CN116790787A - 一种转基因大豆的lamp扩增和可视化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物学，涉及一种转基因大豆ZH10‑6的品系基因检测，公开了一种等温扩增技术(LAMP)高效检测转基因大豆的检测方法。本发明包括LAMP引物设计、植物基因组核酸制备、LAMP扩增特异性、灵敏性检测及可视化检测。本发明建立的方法具有快速、高效、灵敏、准确等优点，在转基因作物检测工作中有实际应用价值，在转基因生物安全评价及现场即时检测方面有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及植物转基因检测领域，具体涉及一种环介导等温扩增检测方法。
背景技术
随着转基因技术的不断发展，转基因技术在农业发展方面的贡献不断增加。大规模商业化种植种植转基因作物自1996年以来已有20多年的时间，种植面积已经累计达到27亿hm2[1]。大豆(Glycine max L.)是我国重要的粮食油料作物，榨油的豆粕也是重要的动物饲料来源。我国是大豆消费大国，但种植的大豆总产量远远不能满足国内需求，主要依赖于进口。转基因产品的研究与产业化是农业科学技术高速发展的重要组成部分，转基因作物及其衍生食品的安全问题受到人们的关注，在建立农业转基因生物安全标准体系及管理制度的同时，建立快速、精准的转基因成分定量检测方法至关重要[2]。
转基因大豆ZH10-6是中国农业科学院作物科学研究所培育的含有G2-epsps和GAT耐除草剂转基因大豆新品系。采用农杆菌介导转化法，将整合有G2-epsps和GAT两个基因的独立表达载体DNA导入大豆受体中，通过多代筛选获得对草甘膦具有抗性的ZH10-6转化体。
根据检测原理的不同，目前常用的转基因植物检测技术主要有两大类：一类为蛋白水平的检测方法，如免疫试纸条法、蛋白质芯片和酶联免疫吸附法等；另一类为核酸水平上的鉴定方法，如PCR以及PCR相关的检测技术，还有核酸杂交和基因芯片等方法[3]。蛋白质水平的检测是基于所转的目的基因在转基因植株中得到了表达，通过检测这些蛋白的存在来确定转基因。由于只适用于新鲜的和未加工过的转基因材料，并且当转入的基因表达量低时也无法检测，因此并未得到广泛采用。核酸水平上的检测方法主要是基于PCR反应，但这些检测方法都需要热循环PCR仪，实验程序复杂并且检测时间较长，难以满足非实验室条件下的快速筛查和检测的需求。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术不需要PCR仪器提供变温过程，能在恒温65℃下完成整个反应因此该技术扩增过程可以用水浴锅或保温设备代替PCR仪器完成，从而借助便携式的保温设备，在基层实验室、转基因检测机构或现场抽查中开展LAMP快速检测[4]-[7]。
因此，在本发明中，我们开发了一种LAMP检测引物，用于转基因大豆可视化检测。该方法可在1小时内完成，有利于现场即时检测的开展。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了一种用于高度特异性大豆转基因的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种转基因玉米的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)设计合成引物；所述引物由上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3，上游环引物LF组成，所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～5；
b)制备3种不同的转基因大豆(GTS40-3-2、ZH10-6、)的基因组核酸；
c)配制LAMP反应体系并设定反应条件；
d)进行LAMP方法特异性检测；
e)进行LAMP方法可视化检测。
优选地，步骤a)中，所述合成的引物浓度均为10μmol/L。
优选地，步骤b)中，所述DNA稀释液的浓度为10ng/μL。
优选地，步骤c)中，所述LAMP反应体系的配置方法为：将2μL的DNA稀释液加入到23μL反应体系中；
所述23μL的反应体系包括以下体积含量的各组分：
LAMP反应条件为：65℃扩增反应30min。
优选地，步骤d)中，阳性样品为1种转基因大豆ZH10-6，阴性样品设置为GTS40-3-2、
优选地，步骤e)中，LAMP扩增的产物进行SYBR GreenⅠ可视化分析，可视化体系：2μL 1000×SYBR GreenⅠ加入到25μL LAMP反应后的液体中。
优选地，步骤d)中的扩增结果由实时荧光曲线判读，阳性样品出现扩增曲线，阴性样品及对照无荧光曲线。
优选地，步骤e)中的扩增结果由裸眼直接判读，结果读出：有LAMP扩增产物显示绿色，则为阳性，无LAMP扩增产物显示为橙色。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明相比传统的qPCR技术具有灵敏度高，特异性强，精确度好，特别在对低拷贝数和痕量样本具有重要意义。
2、本发明中所述的引物设计为特异性引物，来自转基因大豆ZH10-6的特异性序列，能够特异的检测转基因大豆品系。
