CN112680508A - 外泌体中SEPT9 mRNA在诊断乳腺癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学诊断领域,具体而言,涉及一种外泌体中SEPT9mRNA在诊断乳腺癌中的应用。利用本发明可以对疑似病灶患者进行筛查鉴别,可以解决影像学无法确认的早期乳腺恶性结节,并且本发明首次发现上述外泌体SEPT9mRNA标志物可用于人体外泌体乳腺结节的良恶性鉴别。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学诊断领域,具体而言,涉及一种外泌体中SEPT9 mRNA在乳腺结节良恶性鉴别、乳腺癌辅助诊断和病程监控中的应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率位居女性恶性肿瘤的首位,已成为威胁妇女健康的主要病因。它的发病常与遗传有关,以及40-60岁之间,绝经期前后的妇女发病率较高。它是一种通常发生在乳房腺上皮组织,严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌男性罕见,仅约1-2%的乳腺患者是男性。
近年来我国乳腺癌的发病率呈迅速上升趋势,由于乳腺癌病因尚不明确,早期诊断和早期综合治疗是防治乳腺癌的最有效的手段。有研究表明,其原发灶越小,预后越好。T4、T3、T2、T1期乳腺癌的10年生存率分别为19.7%,46.0%,62.6%,87.8%。直径小于1cm的微小癌,其10年总体生存率在90%-99%。
目前,我国对乳腺癌的预警和早期诊断的技术主要有以下四种:
1.临床体格检查:定期接受临床体格检查是早期发现乳腺癌的有效方法之一。我国也开展了一系列乳腺癌的预防工作,但是,乳腺癌普查耗资巨大,成本/效果比高。
2.影像学诊断法:影像学检查是以钼靶X线摄片为主要手段,辅以超声扫描和MRI扫描。钼靶X线摄片方法能发现细小钙化点,但对于不典型的病变,尤其是致密型乳腺内的病变及近胸壁的病变易漏诊。2014年2月11日发表在著名的《英国医学杂志》上一项研究报告40~59岁女性的每年乳腺钼靶X线检查并不能降低乳腺癌的死亡率,也不优于普通体检的诊断率,而且有22%的女性因为乳腺钼靶X线检查被过度诊断了(BritishMedicalJournal,2014,348.)。另外,我国女性乳腺小而致密,这也会降低患者接受钼靶检查的阳性率。
3.生物靶标早期检测:包括乳腺癌相关基因普查,例如BRCA1和BRCA2的突变分析,但目前分子诊断研究大多关注基因多态性与乳腺癌的关系,只能给出患者的易感风险,不适用于临床疾病的诊断。另外临床上最常用的乳腺癌血清肿瘤标志物有CA-153、CEA、CA-125等,虽然可以一定程度上反应疾病的状态,但是特异性并不高,在很多其他肿瘤,如卵巢癌、盆腔肿瘤、胃癌、结肠癌、肝癌等都会相应存在。据报道CA-153的敏感性仅仅为50%左右,在早期乳腺癌患者中的表达水平往往较低,而且特异性也不高,对于乳腺癌的早期筛查方面有一定的局限性。
4.穿刺活检:乳腺组织穿刺活检的病理学检查准确性较高,但为有创性操作,还会因标本取材不足而产生假阴性结果,亦或因取材部位的不同、乳腺癌瘤内异质性的影响而产生不同的结果。
总的来说:对于乳腺结节得筛查有着以下不足:(1)临床体检耗资大;(2)影像学诊断法阳性漏检率高;(3)目前现在的较为成熟的生物靶标,只能做风险评估,不适于临床诊断;(4)穿刺活检首先是有创性,另外对于取样者及穿刺部位要求较高,容易因外在因素的影响造成不同的结果。因此,本领域迫切需要建立新的乳腺结节检查技术,能够早期客观、灵敏和稳定的诊断乳腺癌,以便进行及时、有针对性的治疗,提高患者的生存质量和生存率,降低医疗成本,节约社会资源。
发明内容
外泌体一般认为是一类直径30-150nm,具有完整膜结构的细胞外囊泡,主要负责细胞间的物质运输和信息传递,其中包裹有细胞特异性的蛋白质、脂类和核酸。现有的研究表明外泌体在很多生理病理过程中扮演重要的角色,如抗原呈递、肿瘤生长和转移等。所有的细胞都会分泌外泌体,且肿瘤分泌的外泌体多于正常细胞数量更多的外泌体。
现在,外泌体与癌症的相关性研究报道,大多都基于外泌体MicroRNA和LncRNA的研究,也有部分文献报道了外泌体蛋白与卵巢癌、前列腺癌的相关性[1-2]。关于外泌体mRNA的研究报道较少,其中有代表性的是Exosome Diagnostics公司,研究基于尿液外泌体mRNA对前列腺癌的研究[3]。暂时还没有外泌体mRNA与乳腺癌相关性的研究。
人类SEPT9基因是septin基因家族成员之一,该基因家族编码胞质GTP结合蛋白,可形成丝状复合体,参与多种细胞生理过程,包括:分裂、囊泡运输、细胞凋亡和细胞极性维持等[4]。现在关于SEPT9基因与癌症的研究,主要是该基因甲基化与结直肠癌的相关性研究,且SEPT9基因甲基化检测用于结直肠癌辅助诊断的试剂盒已在美国和中国获批。
