CN110133275A - 一种快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒及其制备方法，所述快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒包括相互独立的试剂R1和试剂R2，其特征在于，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液50～150mmol/L；氯化钠11～15g/L；表面活性剂3～11g/L；牛血清蛋白5～12g/L；乙二醇聚氧乙烯醚80～100g/L；防腐剂3～6g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液80～120mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒15～30mg/L；封闭剂20～50mg/L；氯化钠5～8g/L；牛血清蛋白3～8g/L；防腐剂4～6g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。本发明提供的钙卫蛋白检测试剂盒，能够准备、快速、灵敏的检测出人粪便和血液中的钙卫蛋白。

Description

一种快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
钙卫蛋白是一个分子量为36kD的钙、锌结合蛋白,由两条分子量为14kD的重链和一条分子量为8kD的轻链以共价键连接的钙结合蛋白质异三聚体组成,每条链可结合两个Ca2+，从而具有耐热性和增强水解性的特性。钙卫蛋白是中性粒细胞和活化的巨噬细胞质中重要的蛋白质，在许多炎症情况下含量增加，可作为急性炎症性标志物。
目前虽然钙卫蛋白在人类生物体中多处被发现，包括：血清、唾液、脑脊液和尿液。但在粪便中容易测得，且其成分稳定，室温下可在大便中稳定存在7d左右，且不易被细菌和各种酶类破坏，不受饮食的影响。粪便的钙卫蛋白的检测是一种简单、迅速的、灵敏度高、特异性强、廉价的、非侵袭的炎性肠病检测方法。这种检测方法可以在正常人的黏膜和患病患者的炎性黏膜中都可以获得准确的检测结果。
目前临床上对于钙卫蛋白的检测方法有：酶联免疫法(ELISA)、胶体金法等方法，但这些方法都有各自的特点及不足。ELISA法由于定量准确，广泛应用于医院检验科，但ELISA需要洗板，孵育，加酶和底物对温度环境严格，操作繁琐不能现场检测，测试时间长，不便捷；胶体金法虽然方便、快捷，但由于胶体金颗粒与被标记的蛋白是靠静电作用结合，结合不稳定易受环境的干扰，灵敏度低，无法定量检测；因此，临床上迫切需求建立一种快速、便捷、经济的钙卫蛋白定量检测方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒及其制备方法，它具有检测迅速、准确性高的特点。
为实现上述目的，本发明提供一种钙卫蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液50～150mmol/L；氯化钠11～15g/L；表面活性剂3～11g/L；牛血清蛋白5～12g/L；乙二醇聚氧乙烯醚80～100g/L；防腐剂3～6g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；
所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液80～120mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒15～30mg/L；封闭剂20～50mg/L；氯化钠5～8g/L；牛血清蛋白3～8g/L；防腐剂4～6g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。
本发明的发明人在长期研究钙卫蛋白检测试剂盒的基础上发现，通过调整试剂盒试剂中各物质的含量和比例，能够提高试剂盒的灵敏度，并缩短检测时间，优选条件下，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液80～120mmol/L；氯化钠12～15g/L；表面活性剂5～8g/L；牛血清蛋白6～10g/L；乙二醇聚氧乙烯醚85～96g/L；防腐剂3～6g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；
优选条件下，所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液90～110mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒18～25mg/L；封闭剂25～45mg/L；氯化钠5～8g/L；牛血清蛋白5～6g/L；防腐剂4～6g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。
封闭剂可以与试样中未结合抗原或抗体发生结合，避免抗体或抗原发生非特异结合，从而提高检测的灵敏度，本发明中，为了进一步提高检测试剂盒的检测灵敏度，优选条件下，在试剂R2中，所述封闭剂包括明胶1～3wt％、NH2-PEG2～4wt％和壳聚糖1～5wt％，其余为磷酸盐缓冲液。
进一步优选的，所述抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒与所述封闭剂的浓度比为1:1.1～2.5。
进一步优选的，所述聚苯乙烯胶乳的颗粒直径为100～300nm。
进一步优选的，所述防腐选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯中的至少一种。
进一步优选的，所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的至少一种。
