CN110133276A - 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液80～120mmol/L；谷胱甘肽0.5～1.5mmol/L；表面活性剂0.02～1.5g/L；防腐剂0.05～2g/L；牛血清蛋白15～30g/L；解离剂0.02～1g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液100～150mmol/L；促凝剂8～15g/L；阻断剂2～8mg/L；蔗糖5～15mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球20～50mg/L；防腐剂0.01～0.05g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5。本发明提供的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，检测灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)生理状态下是一种生长因子，主要参与了早期肾脏上皮的发生、生长。在正常组织包括肾脏，肺，胃及结肠的上皮组织中表达量较低。在发生缺血性和毒性肾损伤过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加，在开始的两个小时内，尿液和血液中NGAL水平将显著增加，因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物，同时其表达量与肾脏缺血时间相关；NGAL也是反映肾脏慢性损害的一种有潜力的新标记物，在慢性肾脏病患者中，NGAL能确切反映肾脏损害的程度，是CKD进展的一个强力和独立的风险指标；此外，NGAL水平在疾病初期和复发期均较缓解期显著升高，提示循环NGAL水平也可作为评价ANCA 相关性血管炎疾病活动的一个有用指标。
目前，NGAL的检测方法有酶联免疫分析法和胶体金比色法免疫浊比浊法：胶体金比色法有快速简便，易观察的特点，但只能进行定性或半定量检测，灵敏度低。酶免分析法操作简便，特异性强，但灵敏度较低、线性范围较窄；免疫比浊法操作简便、结果准确可靠、自动化程度高，且检测快速，具有较高的临床可用度。
但是常规的NGAL免疫比浊法检测试剂盒中抗体的免疫活性随着放置时间逐渐衰减，降低检测试剂盒的稳定性，限制了线性检测范围，制约了临床应用的推广。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，它具有线性度宽，灵敏度高的特点。
为实现上述目的，本发明提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液80～120mmol/L；谷胱甘肽0.5～1.5mmol/L；表面活性剂0.02～1.5g/L；防腐剂0.05～2g/L；牛血清蛋白15～30g/L；解离剂0.02～1g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液100～150mmol/L；促凝剂 8～15g/L；阻断剂2～8mg/L；蔗糖5～15mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球20～50mg/L；防腐剂0.01～0.05g/L；其中，试剂R2 中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5。
本发明通过调整检测试剂盒中试剂R1和试剂R2中各物质的含量，达到提高检测试剂盒灵敏度的作用，优选条件下，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液90～100mmol/L；谷胱甘肽0.8～1.2mmol/L；表面活性剂 0.5～1g/L；防腐剂0.2～0.8g/L；牛血清蛋白20～25g/L；解离剂0.2～0.8g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液120～140mmol/L；促凝剂 10～12g/L；阻断剂3～6mg/L；蔗糖6～10mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球24～45mg/L；防腐剂0.02～0.04g/L；其中，试剂 R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5。
通过将单克隆抗体与多克隆抗体同时使用，有利于在免疫学检测过程中提高抗体的抗干扰能力，从而提高检测试剂盒的检测灵敏度，优选条件下，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为单克隆抗体与多克隆抗体的混合，且单克隆抗体与多克隆抗体的比值为1:3～6。
进一步优选的，在所述试剂R2中，所述多克隆抗体为兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体、羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体或鸡抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的一种。
进一步优选的，所述单克隆抗体为鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
阻断剂可以与检测试样中的未结合抗原或抗体发生结合，避免抗体或抗原发生非特异结合，从而进一步提高免疫学检测的灵敏度，本发明中，为了进一步提高检测试剂盒的检测灵敏度，优选条件下，所述阻断剂与所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球的浓度比为1:3～15。
优选条件下，所述阻断剂选自鱼皮明胶蛋白1～3wt％、二亚乙基三胺五乙酸2～wt％、NH2-PEG 2～4wt％和壳聚糖1～5wt％，其余为磷酸盐缓冲液。
通过加入解离剂能够使中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白发生变性，暴露出更多的物理活性位点和化学活性位点，从而在免疫学检测过程中，有利于中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的反应，从而提高检测的灵敏度，优选条件下，所述解离剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、尿素和十二烷基硫酸钠中的至少一种。
优选条件下，所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和司盘40中的至少一种。
添加适量的促凝剂，一方面可以避免因聚合物过多造成的非特异性反应和因聚合物太少导致的灵敏度过低；另一方面可以维持乳胶颗粒保持良好的分散状态，防止乳胶颗粒下沉，从而提高检测试剂盒中试剂的稳定性；优选条件下，所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000和硫酸葡聚糖钠中的至少一种。
优选条件下，所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和Proclin系列中的至少一种。