关于SEPT9基因mRNA与癌症的研究相对较少,该基因有多种转录本。不同转录本在癌症中的表达趋势不一致,如:James[5]研究发现,在卵巢癌中SEPT9的Zeta转录本表达量上调而beta转录本丢失;P.Verdier[6]研究发现SEPT9_V2亚型在乳腺癌组织中表达量降低;Maria E[7]研究中SEPT9_V1在乳腺癌细胞系中表达量上升。Michael Scott[8]考察了不同癌症的细胞系和组织样本中的SEPT9总mRNA的表达水平,发现SEPT9的mRNA和蛋白在包括乳腺癌,子宫内膜癌,肺癌、肾癌,肝癌等多种癌症中呈现高表达。
本发明研究了外泌体的SEPT9 mRNA表达水平,同时研究了其总型和V1、V2两种亚型。在外泌体中两种亚型的表达量较低,样本中检出率低,检测效果无检测意义。总型检测具有诊断学意义。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
外泌体中SEPT9 mRNA的检测剂在制备乳腺癌诊断、辅助诊断、病程监控、预后评估试剂或试剂盒中的应用,其中降低的SEPT9 mRNA表达量是乳腺癌病情加重的指征;
所述SEPT9 mRNA为总mRNA,其为待检测外泌体中SEPT9不同转录本mRNA的总和。
根据本发明的再一方面,还涉及一种乳腺癌诊断试剂盒,其含有如上所定义的检测剂。
本发明的有益效果为:
1.本发明可以仅仅利用5ml血液就能完成多种乳腺结节良恶性的鉴别,该检测方法特异性好、敏感度高、高效实用,无创,易于医疗机构的临床推广,可以避免过度组织活检。
2.利用本发明可以对疑似病灶患者进行筛查鉴别,可以解决影像学无法确认的早期乳腺恶性结节。
3.首次发现上述外泌体SEPT9 mRNA标志物可用于人体乳腺结节的良恶性鉴别。
参考文献:
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[7]Maria E.High SEPT9_v1 Expression in Human Breast Cancer Cells IsAssociated with Oncogenic Phenotypes.Cancer Res 2007;67:(18).
[8]Michael Scott.Multimodality expression profiling shows SEPT9 to beoverexpressed in a wide range of human tumours.Oncogene(2005)24,4688–4700
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中血浆外泌体NTA结果图;
图2为本发明一个实施例中术前术后靶标表达水平变化图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
外泌体中SEPT9 mRNA的检测剂在制备乳腺癌诊断、辅助诊断、病程监控、预后评估试剂或试剂盒中的应用,其中降低的SEPT9 mRNA表达量是乳腺癌病情加重的指征;
所述SEPT9 mRNA为总mRNA,其为待检测外泌体中SEPT9不同转录本mRNA的总和。
本发明发现了乳腺癌诊断的一种新的标志物,外泌体中SEPT9 mRNA。
任何包含外泌体的样本都可作为本申请的检测样本,示例性的样本可以为细胞培养物上清液、血液样本(全血、血清、血浆)、乳汁、乳头吸出物、乳头溢出液、组织液、淋巴液,或者从生物组织样品得到的澄清的裂解液。
生物组织样本优选乳腺组织,例如癌组织或癌旁组织。血液样本优选为外周血样本。
含有外泌体的样本可预先进行富集,富集方式可通过密度梯度离心、超速离心、超滤、聚乙二醇沉淀中的任一种方法进行。
在本发明中,检测剂可以是定性或者定量的检测剂。
利用本技术方案可以对疑似病灶患者进行筛查鉴别,可以解决影像学无法确认的早期乳腺恶性结节。本文使用的术语“标志物”或“生化标志物”指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。如本领域技术人员显而易见的,mRNA的检测不应当解释为限于上述基因直接转录得到的特定mRNA序列,例如,作为替代性的mRNA变体、短链或前-mRNA处理的结果。变体的核苷酸序列与对应的标志物序列具有95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性;短链则只要能代表全长mRNA本身的特异性序列都可胜任。显然地,mRNA水平的检测也可通过检测cDNA以进行。
在本发明中,SEPT9“总mRNA”或“总型”或“total mRNA”意味着检测对象为待检测外泌体中SEPT9不同转录本mRNA的总和。
SEPT9不同转录本mRNA为本领域技术人员所公知,例如NCBI上记录的11个不同的转录本,转录本号分别为:NM_006640.5、NM_001113491.2、NM_001113492.2、NM_001113493、NM_001113494.1、NM_001113495.2、NM_001113496.2、NM_001293695.2、NM_001293696.2、NM_001293697.2、NM_001293698.2。