本发明还提供一种所述的快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)试剂R1的制备；
(2)试剂R2的制备：将聚苯乙烯乳胶微球用磷酸盐缓冲液稀释，然后加入氯化钠、牛血清蛋白、3-(N-吗啉)丙磺酸、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、稀土离子和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化聚苯乙烯乳胶微球，超声分散30～60min，得到产物A；
将产物A均分为两份，即A1和A2，在产物A1中加入抗人钙卫蛋白抗体A，反应1～3h后，加入封闭剂，得到乳胶液C1；在产物A2中胶乳加入抗人钙卫蛋白抗体B，反应1～3h后，加入封闭剂，得到乳胶液C2；
分别对乳胶液C1和乳胶液C2进行离心，弃去上清液，分别得到沉淀物D1和沉淀物D2，接着将沉淀物D1和沉淀物D2分别溶于磷酸盐缓冲液中，得到钙卫蛋白抗体标记液E1和E2，接着将钙卫蛋白抗体标记液E1和E2进行混合，并加入防腐剂，即得到抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒溶液。
本发明采用化学偶联法将特异性抗体结合与乳胶颗粒表面，通过优化体系中各物质的含量，即可获得稳定的乳胶试剂体系，标本与乳胶试剂在缓冲溶液中混合后，标本中的钙卫蛋白抗体即可与乳胶颗粒表面的抗体进行稳定的交联结合，从而提高了检测试剂盒的灵敏度和稳定性。
通过加入稀土离子可以与抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒发生荧光结合，形成荧光夹心复合物，在检测时可以产生荧光信号，能够及时观察检测结果，且可以降低其它物质对底物的干扰，保证检测的灵敏度。优选条件下，所述稀土离子选自Eu2+和Eu3+中的一种。
本发明中，试剂R1在制备时，只需将各成分混合均匀即可，因此本发明在此不在赘述。
通过上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明通过调节试剂R1和试剂R2中各物质的含量和配比，能够有效提高钙卫蛋白检测试剂盒的检测灵敏度，并能够迅速检测出信号；
本发明提供的钙卫蛋白检测试剂盒，能够准备、快速、灵敏的检测出人粪便和血液中的钙卫蛋白。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1中的钙卫蛋白检测试剂盒与瑞士Buhlman Laboratories AG公司的钙卫蛋白检测试剂盒的比较结果示意图，其中横坐标为实施例1的检测结果，纵坐标为瑞士Buhlman Laboratories AG公司的检测试剂盒的检测结果；
图2是本发明实施例2中的钙卫蛋白检测试剂盒与瑞士Buhlman Laboratories AG公司的钙卫蛋白检测试剂盒的比较结果示意图，其中横坐标为实施例1的检测结果，纵坐标为瑞士Buhlman Laboratories AG公司的检测试剂盒的检测结果；
图3是本发明实施例3中的钙卫蛋白检测试剂盒与瑞士Buhlman Laboratories AG公司的钙卫蛋白检测试剂盒的比较结果示意图，其中横坐标为实施例1的检测结果，纵坐标为瑞士Buhlman Laboratories AG公司的检测试剂盒的检测结果；
图4是本发明实施例4中的钙卫蛋白检测试剂盒与瑞士Buhlman Laboratories AG公司的钙卫蛋白检测试剂盒的比较结果示意图，其中横坐标为实施例1的检测结果，纵坐标为瑞士Buhlman Laboratories AG公司的检测试剂盒的检测结果；
图5是本发明实施例5中的钙卫蛋白检测试剂盒与瑞士Buhlman Laboratories AG公司的钙卫蛋白检测试剂盒的比较结果示意图，其中横坐标为实施例1的检测结果，纵坐标为瑞士Buhlman Laboratories AG公司的检测试剂盒的检测结果；
图6是本发明对比例1中的钙卫蛋白检测试剂盒与瑞士Buhlman Laboratories AG公司的钙卫蛋白检测试剂盒的比较结果示意图，其中横坐标为实施例1的检测结果，纵坐标为瑞士Buhlman Laboratories AG公司的检测试剂盒的检测结果；
图7是本发明对比例2中的钙卫蛋白检测试剂盒与瑞士Buhlman Laboratories AG公司的钙卫蛋白检测试剂盒的比较结果示意图，其中横坐标为实施例1的检测结果，纵坐标为瑞士Buhlman Laboratories AG公司的检测试剂盒的检测结果。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
实施例1
一种快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液100mmol/L；氯化钠13g/L；Triton X-1006g/L；牛血清蛋白8g/L；乙二醇聚氧乙烯醚90g/L；叠氮钠5g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；
所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液100mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒18mg/L；封闭剂20mg/L(包括明胶2wt％、NH2-PEG3wt％和壳聚糖3wt％，磷酸盐缓冲液92wt％，其中磷酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L)；氯化钠5g/L；牛血清蛋白5g/L；叠氮钠6g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。
所述快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)试剂R1的制备：在磷酸盐缓冲液中加入氯化钠、Triton X-100、牛血清蛋白、乙二醇聚氧乙烯醚和叠氮钠，混合均匀后，调节pH至6.3～7.5，得到试剂R1；
