CN105154521A - 一种新型氧化还原聚合辅助信号放大用于分子诊断的方法 - Google Patents

一种新型氧化还原聚合辅助信号放大用于分子诊断的方法 Download PDF

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Abstract

一种新型氧化还原聚合辅助信号放大用于分子诊断的方法，属于分子诊断技术领域。本发明利用连接于待检测物质上的还原剂如富含羟基类大分子物质、维生素C等，与氧化剂如四价铈盐、过氧化氢等构成氧化还原对，发生氧化还原反应产生活性自由基，从而在常温、常压、水溶液等极其温和的条件下引发单体原位聚合，达到放大被测物质信号的目的。利用本发明所述方法对p53基因序列及其单点突变序列进行检测，检测灵敏度可达0.1nM，且具有极高的裸眼分辨能力。本发明所述信号放大及检测方法还可用于其他疾病基因及蛋白质的检测等相关领域。

Description

一种新型氧化还原聚合辅助信号放大用于分子诊断的方法
技术领域
本发明涉及一种新型的通过氧化还原聚合辅助信号放大来检测生物分子的方法，并用于检测基因特征序列及其单碱基突变，属于分子诊断及信号放大技术领域。
背景技术
随着越来越多的疾病被证实与基因或蛋白质的变异密切相关，分子诊断这一领域的相关研究也越来越受到研究者的重视。在疾病的预防、早期诊断、治疗等领域中，通过分子生物学方法来检测患者体内遗传物质是如今临床诊断的重要手段。目前，发展迅速并得到广泛应用的疾病分子诊断技术主要有酶联免疫实验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、单核苷酸多态性(SNP)、基因测序(DNAsequencing)、荧光原位杂交技术(FISH)、基因及蛋白质芯片(genechip)等。其中，应用PCR相关技术衍生的分子诊断手段是临产疾病基因检测的主要方法；生物芯片技术由于其高通量及普适性强的优点也成为当今研究的热点。这些技术手段的应用范围广泛、生物特异性良好、灵敏度高、检测时间短，在疾病的早期预诊、治疗、愈后检验中发挥了重要作用，这些方法提供的患者基因定性数据有助于建立患者的数据库，为相关诊断提供可靠有效的信息指导。但是这些技术亦具有开发难度高、成本昂贵、操作繁杂、对高精密仪器依赖性强等限制，而且这些技术往往对操作者的科学素养有较高要求。因此，研究具有高选择性、高特异性、高灵敏性，同时快速便捷及可视化的分子诊断新技术是及其必要，且有广阔的应用前景的。
DNA分子杂交反应与抗体-抗原之间的特异性反应是表面分子检测的基础。以DNA的诊断为例，所有有关DNA诊断的研究都是建立在这样一个理论上：目标序列与其完全匹配的互补序列可以进行高特异性的杂交反应，而这种高特异性的反应无论在溶液中还是在固体表面上都是极其高效的。
在分子诊断体系中，往往分为分子识别系统及信号放大系统两大部分。附图1是常用的分子诊断体系的示意图：末端巯基修饰的探针(也称为捕获探针)与金表面连接，其序列与一部分目标探针完全互补，通过杂交反应可以将目标探针连接于表面，而信号标记分子修饰在另一段与部分目标探针互补的信号标记探针上(该探针也称为信标探针)，通过杂交反应将信标分子特异性的连接在表面上，从而将信号放大部分与分子识别部分联系起来。
本发明的重点在于发明了一种新型的氧化还原聚合辅助信号放大体系。
目前分子诊断领域常用的技术如生物芯片具有应用广泛、检测灵敏度高、生物特异性好的优点，在疾病的早期诊断及治疗中发挥了巨大的作用，但是这些技术亦具有开发难度高、成本昂贵、操作繁杂、对高精密仪器依赖性强等限制。本发明所涉及的氧化还原聚合辅助信号放大用于分子诊断体系的目的是提供一种成本低廉、高灵敏度、快速便携及检测效果裸眼可视的新型分子诊断技术。
发明内容
针对现有技术及实际检测的需要，本发明的目的是提供一种新型氧化还原聚合辅助信号放大用于分子诊断的方法，以达到成本低廉、高灵敏度、快速便携及检测效果裸眼可视的新型分子诊断技术。
特异性的检测微量目标生物分子并将其信号放大是通过如下手段达到的。