检测SEPT9 total mRNA的常规方法显然通常有2种:
(1)检测所有转录本共有的mRNA序列;
(2)分别检测上述转录本各自的表达量,然后加和。
诊断可以为辅助诊断。本发明中,术语“预后”具有本领域技术人员知悉的含义。在本发明的一个实施方案中,预后是指生存概率(PFS)。其中,如果对象是一个群体(2个或2个以上患者),预后可以是指中位生存概率或平均生存概率。
在一些实施方式中,通过检测SEPT9不同转录本mRNA的共有序列检测所述SEPT9mRNA。
在一些实施方式中,所述检测剂用于执行如下方法中的至少一种:
PCR法、一代测序、二代测序、核酸芯片、电泳、HPLC、共振光散射法和生物质谱法。
在一些实施方式中,所述PCR法为实时荧光定量PCR和/或数字PCR。
本领域技术人员可通过BLAST等常规技术手段获得共有序列,以上述11个转录本为例,通过分析容易获知共有转录本可以检测的外显子有9个,本领域技术人员可以采用跨不同外显子的检测区段设计检测引物、探针用于检测。也可以在任意外显子上单独设计检测引物、探针用于检测。
作为示例,在一些实施方式中,所述检测剂选自a~f中至少一种引物对:
a:SEQ ID NO:1和2;
b:SEQ ID NO:3和4;
c:SEQ ID NO:5和6;
d:SEQ ID NO:7和8;
e:SEQ ID NO:9和10;
f:SEQ ID NO:11和12。
在一些实施方式中,所述检测剂还含有外泌体提取试剂、逆转录酶、随机引物、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料、内参引物以及水中的一种或多种。
外泌体提取试剂可用于执行如下任一种方法:密度梯度离心、超速离心、超滤、聚乙二醇沉淀。
在一些实施方式中,所述双链特异性荧光染料定量选自溴化乙锭、SYBR Green、PicoGreen、RiboGreen中的任一种。
在一些实施方式中,所述水通常为核酸和/或无核酸酶的水。水可以为蒸馏水(Distilled Water)、去离子水(Deionized Water)或反渗水(Reverse osmosis Water)。
在一些实施方式中,所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
内参引物即为用于检测参考标准品的引物,还可以理解为进一步包括mRNA测量标准化所需的样本和/或试剂。例如,RNA测量可通过一种或多种“管家”mRNA作为标准化的基准,这对于本领域技术人员是熟悉的。
在一些实施方式中,该“管家”mRNA为泛素mRNA。
在一些实施方式中,所述内参引物选自g~k中至少一种引物对:
g:SEQ ID NO:13和14;
h:SEQ ID NO:15和16;
i:SEQ ID NO:17和18;
j:SEQ ID NO:19和20;
k:SEQ ID NO:21和22。
在一些实施方式中,所述检测剂还包括探针。
在一些实施方式中,所述探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:23~28中的至少一种所示的探针,且SEQ ID NO:23~28与a~f中的引物对依次对应、配合使用。
在一些实施方式中,所述探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:29~33中的至少一种所示的探针,且SEQ ID NO:29~33与g~k中的引物对依次对应、配合使用。
在一些实施方式中,所述探针带有可检测的标记。
如本文所用的术语“标记”指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至核酸或蛋白的任何原子或分子。标记包括但不限于染料;放射性标记,诸如32P;结合部分诸如生物素;半抗原诸如地高辛;发光、发磷光或发荧光部分;和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地,可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合,只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中,核酸在没有标记的情况下直接检测(例如,直接读取序列)。
在一些实施方式中,所述标记是荧光团、比色标记、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团,用于click反应的环烯烃,用于聚合物标记的引发集团),也可以选自多肽/蛋白分子,LNA/PNA,非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽),非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒,NV-center,聚集/组装诱导发光分子,稀土离子配体分子,多金属氧簇等)。