(2)试剂R2的制备：将1.8mg聚苯乙烯乳胶微球(直径为200nm)用100mL磷酸盐缓冲液(100mmol/L)稀释，然后加入0.5g氯化钠、0.5g牛血清蛋白、2mmol3-(N-吗啉)丙磺酸、3mmol N-羟基硫代琥珀酰亚胺、0.1mmol Eu2+和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，超声分散45min，得到产物A；
将产物A均分为两份，即A1和A2，在产物A1中加入抗人钙卫蛋白抗体A，反应2h后，加入1mg封闭剂，得到乳胶液C1；在产物A2中胶乳加入抗人钙卫蛋白抗体B，反应2h后，加入1mg封闭剂，得到乳胶液C2；
分别对乳胶液C1和乳胶液C2进行离心，弃去上清液，分别得到沉淀物D1和沉淀物D2，接着将沉淀物D1和沉淀物D2分别溶于磷酸盐缓冲液中，得到钙卫蛋白抗体标记液E1和E2，接着将钙卫蛋白抗体标记液E1和E2进行混合，并加入叠氮钠，即得到抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒溶液。
实施例2
一种钙卫蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液80mmol/L；氯化钠12g/L；Triton X-100 5g/L；牛血清蛋白6g/L；乙二醇聚氧乙烯醚85g/L；叠氮钠3g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；
所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液90mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒20mg/L；封闭剂50mg/L(包括明胶1wt％、NH2-PEG4wt％和壳聚糖5wt％，磷酸盐缓冲液90wt％，其中磷酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L)；氯化钠8g/L；牛血清蛋白6g/L；叠氮钠5g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。
所述快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)试剂R1的制备：在磷酸盐缓冲液中加入氯化钠、Triton X-100、牛血清蛋白、乙二醇聚氧乙烯醚和叠氮钠，混合均匀后，调节pH至6.3～7.5，得到试剂R1；
(2)试剂R2的制备：将2mg聚苯乙烯乳胶微球(直径为100nm)用100mL磷酸盐缓冲液(90mmol/L)稀释，然后加入0.8g氯化钠、0.6g牛血清蛋白、5mmol3-(N-吗啉)丙磺酸、2mmolN-羟基硫代琥珀酰亚胺、0.3mmol Eu2+和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，超声分散45min，得到产物A；
将产物A均分为两份，即A1和A2，在产物A1中加入抗人钙卫蛋白抗体A，反应1.5h后，加入2.5mg封闭剂，得到乳胶液C1；在产物A2中胶乳加入抗人钙卫蛋白抗体B，反应1.5h后，加入2.5mg封闭剂，得到乳胶液C2；
分别对乳胶液C1和乳胶液C2进行离心，弃去上清液，分别得到沉淀物D1和沉淀物D2，接着将沉淀物D1和沉淀物D2分别溶于磷酸盐缓冲液中，得到钙卫蛋白抗体标记液E1和E2，接着将钙卫蛋白抗体标记液E1和E2进行混合，并加入叠氮钠，即得到抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒溶液。
实施例3
一种钙卫蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液120mmol/L；氯化钠15g/L；Tween-20 8g/L；牛血清蛋白10g/L；乙二醇聚氧乙烯醚96g/L；对羟基苯甲酸6g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；
所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液110mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒25mg/L；封闭剂40mg/L(包括明胶3wt％、NH2-PEG4wt％和壳聚糖1wt％，磷酸盐缓冲液92wt％，其中磷酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L)；氯化钠6g/L；牛血清蛋白5g/L；对羟基苯甲酸6g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。
所述快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)试剂R1的制备：在磷酸盐缓冲液中加入氯化钠、Tween-20、牛血清蛋白、乙二醇聚氧乙烯醚和对羟基苯甲酸，混合均匀后，调节pH至6.3～7.5，得到试剂R1；
(2)试剂R2的制备：将2.5mg聚苯乙烯乳胶微球(直径为300nm)用100mL磷酸盐缓冲液(110mmol/L)稀释，然后加入0.6g氯化钠、0.5g牛血清蛋白、6mmol3-(N-吗啉)丙磺酸、1mmol N-羟基硫代琥珀酰亚胺、0.2mmol Eu2+和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，超声分散30min，得到产物A；
将产物A均分为两份，即A1和A2，在产物A1中加入抗人钙卫蛋白抗体A，反应2.5h后，加入2mg封闭剂，得到乳胶液C1；在产物A2中胶乳加入抗人钙卫蛋白抗体B，反应2.5h后，加入2mg封闭剂，得到乳胶液C2；