本发明的技术构思是将富含还原性基团的物质通过化学修饰与待检测生物体系中所用的信号标记分子连接，通过还原剂与对应氧化剂在常温、常压及水环境下产生的活性自由基引发单体原位聚合，达到放大被检测物信号的目的。
一种氧化还原聚合辅助信号放大新方法，其特征是：将还原剂连接在待检测生物体系中所用的信号标记分子上，然后加入可与其产生活性自由基从而形成氧化还原对的氧化剂，并同时加入单体，对应的氧化剂还原剂组成可通过反应产生的活性自由基引发单体原位聚合，放大被测物质信号，达到裸眼检测的目的。
在加入单体和氧化剂的时候还可加入交联剂，交联剂用量微量，相对于单体的物质的量为0.5-2％。
氧化剂、单体溶液直接滴加到与还原剂连接后的信号标记分子物质上。
所述的氧化还原聚合辅助信号放大方法的应用范围，其特征是：待检测生物分子为DNA序列片段或RNA序列片段或及其单点突变序列，或微量蛋白质。尤其可用于疾病相关微量DNA、RNA序列片段或及其单点突变序列，或疾病相关微量蛋白质。
还原剂如富含羟基类聚合物物质或维生素C，对应的可产生活性自由基的氧化剂为四价铈盐、过氧化氢，在室温、常压、水溶液，在极其温和的条件下即可产生自由基，可进一步引发单体进行聚合。
富含羟基类聚合物物质组成，结构中富含大量活性氨基及羟基的富含羟基类聚合物物质，或人工合成的重复单元富含羟基的聚合物。
当还原剂为天然大分子物质壳聚糖时，其化学修饰的步骤包括如下：
(1)将生物素、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，其中N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)相对于生物素过量，(如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、和二环己基碳二亚胺(DCC)、相对于生物素按摩尔比1.1:1.1:1)，40-60℃(优选50℃)下反应至少24h，然后趁热过滤，向滤液中加入大量无水乙醚，搅拌至白色沉淀不再明显出现时将之放入冰浴中静止至少2h后过滤，收集得到白色沉淀，再将以上粗产物置于热的异丙醇中搅拌溶解后置于冰箱中，过滤收集结晶，再次重结晶后真空干燥，得到末端NHS化的生物素；
(2)将壳聚糖分散在DMSO溶液中，加入单元糖摩尔当量1-10％(优选5％)的生物素活性酯，并加入与活性酯相同摩尔当量的无水三乙胺，室温下搅拌至少48h，所得粗产物用渗析袋在乙酸水溶液中渗析，渗析未反应的小分子，待渗析至溶液透明时，再用去离子水充分渗析后冷冻干燥，得到生物素修饰的壳聚糖。
将上述生物素修饰的壳聚糖与末端生物素修饰的信号标记分子反应。在末端生物素修饰的信号标记分子物质上滴加链霉亲和素反应后，再滴加生物素修饰的壳聚糖进行反应，滴加生物素修饰的壳聚糖溶液可根据需要调节pH值进行优化。
本发明所述信号放大方法用于分子诊断具有以下优点：
(1)氧化还原聚合具有活化能低，引发聚合诱导期短，在室温或较低温度条件下亦可快速发生的优点，而且该类反应不需要加入额外能量，一定量的氧化剂和还原剂混合在一起就能引发单体聚合，从而使分子诊断过程方便、快捷；
(2)经由氧化还原聚合辅助信号放大方法对生物分子进行检测，可以达到裸眼分辨的效果。
附图说明
图1本发明所述分子诊断中分子识别部分组成示意图，其中，末端巯基修饰的捕获探针直接固定于金表面上，通过分子杂交反应与待检测的目标探针连接，再与末端标记有信标分子的信标探针通过分子杂交反应连接。
图2本发明所述的壳聚糖-硝酸铈铵氧化还原聚合辅助信号放大体系用于p53基因特征序列检测的示意图、结果及其薄膜厚度表征；
其中，图示依次为：
a、金表面+捕获探针+互补序列+链霉亲和素(SA)+生物素修饰壳聚糖(CS-biotin)+聚合点样液；
b、金表面+捕获探针+非互补序列+链霉亲和素(SA)+生物素修饰壳聚糖(CS-biotin)+聚合点样液；
c、金表面+捕获探针+互补序列+生物素修饰壳聚糖(CS-biotin)+聚合点样液；