优选条件下，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球的直径为150～250nm。
本发明中，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法可以为本领域技术人员所知，本发明在此不再赘述。
通过上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明通过调节试剂R1和试剂R2中各物质的含量和配比，既能够有效提高中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的稳定性，也可以提高检测试剂盒的检测灵敏度。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
实施例1
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液100mmol/L；谷胱甘肽1mmol/L；TritonX-1000.8g/L；叠氮钠0.5g/L；牛血清蛋白22g/L；硫氰酸胍0.5g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液135mmol/L；硫酸葡聚糖钠10g/L；阻断剂3mg/L(所述阻断剂的组成如下：鱼皮明胶蛋白2wt％、二亚乙基三胺五乙酸3wt％、NH2-PEG 2.5wt％和壳聚糖3.5wt％，磷酸盐缓冲液89wt％，磷酸盐缓冲液的浓度为120mmol/L)；蔗糖8mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球45mg/L(直径为250nm)；叠氮钠0.03g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
其中，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体由鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体与羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体按比值为1:5组成。
实施例2
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液100mmol/L；谷胱甘肽1.2mmol/L；Triton X-1000.5g/L；对羟基苯甲酸0.8g/L；牛血清蛋白25g/L；异硫氰酸胍0.8g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液140mmol/L；PEG-8000 12g/L；阻断剂5mg/L(所述阻断剂的组成如下：鱼皮明胶蛋白2.5wt％、二亚乙基三胺五乙酸3.5wt％、NH2-PEG 3wt％和壳聚糖4wt％，磷酸盐缓冲液 87wt％，磷酸盐缓冲液的浓度为120mmol/L)；蔗糖6mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球50mg/L(直径为200nm)；对羟基苯甲酸0.04g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
其中，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体由鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体与羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体按比值为1:4.5组成。
实施例3
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液90mmol/L；谷胱甘肽0.8mmol/L；Tween-201g/L；对羟基苯甲酸乙酯0.2g/L；牛血清蛋白20g/L；硫氰酸胍0.2g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液120mmol/L；PEG-4000 10g/L；阻断剂6mg/L(所述阻断剂的组成如下：鱼皮明胶蛋白1.5wt％、二亚乙基三胺五乙酸4wt％、NH2-PEG 4wt％和壳聚糖2.5wt％，磷酸盐缓冲液 88wt％，磷酸盐缓冲液的浓度为120mmol/L)；蔗糖10mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球36mg/L(直径为200nm)；对羟基苯甲酸乙酯0.02g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
其中，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体由鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体与羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体按比值为1:3.5组成。
实施例4
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液80mmol/L；谷胱甘肽1.5mmol/L；聚氧乙烯烷基苯基醚0.02g/L；对羟基苯甲酸乙酯2 g/L；牛血清蛋白30g/L；异硫氰酸胍0.02g/L，且所述试剂R1的pH值为 6.5～7.5；
所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液150mmol/L；PEG-8000 15g/L；阻断剂8mg/L(所述阻断剂的组成如下：鱼皮明胶蛋白1wt％、二亚乙基三胺五乙酸2wt％、NH2-PEG4wt％和壳聚糖5wt％，磷酸盐缓冲液 88wt％，磷酸盐缓冲液的浓度为120mmol/L)；蔗糖15mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球24mg/L(直径为150nm)；对羟基苯甲酸乙酯0.01g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
其中，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体由鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体与羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体按比值为1:6组成。
实施例5
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液120mmol/L；谷胱甘肽0.5mmol/L；聚氧乙烯烷基苯基醚1.5g/L；对羟基苯甲酸0.05g/L；牛血清蛋白15g/L；盐酸胍1g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液100mmol/L；PEG-4000 8g/L；阻断剂2mg/L(所述阻断剂的组成如下：鱼皮明胶蛋白3wt％、二亚乙基三胺五乙酸5wt％、NH2-PEG2wt％和壳聚糖1wt％，磷酸盐缓冲液 89wt％，磷酸盐缓冲液的浓度为120mmol/L)；蔗糖5mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球20mg/L(直径为250nm)；对羟基苯甲酸0.05g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