3、本发明中LAMP引物通过网站设计(https://primerexplorer.jp/e/)，挑选含有LF，LB的最佳引物组合，用于本实验的扩增检测。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施实例1中的ZH10-6 LAMP扩增特异性荧光曲线图；
图2为实施实例1中的ZH10-6 LAMP扩增可视化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施实例中，具体实验条件按照本领域内参考文献或者试剂盒使用说明书进行，所用仪器和耗材，若无特别说明生产厂家者，可根据自身实验室条件按市售渠道获得。
本发明结合环介导等温扩增，实现了转基因大豆的特异性检测。
实施实例1：转基因大豆ZH10-6特异性检测
本实施例1采用的实验试剂和仪器如下：
仪器：Pangaea 6(Apexbio)。
耗材：QIAGEN plant DNA Mini Kit(#69104)，DEPC处理水，bst聚合酶2.0(瀚海新酶)、Loop-mediated isothermal amplification buffer(瀚海新酶)，25×dye(瀚海新酶)，SYBR GreenⅠ。
1、转基因大豆ZH10-6基因组核酸提取
对转基因大豆ZH10-6(100％)种子粉末基因组进行核酸提取，DNA提取方法参考QIAGEN plant DNA Mini Kit(#69104)试剂盒。
2、引物设计与合成。
合成具有以下核苷酸序列的引物，本实施例引物及荧光探针的浓度都为10μM，针对特异性位点设计LAMP扩增引物。LAMP引物设计参考https://primerexplorer.jp/e/网站设计。
3、GTS40-3-2基因LAMP扩增
配制反应体系：即将2μL的DNA稀释液加入到23μL反应体系中，所述23μL的反应体系包括以下组分：
反应体系中Bst聚合酶2.0、Loop-mediated isothermal amplification buffer、25×dye均购自武汉瀚海新酶生物科技有限公司。
LAMP反应条件：65℃扩增反应30min。本实施例中采用的是Pangaea 6实时荧光定量PCR仪(艾普拜生物科技(苏州)有限公司)。
4、ZH10-6 LAMP扩增特异性检测结果分析
根据上述反应体系，分别采用GTS40-3-2、ZH10-6、为模板，以ZH10-6引物进行LAMP扩增，结果如图1所示。
5、ZH10-6 LAMP扩增的可视化检测结果分析
分别对实施实例1中的LAMP扩增的产物进行SYBR GreenⅠ可视化分析，可视化体系：2μL 1000×SYBR GreenⅠ加入到25μL LAMP反应后的液体中，结果读出：有LAMP扩增产物显示绿色，则为阳性，无LAMP扩增产物显示为橙色。结果如图2所示，表明可视化的结果与上述荧光曲线一致，表明ZH10-6引物可以用于ZH10-6的特异性检测。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种转基因大豆的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)设计合成引物；所述引物由上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3，上游环引物LF组成，所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～5；
b)制备3种不同的转基因大豆(GTS40-3-2、ZH10-6、)的基因组核酸；
c)配制LAMP反应体系并设定反应条件；
d)进行LAMP方法特异性检测；
e)进行LAMP方法可视化检测。
2.根据权利要求1所述的转基因大豆成分的LAMP检测方法，其特征在于，步骤b)中，所述DNA稀释液的浓度为10ng/μL。
3.根据权利要求1所述的转基因大豆成分的LAMP检测方法，其特征在于，步骤c)中，所述LAMP反应体系的配置方法为：将2μL的DNA稀释液加入到23μL反应体系中；
所述23μL的反应体系包括以下体积含量的各组分：
LAMP反应条件为：65℃扩增反应30min。
4.根据权利要求1所述的转基因大豆成分LAMP特异性检测方法，其特征在于，步骤d)中，阳性样品为转基因大豆ZH10-6，阴性样品设置为转基因大豆GTS40-3-2、设置ddH2O为空白对照。
5.根据权利要求1所述的转基因玉米成分LAMP扩增可视化检测方法，其特征在于，步骤e)中，LAMP扩增的产物进行SYBR Green I可视化分析，可视化体系：2μL1000×SYBR GreenI加入到25μL LAMP反应体系中。
6.根据权利要求1所述的转基因大豆成分LAMP扩增特异性检测方法，其特征在于，对步骤d)中的扩增结果由实时荧光曲线判读，阳性样品出现扩增曲线，阴性样品及对照无扩增曲线。
7.根据权利要求1所述的转基因大豆成分LAMP扩增可视化检测方法，其特征在于，对步骤e)中的扩增结果由裸眼直接判读，阳性样品呈现绿色，阴性样品呈现橙色。
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