d、金表面+捕获探针+链霉亲和素(SA)+生物素修饰壳聚糖(CS-biotin)+聚合点样液。
图3本发明所述的壳聚糖-硝酸铈铵氧化还原聚合辅助信号放大体系用于检测不同浓度的目标p53基因特征序列的结果及其薄膜厚度表征图。
图4本发明所述的壳聚糖-硝酸铈铵氧化还原聚合辅助信号放大体系用于p53基因特征序列单碱基突变检测的示意图。
图5本发明所述的壳聚糖-硝酸铈铵氧化还原聚合辅助信号放大体系用于p53基因特征序列单碱基突变检测的表面聚合物薄膜厚度表征图。
图6本发明所述的壳聚糖-硝酸铈铵氧化还原聚合辅助信号放大体系用于p53基因特征序列单碱基突变检测的表面结果图，上为单碱基错配DNA序列，下排为全互补DNA序列。
图7本发明所述的生物素修饰大分子壳聚糖的核磁氢谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：壳聚糖-硝酸铈铵氧化还原聚合辅助信号放大体系对p53基因特征序列及非互补序列检测对照实验
(1)称取生物素(1mmol，2.44g)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(1.1mmol，1.26g)和二环己基碳二亚胺(DCC)(1.1mmol，2.26g)溶于50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，50℃下反应24h。趁热过滤除去白色沉淀后，向滤液中加入大量无水乙醚，搅拌至白色沉淀不再明显出现时将之放入冰浴中静止2h后过滤，收集得到白色沉淀。再将以上粗产物置于热的异丙醇中搅拌溶解后置于冰箱中，过滤收集结晶。重复以上步骤得到白色固体，真空干燥即得末端NHS化的生物素，产率70％。
(2)粘均分子量为50万的壳聚糖分散在DMSO溶液中，配制成10mg/mL的分散液，加入单元糖当量5％的生物素活性酯，并加入与活性酯相同当量的无水三乙胺，室温下搅拌48h。所得粗产物用截留分子量为14000的渗析袋在1％的乙酸溶液中渗析，待渗析至溶液透明时，再用去离子水充分渗析后冷冻干燥，得到富含羟基的生物素修饰壳聚糖CS-biotin。
(3)超声清洗后的金基片在室温下用浓硫酸：双氧水(v/v＝7:3)浸泡1h后晾干，于4℃用10uM的5’末端巯基修饰的捕获探针DNA点样3uL，过夜反应，清洗干燥后用100ug/mL的BSA溶液于室温下浸泡30min后干燥。在上述基片上分别点样目标探针浓度为1uM的杂交点样液(点样液组成：5XSSC，20％去离子甲酰胺)3uL，42℃下分别反应80min后清洗干燥，再点样信标探针浓度为5uM的杂交点样液(点样液组成：5XSSC，20％去离子甲酰胺)3uL，25℃下分别反应80min后清洗干燥，再点样0.1mg/L的链霉亲和素(SA)溶液3uL，4℃下反应1.5h，清洗干燥后点样pH为5.0的1mg/mL的50万分子量CS-biotin3uL，4℃下分别反应2h后清洗干燥，然后点样含有氧化剂的单体溶液3uL(溶液组成：2mol/L的丙烯酰胺，0.025mol/L的PEGDA，0.01mol/L的硝酸铈铵)，37℃下分别反应2h后清洗干燥。
所述捕获探针序列为(5’-3’)：CCGGTTCATGCCGCCCAT-SH；
所述目标探针序列为:(5’-3’)：
(1)完全互补序列：ATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTC；(该序列为p53基因特征DNA序列片段)；
(2)不互补序列(对照实验)：AATGTATGATGTGGTTAGACCGTTAAGATT；
所述信标探针序列为(5’-3’)：Biotin-GAGGATGGGTCT；
所述杂交液中SSC溶液的配制，常常配制为20xSSC(pH＝7.6)的母液，使用时进行稀释。20xSSC(pH＝7.6)的配制：称取17.53g氯化钠及8.82g柠檬酸钠溶于80mL去离子水，调节溶液pH至7.6后，定容至100mL后，高温高压灭菌，冷却至室温保存。