分别对乳胶液C1和乳胶液C2进行离心，弃去上清液，分别得到沉淀物D1和沉淀物D2，接着将沉淀物D1和沉淀物D2分别溶于磷酸盐缓冲液中，得到钙卫蛋白抗体标记液E1和E2，接着将钙卫蛋白抗体标记液E1和E2进行混合，并加入对羟基苯甲酸，即得到抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒溶液。
实施例4
一种快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液50mmol/L；氯化钠11g/L；Tween-2011g/L；牛血清蛋白12g/L；乙二醇聚氧乙烯醚100g/L；对羟基苯甲酸乙酯6g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；
所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液80mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒30mg/L；封闭剂45mg/L(包括明胶3wt％、NH2-PEG4wt％和壳聚糖1wt％，磷酸盐缓冲液92wt％，其中磷酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L)；氯化钠8g/L；牛血清蛋白3g/L；对羟基苯甲酸乙酯6g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。
所述快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)试剂R1的制备：在磷酸盐缓冲液中加入氯化钠、Tween-20、牛血清蛋白、乙二醇聚氧乙烯醚和对羟基苯甲酸，混合均匀后，调节pH至6.3～7.5，得到试剂R1；
(2)试剂R2的制备：将3mg聚苯乙烯乳胶微球(直径为200nm)用100mL磷酸盐缓冲液(80mmol/L)稀释，然后加入0.8g氯化钠、0.3g牛血清蛋白、8mmol3-(N-吗啉)丙磺酸、5mmolN-羟基硫代琥珀酰亚胺、0.5mmol Eu2+和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，超声分散60min，得到产物A；
将产物A均分为两份，即A1和A2，在产物A1中加入抗人钙卫蛋白抗体A，反应1h后，加入2.25mg封闭剂，得到乳胶液C1；在产物A2中胶乳加入抗人钙卫蛋白抗体B，反应1h后，加入2.25mg封闭剂，得到乳胶液C2；
分别对乳胶液C1和乳胶液C2进行离心，弃去上清液，分别得到沉淀物D1和沉淀物D2，接着将沉淀物D1和沉淀物D2分别溶于磷酸盐缓冲液中，得到钙卫蛋白抗体标记液E1和E2，接着将钙卫蛋白抗体标记液E1和E2进行混合，并加入对羟基苯甲酸乙酯，即得到抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒溶液。
实施例5
一种快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液150mmol/L；氯化钠15g/L；聚氧乙烯辛基苯醚3g/L；牛血清蛋白5g/L；乙二醇聚氧乙烯醚80g/L；对羟基苯甲酸乙酯3g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；
所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液120mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒15mg/L；封闭剂30mg/L(包括明胶1.5wt％、NH2-PEG3wt％和壳聚糖3wt％，磷酸盐缓冲液92.5wt％，其中磷酸盐缓冲液的浓度为100mmol/L)；氯化钠5g/L；牛血清蛋白8g/L；对羟基苯甲酸乙酯4g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。
所述快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
(1)试剂R1的制备：在磷酸盐缓冲液中加入氯化钠、聚氧乙烯辛基苯醚、牛血清蛋白、乙二醇聚氧乙烯醚和对羟基苯甲酸乙酯，混合均匀后，调节pH至6.3～7.5，得到试剂R1；
(2)试剂R2的制备：将1.5mg聚苯乙烯乳胶微球(直径为200nm)用100mL磷酸盐缓冲液(120mmol/L)稀释，然后加入0.5g氯化钠、0.8g牛血清蛋白、3mmol3-(N-吗啉)丙磺酸、1mmol N-羟基硫代琥珀酰亚胺、0.1mmol Eu2+和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，超声分散45min，得到产物A；
将产物A均分为两份，即A1和A2，在产物A1中加入抗人钙卫蛋白抗体A，反应3h后，加入1.5mg封闭剂，得到乳胶液C1；在产物A2中胶乳加入抗人钙卫蛋白抗体B，反应3h后，加入1.5mg封闭剂，得到乳胶液C2；
分别对乳胶液C1和乳胶液C2进行离心，弃去上清液，分别得到沉淀物D1和沉淀物D2，接着将沉淀物D1和沉淀物D2分别溶于磷酸盐缓冲液中，得到钙卫蛋白抗体标记液E1和E2，接着将钙卫蛋白抗体标记液E1和E2进行混合，并加入对羟基苯甲酸乙酯，即得到抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒溶液。
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是，在试剂R2的制备过程中不加入Eu2+；