在一些实施方式中,所述探针为自身淬灭探针,5′端标记荧光发射基团,3′端标记淬灭基团。
在一些实施方式中,所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR Green I、VIC以及JOE中的任一种;
在一些实施方式中,所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse以及NFQ-MGB中的任一种。
根据本发明的再一方面,还涉及一种乳腺癌诊断试剂盒,其含有如上所定义的检测剂。
根据本发明的再一方面,还涉及一种乳腺癌的诊断方法,其包括使用如上所定义的检测剂或试剂盒定量检测外泌体中SEPT9 mRNA。
降低通常是显著性的,确定受试者和健康群体/良性肿瘤对照组/受试者的初始状态(baseline)相比,是否具有显著性的差异可用本领域公知的统计学方法进行,并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中,置信区间可以为90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%或99.99%并且p值可以为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
在下述实施例中,当采用荧光定量PCR时,若通过双链特异性荧光染料进行定量,则仅使用SEPT9 mRNA(a~f中的至少一种)和UBC mRNA内参引物(g~k中的至少一种)即可;若采用探针法进行检测,则还需要使用相应探针。引物和探针的序列如下所示:
a:
SEPT9 mRNA上游引物序列:AGCAGGGCTTCGAGTTCAAC(SEQ ID NO:1);
SEPT9 mRNA下游引物序列:CGGCTGATTTTGGATTTGAA(SEQ ID NO:2);
SEPT9 mRNA探针序列:ATCCACCTTAATCAACACCC(SEQ ID NO:23);
b:
SEPT9 mRNA上游引物序列:ATCAAGTCCATCACGCACGA(SEQ ID NO:3);
SEPT9 mRNA下游引物序列:CCCGAACCCTGGTGTGTC(SEQ ID NO:4);
SEPT9 mRNA探针序列:CCGGACGCCTTTCTCCTC(SEQ ID NO:24);
c:
SEPT9 mRNA上游引物序列:CGGGGACCACATCAACAAC(SEQ ID NO:5);
SEPT9 mRNA下游引物序列:TGATGTTGACCTCCTCCTGC(SEQ ID NO:6);
SEPT9 mRNA探针序列:CAGCCCATCATGAAGTTCATC(SEQ ID NO:25);
d:
SEPT9 mRNA上游引物序列:GCGTCCACTGCTGCCTCTA(SEQ ID NO:7);
SEPT9 mRNA下游引物序列:ACCTTGCTCAGGCGTTTCA(SEQ ID NO:8);
SEPT9 mRNA探针序列:CCACCGGCCACCCTCAG(SEQ ID NO:26);
e:
SEPT9 mRNA上游引物序列:CCACTTCAAACAGCGGATCA(SEQ ID NO:9);
SEPT9 mRNA下游引物序列:CCGAGTCCTCATCAAATTCCT(SEQ ID NO:10);
SEPT9 mRNA探针序列:CAGACCTGCTGTCCAACGGC(SEQ ID NO:27);
f:
SEPT9 mRNA上游引物序列:TACCAGGTCAACGGCAAGAG(SEQ ID NO:11);
SEPT9 mRNA下游引物序列:CGCAGGTAGGCAAACTCACA(SEQ ID NO:12);
SEPT9 mRNA探针序列:CCATCGAAGTTGAAAACACCAC(SEQ ID NO:28);
g:
UBC mRNA上游引物序列:TGGGTCGCAGTTCTTGTTTG(SEQ ID NO:13);
UBC mRNA下游引物序列:ACCTCGAGGGTGATGGTCTT(SEQ ID NO:14);
UBC mRNA探针序列:TGCAGATCTTCGTGAAGACTCTG(SEQ ID NO:29);
h:
UBC mRNA上游引物序列:GGATTTGGGTCGCAGTTCTTG(SEQ ID NO:15);
UBC miRNA下游引物序列:GTGTCACTGGGCTCAACCTC(SEQ ID NO:16);
UBC mRNA探针序列:TCACTTGACAATGCAGATCTT(SEQ ID NO:30);
i:
UBC mRNA上游引物序列:GGGTCGCAGTTCTTGTTTGT(SEQ ID NO:17);