a、为本发明的放大效果：金表面+捕获探针+互补序列+链霉亲和素(SA)+生物素修饰壳聚糖(CS-biotin)+聚合点样液；见图1，说明本发明方法可以用于DNA的检测。
b、对比情况1：金表面+捕获探针+非互补序列+链霉亲和素(SA)+生物素修饰壳聚糖(CS-biotin)+聚合点样液；见附图1，说明本方法检测特异性好，可以很灵敏的检测出目标分子，而不能检测出非目标分子。
c、对比情况2：金表面+捕获探针+互补序列+生物素修饰壳聚糖(CS-biotin)+聚合点样液；本对照缺少链霉亲和素(SA)，即未能将分子识别部分与信号放大部分连接在一起，辅助说明在本发明中，如果还原剂不能成功连接，则不能进行信号放大。
d、对比情况3：金表面+捕获探针+链霉亲和素(SA)+生物素修饰壳聚糖(CS-biotin)+聚合点样液。说明金表面及捕获探针不会产生实验噪声。
实施例1结果及表征见说明书附图2。
实施例2：壳聚糖-硝酸铈铵氧化还原聚合辅助信号放大体系对不同浓度p53基因特征DNA目标序列的检测
(1)同实施例1步骤(1)。
(2)同实施例1步骤(2)。
(3)超声清洗后的金基片在室温下用浓硫酸：双氧水(v/v＝7:3)浸泡1h后晾干，于4℃用10uM的末端巯基修饰的捕获探针DNA点样3uL，过夜反应，清洗干燥后用100ug/mL的BSA溶液于室温下浸泡30min后干燥。在上述基片上分别点样不同浓度目标探针的杂交点样液(点样液组成：5XSSC，20％去离子甲酰胺)3uL，42℃下分别反应80min后清洗干燥，再点样信标探针浓度为5uM的杂交点样液(点样液组成：5XSSC，20％去离子甲酰胺)3uL，25℃下分别反应80min后清洗干燥再点样0.1mg/L的SA溶液3uL，4℃下反应1.5h，清洗干燥后点样pH为5.0的1mg/mL的50万分子量CS-biotin3uL，4℃下分别反应2h后清洗干燥，然后点样含有氧化剂的单体溶液3uL(溶液组成：2mol/L的丙烯酰胺，0.025mol/L的PEGDA，0.01mol/L的硝酸铈铵)，37℃下分别反应2h后清洗干燥。
所述捕获探针序列为(5’-3’)：CCGGTTCATGCCGCCCAT-SH；
所述目标探针序列为(5’-3’)：ATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTC；(该序列为p53基因特征DNA序列片段)；
所述信标探针序列为(5’-3’)：Biotin-GAGGATGGGTCT；
实施例2结果及表征见说明书附图3，说明本发明涉及的信号放大方法对DNA的检测限为0.05nM。
实施例3：壳聚糖-硝酸铈铵氧化还原聚合辅助信号放大体系对p53序列单碱基突变的检测
(1)同实施例1步骤(1)。
(2)同实施例1步骤(2)。
(3)超声清洗后的金基片在室温下用浓硫酸：双氧水(v/v＝7:3)浸泡1h后晾干，于4℃用10uM的末端巯基修饰的捕获探针DNA点样3uL，过夜反应，清洗干燥后用100ug/mL的BSA溶液于室温下浸泡30min后干燥。在上述基片上分别点样不同浓度的待测目标探针杂交点样液(点样液组成：5XSSC，20％去离子甲酰胺)3uL，42℃下分别反应80min后清洗干燥，再点样信标探针浓度为5uM的杂交液3uL，25℃下分别反应80min后清洗干燥，再点样0.1mg/L的SA溶液3uL，4℃下反应1.5h，清洗干燥后点样pH为5.0的1mg/mL的50万分子量CS-biotin3uL，4℃下分别反应2h后清洗干燥，然后点样含有氧化剂的单体溶液3uL(溶液组成：2mol/L的丙烯酰胺，0.025mol/L的PEGDA，0.01mol/L的硝酸铈铵)，37℃下分别反应2h后清洗干燥。
所述捕获探针序列为(5’-3’)：CCGGTTCATGCCGCCCAT-SH；
所述目标探针序列为(5’-3’)：
(1)全互补序列：ATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTC；
(2)单碱基突变序列：ATGGGCGGCATGAACCGGAGACCCATCCTC；