具体步骤如下：将2.5mg聚苯乙烯乳胶微球用100mL磷酸盐缓冲液(110mmol/L)稀释，然后加入0.6g氯化钠、0.5g牛血清蛋白、6mmol3-(N-吗啉)丙磺酸、1mmol N-羟基硫代琥珀酰亚胺、0.2mmol Eu2+和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，超声分散30min，得到产物A；
抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒溶液的制备方法同实施例1。
对比例2
按照实施例1的方法，不同的是，所述试剂R2中，所述封闭剂为鱼皮明胶蛋白。
本发明实施例中制备得到的钙卫蛋白检测试剂盒的使用方法为：
(1)使用钙卫蛋白校准品在全自动生化分析仪(MINDRAY，BS-380)上测定反应度(吸光度差值)并拟合标准曲线。
(2)取10ul待测样本，加入到250ul试剂R1中，得到第一混合液，并在37℃中反应5分钟，读取第一混合液的吸光度OD1(检测的主波长为546nm)。
(3)向第一混合液中加入50ul试剂R2，得到第二混合液，并在37℃中反应5分钟，然后读取第二混合液的吸光度OD2(检测的主波长为546nm)。
(4)计算测量样本的反应度：反应度(吸光度差值)＝OD1-OD2，然后根据反应度与校准曲线的回归方程计算分析得到待测样品的钙卫蛋白的含量。
实验例1
将实施例1～5和对比例1～2得到的钙卫蛋白检测试剂盒按照上述使用方法，检测样本，其中样本为人体粪便提取物；同时，使用瑞士Buhlman Laboratories AG公司的货号为HR0593的粪便钙卫蛋白检测试剂盒作为空白对照实验，样本共20例，实验结果如表1和图1～7所示。
表1：
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，其特征在于，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液50～150mmol/L；氯化钠11～15g/L；表面活性剂3～11g/L；牛血清蛋白5～12g/L；乙二醇聚氧乙烯醚80～100g/L；防腐剂3～6g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；
所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液80～120mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒15～30mg/L；封闭剂20～50mg/L；氯化钠5～8g/L；牛血清蛋白3～8g/L；防腐剂4～6g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。
2.根据权利要求1所述的快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括：磷酸盐缓冲液80～120mmol/L；氯化钠12～15g/L；表面活性剂5～8g/L；牛血清蛋白6～10g/L；乙二醇聚氧乙烯醚85～96g/L；防腐剂3～6g/L；且所述试剂R1的pH值为6.3～7.5；
所述试剂R2包括：磷酸盐缓冲液90～110mmol/L；抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒18～25mg/L；封闭剂25～45mg/L；氯化钠5～8g/L；牛血清蛋白5～6g/L；防腐剂4～6g/L；且所述试剂R2的pH值为7～8，其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度。
3.根据权利要求2所述的快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，在试剂R2中，所述封闭剂包括明胶1～3wt％、NH2-PEG 2～4wt％和壳聚糖1～5wt％，其余为磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒与所述封闭剂的浓度比为1:1.1～2.5。
5.根据权利要求1所述的快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述防腐选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的至少一种。
7.一种根据利要求1～6中任意一项所述的快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)试剂R1的制备；
(2)试剂R2的制备：将聚苯乙烯乳胶微球用磷酸盐缓冲液稀释，然后加入氯化钠、牛血清蛋白、3-(N-吗啉)丙磺酸、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、稀土离子和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化聚苯乙烯乳胶微球，超声分散30～60min，得到产物A；
将产物A均分为两份，即A1和A2，在产物A1中加入抗人钙卫蛋白抗体A，反应1～3h后，加入封闭剂，得到乳胶液C1；在产物A2中胶乳加入抗人钙卫蛋白抗体B，反应1～3h后，加入封闭剂，得到乳胶液C2；
分别对乳胶液C1和乳胶液C2进行离心，弃去上清液，分别得到沉淀物D1和沉淀物D2，接着将沉淀物D1和沉淀物D2分别溶于磷酸盐缓冲液中，得到钙卫蛋白抗体标记液E1和E2，接着将钙卫蛋白抗体标记液E1和E2进行混合，并加入防腐剂，即得到抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒溶液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述稀土离子选自Eu2+和Eu3+中的一种。
9.根据权利要求7所述的快速高效的钙卫蛋白检测试剂盒，所述聚苯乙烯胶乳的颗粒直径为100～300nm。
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