UBC mRNA下游引物序列:AACCTCGAGGGTGATGGTCT(SEQ ID NO:18);
UBC mRNA探针序列:TCACTTGACAATGCAGATC(SEQ ID NO:31);
j:
UBC mRNA上游引物序列:GGTCGCAGTTCTTGTTTG(SEQ ID NO:19);
UBC mRNA下游引物序列:TCGAGGGTGATGGTCTTA(SEQ ID NO:20);
UBC mRNA探针序列:ACTTGACAATGCAGATCTT(SEQ ID NO:32);
k:
UBC mRNA上游引物序列:TCGCAGTTCTTGTTTGTG(SEQ ID NO:21);
UBC mRNA下游引物序列:TCGAGGGTGATGGTCTTA(SEQ ID NO:22);
UBC mRNA探针序列:AATGCAGATCTTCGTGAAGACTC(SEQ ID NO:33)。
实施例1
在以下实施例中,通过SEPT9 mRNA测定来分析,该测定被设计在荧光定量PCR检测平台上运行,验证标志物乳腺良性结节、乳腺恶性结节中的mRNA表达量差异性能,以便提供标志物精确度的指示,以用于区分乳腺良性结节与乳腺恶性结节患者。
采用Lightcycle480平台分析标志物的性能,所述标志物为SEPT9:
实验方法如下:
1,血浆处理:
使用EDTA抗凝管采集全血,室温2小时内离心分离得到血浆。离心条件:1500g,10分钟,吸取上清,再次离心:15000g,离心10分钟,吸取上清,即为分离得到的血浆。
2,外泌体鉴定:
2mL血浆,用0.2μm的滤膜进行过滤,采用QIAGEN试剂盒(exo-RNeasy Serum/Plasma Midi Kit)富集外泌体后,并不直接裂解进行RNA提取,而是使用其外泌体洗脱液将外泌体洗脱下来,得到结构完整的外泌体。用颗粒跟踪分析技术鉴定提取的外泌体,血浆外泌体NTA见图1。由图可以看出:粒径大小在40-200nm,主峰在140nm左右,符合外泌体粒径范。
3,提取血浆外泌体RNA:
2mL血浆,用0.2μm的滤膜进行过滤,采用QIAGEN试剂盒(exo-RNeasy Serum/Plasma Midi Kit)提取血浆外泌体RNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。
注:建议使用商业化的外泌体mRNA提取试剂盒,避免引入DNA污染,防止后续检测产生非特异性扩增。必要时可使用DNase I进行DNA消化,再进行RT-PCR检测。
4,PCR检测:
使用SuperScriptTM III PlatinumTM One-Step qRT-PCR Kit进行一步法检测,具体PCR反应体系和程序见表1,同时设立阳性对照(阳性细胞系:SK-BR-3提取的总RNA)和阴性对照(未逆转录的RNA)对检测过程进行监控。
2,结果分析:
以UBC为内参,用1000*2-ΔΔCT计算SEPT9的表达量,2-ΔΔCT=2-[CT(靶标,样本)-CT(内参,样本)]-[CT(靶标,阳性对照)-CT(内参,阳性对照)]。样本靶标没有扩增,CT值按照45计算。使用GraphPad Prism软件进行数据分析。
表1 one-step Probe PCR反应体系
表2 one-step Probe PCR反应程序
实施例2
在以下实施例中,通过SEPT9 mRNA测定来分析,该测定被设计在荧光定量PCR检测平台上运行,验证标志物在不同样本中的表达情况,评价其乳腺癌的检测性能。
本实施例中,入组31例血浆样本,其中17例乳腺恶性结节样本,具体为9例导管原位癌伴微浸润、5例导管原位癌、3例小叶原位癌;14例乳腺良性结节,具体为10例纤维腺瘤、3例乳头状瘤、1例导管上皮增生。检测外泌体中SEPT9 mRNA,考察靶标对乳腺结节良恶性的鉴别能力。
血浆外泌体提取,RNA提取及检测见实施例1。检测结果见表3。
表3:乳腺结节良恶性鉴别
结果:17例乳腺恶性结节,16例检测阳性,灵敏度为:94.12%;14例乳腺良性结节,10例检测阴性,特异性为:71.43%。
实施例3:
本实施例检测样本类型为:血浆,共入组91例样本。其中37例乳腺癌:3例中级别导管原位癌、5例高级别导管原位癌、17例浸润性导管癌、3例小叶原位癌,9例浸润性小叶癌;54非乳腺癌:13例肺癌、10例结直肠癌、13例乳腺良性疾病(7例乳腺炎、4例乳头状瘤、2例导管上皮增生)和18例健康人。
血浆外泌体提取,RNA提取及检测见实施例1。检测结果见表4。
表4:乳腺癌辅助诊断
结果:37例乳腺癌,34例检测阳性,灵敏度为:91.89%;54例非乳腺癌,41例检测阴性,特异性为:75.93%,其中:13例肺癌,9例阴性,特异性为:69.24%,10例结直肠癌,7例阳性,特异性为:70%,13例乳腺良性疾病,10例阴性,特异性为76.92%:18例健康人,15例阴性,特异性为:83.33%。