所述信标探针序列为(5’-3’)：Biotin-GAGGATGGGTCT；
实施例3结果及表征见说明书附图5及附图6。说明本发明所涉及的信号放大方法可以检测p53基因的单碱基突变，且检测限达到0.1nM。

Claims (10)

1.一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：将还原剂连接在待检测生物体系中所用的信号标记分子上，然后加入可与其产生活性自由基从而形成氧化还原对的氧化剂，并同时加入单体，对应的氧化剂还原剂组成可通过反应产生的活性自由基引发单体原位聚合，放大被测物质信号。
2.按照权利要求1的一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：在加入单体和氧化剂的时候还加入交联剂，交联剂用量微量，相对于单体的物质的量为0.5-2％。
3.按照权利要求1或2的一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：氧化剂、单体溶液直接滴加到与还原剂连接后的信号标记分子物质上。
4.按照权利要求1或2的一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：待检测生物分子为DNA序列片段或RNA序列片段或及其单点突变序列，或微量蛋白质。尤其可用于疾病相关微量DNA、RNA序列片段或及其单点突变序列，或疾病相关微量蛋白质。
5.按照权利要求1或2的一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：还原剂为富含羟基类聚合物物质或维生素C，对应的可产生活性自由基的氧化剂为四价铈盐、过氧化氢。
6.按照权利要求1或2的一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：富含羟基类聚合物物质组成，结构中富含大量活性氨基及羟基的富含羟基类聚合物物质，或人工合成的重复单元富含羟基的聚合物。
7.按照权利要求1或2的一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：当还原剂为天然大分子物质壳聚糖时，其化学修饰的步骤包括如下：
(1)将生物素、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，其中N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)相对于生物素过量，40-60℃(优选50℃)下反应至少24h，然后趁热过滤，向滤液中加入大量无水乙醚，搅拌至白色沉淀不再明显出现时将之放入冰浴中静止至少2h后过滤，收集得到白色沉淀，再将以上粗产物置于热的异丙醇中搅拌溶解后置于冰箱中，过滤收集结晶，再次重结晶后真空干燥，得到末端NHS化的生物素；
(2)将壳聚糖分散在DMSO溶液中，加入单元糖摩尔当量1-10％的生物素活性酯，并加入与活性酯相同摩尔当量的无水三乙胺，室温下搅拌至少48h，所得粗产物用渗析袋在乙酸水溶液中渗析，渗析未反应的小分子，待渗析至溶液透明时，再用去离子水充分渗析后冷冻干燥，得到生物素修饰的壳聚糖。
8.按照权利要求7的一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)和生物素的摩尔比1.1:1.1:1。
9.按照权利要求1或2的一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：将上述生物素修饰的壳聚糖与末端生物素修饰的信号标记分子反应。
10.按照权利要求1或2的一种氧化还原聚合辅助信号放大方法，其特征在于：在末端生物素修饰的信号标记分子物质上滴加链霉亲和素反应后，再滴加生物素修饰的壳聚糖进行反应，滴加生物素修饰的壳聚糖溶液可根据需要调节pH值进行优化。
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