其中，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体由鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体与羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白多克隆抗体按比值为1:3组成。
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是，所述阻断剂为鱼皮明胶蛋白。
对比例2
按照实施例1的方法，不同的是，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体。
对比例4
按照实施例1的方法，不同的是，所述抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白为鼠源中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体。
对比例5
按照实施例1的方法，不同的是，所述鱼皮明胶蛋白与所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的浓度比为8:1。
实验例1
将中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(购自R&D公司)，用生理盐水配置成浓度为5mg/L的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白溶液，并添加溶液总质量0.1wt％的Proclin-300，并将上述溶液配置成2mg/L、1mg/L、 0.8mg/L、0.2mg/L的标准液A1、A2、A3、A4；用实施例1～5和对比例1～3 得到的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒测试上述标准液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的浓度，其中测试主波长为570nm，实验结果如表1所示。
表1
实验例2
材将实施例1～5和对比例1～2得到的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒按照上述使用方法，检测样本，其中样本是从医院取得的尿液样本；采用Human MMP-9/NGAL complex immunoassay(购自R&D公司)进行检测作为对照实验A1，样本共20例，实验结果如表1所示。
表1：
在表2中，B为以实施例和对比例的检测结果为横坐标，以对照实验 A1的检测结果为纵坐标做线性回归方程，而得到的线性系数；R2为离散度，通过线性系数和离散度可以反映本发明实施例的检测结果的准确性和精确性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，其特征在于，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液80～120mmol/L；谷胱甘肽0.5～1.5mmol/L；表面活性剂0.02～1.5g/L；防腐剂0.05～2g/L；牛血清蛋白15～30g/L；解离剂0.02～1g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液100～150mmol/L；促凝剂8～15g/L；阻断剂2～8mg/L；蔗糖5～15mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球20～50mg/L；防腐剂0.01～0.05g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5。
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液90～100mmol/L；谷胱甘肽0.8～1.2mmol/L；表面活性剂0.5～1g/L；防腐剂0.2～0.8g/L；牛血清蛋白20～25g/L；解离剂0.2～0.8g/L，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5；
所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液120～140mmol/L；促凝剂10～12g/L；阻断剂3～6mg/L；蔗糖6～10mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球24～45mg/L；防腐剂0.02～0.04g/L；其中，试剂R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5。
3.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体为单克隆抗体与多克隆抗体的混合，且单克隆抗体与多克隆抗体的比值为1:3～6。
4.根据权利要求3所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，在所述试剂R2中，所述多克隆抗体为兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体、羊抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体或鸡抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的一种；
所述单克隆抗体为鼠抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
5.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述阻断剂与所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球的浓度比为1:3～15；
优选的，所述阻断剂选自鱼皮明胶蛋白1～3wt％、二亚乙基三胺五乙酸2～5wt％、NH2-PEG2～4wt％和壳聚糖1～5wt％，其余为磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述解离剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、尿素和十二烷基硫酸钠中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和司盘40中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000和硫酸葡聚糖钠中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯和Proclin系列中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球的直径为150～250nm。
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