP-356043品系特异性序列和GTS40-3-2特异性序列，以及大豆内源标准基因Lectin特异片段；将获得的扩增结果与同样扩增条件下扩增的标准质粒分子的扩增结果进行比较，从而获得待测大豆及其来源样品中转基因大豆品系的存在与否。

附图说明

图1、标准质粒分子pGDP的结构示意图。图中“EcoR I”表示该位点含有限制性内切酶EcoR I的酶切位点；“BamH I”表示该位点含有限制性内切酶BamHⅠ的酶切位点；“Pst I”表示该位点含有限制性内切酶Pst I的酶切位点，“Lectin”表示大豆内源标准基因Lectin特异性片段；“DP-356043”表示转基因大豆DP-356043的品系特异性序列；“DP-305423”表示转基因大豆DP-305423的品系特异性序列；“GTS40-3-2”表示转基因大豆GTS40-3-2的品系特异性序列。

图2、标准质粒分子PCR特异性检测。（A）以标准质粒分子pGDP为模板的扩增。（B）分别以转基因大豆DP-356043、 DP-305423、GTS40-3-2品系，转基因玉米Mon810品系和转基因棉花Mon513品系基因组DNA为模板的扩增。M：DNA分子量标记；泳道1：空白对照；泳道2：大豆内源标准基因Lectin片段；泳道3-4：转基因大豆DP-356043、DP-305423、GTS40-3-2品系特异性序列扩增；泳道6-7：转基因玉米Mon810和转基因棉花Mon513品系特异性序列扩增。

图3、标准质粒分子PCR检测灵敏度测试。(A)内源标准基因Lectin片段；（B）转基因大豆DP-356043品系特异性片段; （C）转基因大豆GTS40-3-2品系特异性片段；(D) 转基因大豆DP-305423品系特异性片段。M: DNA分子量标记；泳道1：空白对照；泳道2-7：分别为10000、1000、100、50、10和5拷贝标准分子的扩增。

具体实施方式

下面以实施例为例对本发明作详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实验材料：转基因大豆GTS40-3-2、DP-356043、 DP-305423品系、转基因玉米Mon810品系，转基因棉花Mon531均为商品化的品系，且有文献公开。非转基因大豆品种为常规品种“鲁豆11”。

转基因大豆GTS40-3-2、DP-356043、 DP-305423品系基因组DNA提取：

a、取适量转基因大豆样品，加入研钵中，在液氮存在下研磨成粉末，称取约200mg磨碎的样品转入2ml离心管中；

b、加入1mL 65℃预热的提取液（20mM EDTA,2% CTAB, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 1.4mol/L NaCl, 1% PVP），轻轻混匀后，65℃水浴保温30min，期间间或振荡混匀；

c、在管中加入等体积酚/氯仿溶液(24:1)，上下颠倒充分混匀，常温静置抽提10min；

d、12000rpm离心10min，吸取上清液到一新离心管中；

e、加入两倍上清液体积的-20℃预冷的乙醇，混匀，-20℃放置30分钟后，12000rpm离心10分钟，去上清液，保留沉淀；

f、用500μl 70%的乙醇溶液清洗沉淀两次；沉淀于室温下晾干，后溶于100μl 无菌ddH₂O，-20℃保存备用。

 

实施例1、标准质粒分子的构建

1、根据GenBank以及其他文献公布的信息，设计构建标准质粒分子所需的引物如表1所示。

2、以上述提取的转基因大豆品系DP-356043、 DP-305423、GTS40-3-2基因组DNA为模板，以上表中设计的引物进行PCR扩增；反应体系为：总体积为50μl，其中10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl,上下游引物（20μM）各1μl，模板5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 50秒， 60-55℃ 50秒,72℃ 60秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为：P_DP356043（其序列如SEQ ID No:13所示）、P_DP305423（其序列如SEQ ID No:14所示）、P_GTS40（其序列如SEQ ID No:15所示）、P_Lectin（其序列如SEQ ID No:16所示）;