结论:血浆外泌体中SEPT9 mRNA在乳腺癌中的表达水平不仅低于乳腺良性疾病,也低于其他肿瘤,具有一定的乳腺肿瘤特异性和乳腺组织特异性,表明血浆外泌体中SEPT9mRNA表达水平可以用于乳腺癌的辅助诊断。
实施例4:
本实施例检测样本类型为:血浆,入组了5例乳腺癌患者(1例中级别导管原位癌伴小灶区浸润、2例导管原位癌伴微浸润、2例浸润性小叶癌,收集每个患者术前、术后的7-10天的样本。通过检测5例患者术前术后配对血浆外泌体中SEPT9 mRNA表达水平的变化,考察靶标对乳腺癌治疗效果的监控能力。
血浆外泌体提取,RNA提取及检测见实施例1。检测结果见表5。检测结果趋势图见图2。
表5乳腺癌病程监控
结果:入组5例乳腺癌术前术后配对样本,术后外泌体中的SEPT9 mRNA含量都有上升,且上升幅度均超过50%。
结论:这说明外泌体中SEPT9 mRNA表达水平变化可有效监控乳腺癌治疗效果。
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<210> 2
<211> 20
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<400> 33
aatgcagatc ttcgtgaaga ctc 23
Claims (11)
1.外泌体中SEPT9 mRNA的检测剂在制备乳腺癌诊断、病程监控、预后评估试剂或试剂盒中的应用,其中降低的SEPT9 mRNA表达量是乳腺癌病情加重的指征;
所述SEPT9 mRNA为总mRNA,其为待检测外泌体中SEPT9不同转录本mRNA的总和。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述外泌体选自血液样本外泌体。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,通过检测SEPT9不同转录本mRNA的共有序列检测所述SEPT9 mRNA。
4.根据权利要求1~3任一项所述的应用,其特征在于,所述检测剂用于执行如下方法中的至少一种:
PCR法、一代测序、二代测序、核酸芯片、电泳、HPLC、共振光散射法和生物质谱法。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述PCR法为实时荧光定量PCR和/或数字PCR。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述检测剂选自a~f中至少一种引物对:
a:SEQ ID NO:1和2;
b:SEQ ID NO:3和4;
c:SEQ ID NO:5和6;
d:SEQ ID NO:7和8;
e:SEQ ID NO:9和10;
f:SEQ ID NO:11和12。
7.根据权利要求4~6任一项所述的应用,其特征在于,所述检测剂还含有外泌体提取试剂、逆转录酶、随机引物、双链特异性荧光染料、dNTP、DNA聚合酶、探针、内参引物以及水中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述探针包括核苷酸序列为SEQ ID NO:23~28中的至少一种所示的探针,且SEQ ID NO:23~28与a~f中的引物对依次对应、配合使用。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述探针带有可检测的标记。
10.根据权利要求8或9所述的应用,其特征在于,所述探针为自身淬灭探针,5′端标记荧光发射基团,3′端标记淬灭基团。
11.乳腺癌诊断试剂盒,其特征在于,含有权利要求1~10任一项中所定义的检测剂。
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CN107475440A (zh) * | 2017-10-13 | 2017-12-15 | 中国医学科学院肿瘤医院 | 一种血浆外泌体生物标志物在乳腺癌诊断中的应用 |
CN109596841A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-09 | 浙江大学 | 外泌体TβRII蛋白作为标志物在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用 |
CN110699459A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-01-17 | 深圳市人民医院 | 外泌体中microRNA在乳腺癌临床评估中的应用 |
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- 2021-01-20 CN CN202110071975.3A patent/CN112680508A/zh not_active Withdrawn
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