3、利用重叠延伸PCR将P_DP356043与P_DP305423相连接,分两步进行扩增：

第一步：取P_DP356043与P_DP305423各5μl，10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟，然后进入以下循环94℃ 1分钟， 60℃ 4分钟，共7个循环；

第二步：取10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，第一步的反应产物50μl，引物DP356-F 1μl，引物DP305-R 1μl，用ddH₂O补足至100μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 55℃ 2分钟 72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为： P_{DP356043+DP305423}（其序列如SEQ ID No:17所示）。

4、利用重叠延伸PCR将P_{DP356043+DP305423}与P _GTS40相连接,分两步进行扩增：

第一步：取P_{DP356043+DP305423}与P _GTS40各5μl，10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟，然后进入以下循环94℃ 1分钟， 60℃ 4分钟，共7个循环；

第二步：取10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，第一步的反应产物50μl，引物DP356-F 1μl，引物GTS40-R 1μl，用ddH₂O补足至100μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 55℃ 2分钟 72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为： P_{DP356043+DP305423+GTS40}（其序列如SEQ ID No:18所示）。

5、将P_{DP356043+DP305423+GTS40}和P_Lectin克隆进pMD18-T载体，分两步进行：

第一步：用限制性内切酶BamH I和EcoRⅠ将P_{DP356043+DP305423+GTS40}（其序列如SEQ ID No:18所示）和pMD18-T载体分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接，获得含有P_{DP356043+DP305423+GTS40}片段的pMD18-T重组质粒；

第二步：用限制性内切酶BamH I和PstⅠ将P_Lectin片段（SEQ ID No:16）和含有P_{DP356043+DP305423+GTS40}片段的pMD18-T重组质粒分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接；获得将转基因大豆品系GTS40-3-2、DP-356043、 DP-305423品系特异性序列片段及大豆内源标准基因Lectin特异性片段融合在pMD18-T上的标准质粒分子，将其命名为pGDP（其序列如SEQ ID No:19所示）,将pGDP按常规方法转化大肠杆菌JM109即可长期保存使用。

6、标准质粒分子的提取

采用Biomiga质粒DNA小量提取试剂盒,具体步骤如下：

a、配置适于大肠杆菌生长的LB液体培养液；向灭菌的5ml LB培养液中加入氨苄青霉素使其终浓度达到50μg/ml,然后加入50μl含有标准质粒分子pGDP的大肠杆菌JM109；37℃过夜振荡培养。取1-2ml过夜培养物于6000rpm离心1分钟，彻底弃上清液；

b、加入250μl含有RNase A的Buffer A1溶液，将菌体重新充分悬浮细胞，；

c、加入250μl Buffer B1，轻轻地反转10次以混合混匀，然后静止5min至溶液粘稠而澄清；

d、加入350μl Buffer N1，立即上下颠倒数次，使之充分混匀；

e、室温13000rpm离心10分钟, 将上清转移到套放于2ml收集管内的DNA吸附柱中，于室温13000rpm离心１min； 

f、取出DNA吸附柱，倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500μl Buffer KB, ，于室温13000rpm离心１min；倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中；

g、向DNA吸附柱中加入500μl DNA Wash Buffer，室温13000rpm离心１min；倒掉收集管中废液，将DNA吸附柱重新放回收集管中;

h、打开管盖室温放置5分钟使残余的乙醇挥发，后在DNA吸附柱膜中央加入50μl Elution Buffer，室温放置2分钟； 

i、将DNA吸附柱放入干净1.5ml离心管中，；

k、于室温13000rpm离心1分钟洗脱膜上的DNA。

l、将提取的质粒DNA -20℃保存备用。

 

实施例2、标准质粒分子用于PCR检测的适用性鉴定

1、特异性测试

标准质粒分子pGDP中包含4个片段，分别是转基因大豆DP-356043品系特异性片段、转基因大豆DP-305423品系特异性片段、 转基因大豆GTS40-3-2品系特异性片段和大豆内源标准基因Lectin特异性片段，因此标准质粒分子应特异于上述4个片段的检测。

以表2所列的引物序列为引物分别以标准质粒分子pGDP、转基因作物DNA（转基因大豆DP-356043、P-305423、GTS40-3-2品系，转基因玉米Mon810品系，转基因棉花Mon531）和非转基因大豆DNA（ 鲁豆11）为模板分别扩增转基因内源标准基因Lectin特异片段（393bp，SEQ ID NO:4）、转基因大豆DP-356043品系特异性片段（413bp，SEQ ID NO:1）、转基因大豆DP-305423品系特异性片段(273bp，SEQ ID NO:2)、转基因大豆GTS40-3-2品系特异性片段(363bp，SEQ ID NO:3)、转基因玉米Mon810品系特异性片段(190bp，SEQ ID NO:20)、转基因棉花Mom531品系特异性片段(335bp，SEQ ID NO:21)。

表2、转基因大豆检测用引物序列

反应体系为：总体积为50μl，其中10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl,上下游引物（20μM）各1μl，模板5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 50秒， 60-55℃ 50秒,72℃ 60秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟。

PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，100V电压，电泳30分钟左右。采用凝胶成像系统拍摄电泳图。

结果如图2所示，以标准质粒分子pGDP DNA为模板的扩增中，可在内源标准基因Lectin、转基因大豆DP-356043、转基因大豆DP-305423、转基因大豆GTS40-3-2品系特异性序列扩增中得到明显的目的条带（图2中A）,以转基因玉米Mon810和转基因棉花Mom531的品系特异性检测引物进行扩增时无可见条带产生；而各检测体系对应的阳性对照均有目的条带产生（图2中B）；非转基因大豆能在内源标准基因Lectin检测引物进行扩增时有明显可见的条带产生（图2中C）。

因此本发明构建的标准质粒分子pGDP特异于转基因大豆DP-356043、DP-305423、GTS40-3-2品系的品系特异性检测。

 

2、检测灵敏度测试

为了鉴定标准质粒分子pGDP用于PCR检测的灵敏度，将标准质粒分子pGDP稀释至10000、1000、100、50、10和5拷贝/μl,分别扩增大豆内源标准基因Lectin特异性片段（393bp）,转基因大豆DP-356043品系特异性片段（413bp）、转基因大豆GTS40-3-2品系特异性片段(363bp) 、 转基因大豆DP-305423品系特异性片段(273bp),确定以标准质粒分子为标准品在PCR检测中的LOD值。

反应体系为：总体积为50μl，其中10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl,上下游引物（20μM）各1μl，模板5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 50秒， 60-55℃ 50秒,72℃ 60秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟。

PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，100V电压，电泳30分钟左右。采用凝胶成像系统拍摄电泳图。

实验结果如图3所示，可扩增目标片段Lectin、转基因大豆DP-356043品系特异性片段的最低标准质粒分子pGDP的拷贝数为10拷贝；可扩增目标片段转基因大豆GTS40-3-2品系特异性片段、转基因大豆DP-305423品系特异性片段的最低标准质粒分子pGDP的拷贝数为50拷贝。因此标准质粒分子pGDP作为标准品在PCR检测中的对目标片段Lectin、转基因大豆DP-356043品系特异性片段的LOD值为10拷贝，对目标片段转基因大豆GTS40-3-2品系特异性片段、转基因大豆DP-305423品系特异性片段的LOD值为50拷贝。

综上所述，利用本发明构建的标准质粒分子pGDP可很好的替代植物来源的阳性标准品用于转基因大豆DP-356043，DP-305423和GTS40-3-2及其来源产品的品系特异性检测。

Claims (4)

1.一种适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子，其特征在于其序列如SEQ ID No:19所示。

2.如权利要求1所述的一种适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子的的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

以转基因大豆品系DP-356043、 DP-305423、GTS40-3-2基因组DNA为模板进行PCR扩增；反应体系为：总体积为50μl，其中10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl,上下游引物20μM各1μl，模板5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 50秒， 60-55℃ 50秒,72℃ 60秒，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为：P_DP356043 SEQ ID No:13、P_DP305423 SEQ ID No:14、P_GTS40 SEQ ID No:15、P_Lectin SEQ ID No:16;

利用重叠延伸PCR将P_DP356043与P_DP305423相连接,分两步进行扩增：

第一步：取P_DP356043与P_DP305423各5μl，10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟，然后进入以下循环94℃ 1分钟， 60℃ 4分钟，共7个循环；

第二步：取10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，第一步的反应产物50μl，引物DP356-F 1μl，引物DP305-R 1μl，用ddH₂O补足至100μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 55℃ 2分钟 72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为： P_{DP356043+DP305423}  SEQ ID No:17 ；

利用重叠延伸PCR将P_{DP356043+DP305423}与P _GTS40相连接,分两步进行扩增：

第一步：取P_{DP356043+DP305423}与P _GTS40各5μl，10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用ddH₂O补足至50μl；

反应程序为：94℃ 5分钟，然后进入以下循环94℃ 1分钟， 60℃ 4分钟，共7个循环；

第二步：取10倍的PCR反应液5μl，dNTPs 4μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，第一步的反应产物50μl，引物DP356-F 1μl，引物GTS40-R 1μl，用ddH₂O补足至100μl；

反应程序为：94℃ 5分钟；然后进入以下循环94℃ 1分钟， 55℃ 2分钟 72℃ 2分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；产物记为： P_{DP356043+DP305423+GTS40} SEQ ID No:18；

将P_{DP356043+DP305423+GTS40}和P_Lectin克隆进pMD18-T载体，分两步进行：

第一步：用限制性内切酶BamH I和EcoRⅠ将P_{DP356043+DP305423+GTS40} SEQ ID No:18和pMD18-T载体分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接，获得含有P_{DP356043+DP305423+GTS40}片段的pMD18-T重组质粒；

第二步：用限制性内切酶BamH I和PstⅠ将P_Lectin片段SEQ ID No:16和含有P_{DP356043+DP305423+GTS40}片段的pMD18-T重组质粒分别进行双酶切；然后用T₄连接酶将二者连接；获得将转基因大豆品系GTS40-3-2、DP-356043、 DP-305423品系特异性序列片段及大豆内源标准基因Lectin特异性片段融合在pMD18-T上的标准质粒分子，将其命名为pGDP，其序列如SEQ ID No:19所示, 将pGDP转化大肠杆菌JM109即可长期保存使用。

3.如权利要求2所述的一种适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子的构建方法，其特征在于所述的引物序列如下：  

DP356-F：CGGGATCCAACGGATTTGGACCATTGCGTC  SEQ ID NO:5

DP356-R：GTAATTGTTAATGCTTCGGAAG                     SEQ ID NO:6

DP305-F：CGAAGCATTAACAATTACACATAATTTTGAAAGATGATTAATG  SEQ ID NO:7

DP305-R：CAATAAGTTATTTCTAGTACAAAGCTTATATATGCCTTCCG       SEQ ID NO:8

GTS40-F：TACTAGAAATAACTTATTGCATTTCATTC          SEQ ID NO:9

GTS40-R：CGGAATTCCTGCTAGAGTCAGCTTGTCAG        SEQ ID NO:10

LN-F：AACTGCAGAAGGCAAACTCAGCGGAAAC             SEQ ID NO:11

LN-R：CGGGATCC AGTGTCAAACTCAACAGCGAC           SEQ ID NO:12。

4.如权利要求1所述的一种适用于三个转基因大豆品系特异性检测的标准质粒分子在检测转基因大豆DP-356043品系、DP-305423品系和GTS40-3-2品系中作为阳性标准物质的应用。

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