TW201107752A

TW201107752A - Signal amplification microspheres, their use in one-step and multi-step analytical amplification procedures and methods for their production

Info

Publication number: TW201107752A
Application number: TW099118868A
Authority: TW
Inventors: Wing-Cheung Mak; Ling-Wai Wong; Pui-Yee Cangel Chan; Reinhard Renneberg
Original assignee: Dna Supernova Ltd
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2011-03-01
Also published as: CN102803962A; BRPI1014765A2; KR20120027332A; GB201120657D0; GB0910010D0; US20120171747A1; ES2528970T3; CN102803962B; GB2483393A; US20160047802A1; CA2763852A1; AU2010258403A1; GB2470939A; US9151748B2; WO2010142960A1; JP2012529644A; EP2440926B1; EP2440926A1; US10048257B2

Description

201107752 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種蛋白質微球’包含蛋白質載體分子及訊號前驅物分子，及其生產方法’並關於此種蛋白質微球在體外生物分析的用途，用於檢測樣本中的標的物質。本發明亦關於一種改善使用檢測技術的體外生物分析的靈敏度層級的方法，該檢測技術包括光學、磁性、電化學或化學方法、但不限於此。並提供一種檢測方法、直接及有效的序列訊號放大方法、及各種測試套組。【先前技術】將本發明的蛋白質微球應用於生物分析的領域時，該蛋白質微球載持供專一性辨識及結合於樣本中的標的分子的表面親和性分子。例如酵素連結免疫分析法（ELISA)、放射性免疫分析（RIA )、螢光免疫分法（f I a )、免疫凝集分析，或DNA、RNA或基因體分析法等生物分析法，在學術研究、人類及獸醫診斷領域、法醫診斷、環境分析、食品分析及對於空氣或水中的危險物質的生物防禦篩檢的檢測中，為週知且扮演重要角色。生物分析係基於至少1種經標記的生物分子與欲檢測的分析物（標的）的交互作用。該標記為使該交互作用，，可見化”的工具。已知有不同種類的標記，且在上述各種技 t中賦予其名.EL j SA中的酵素、以A中的放射性同位素、中的螢光團’或西方墨點、南方墨點或北方墨點用的專-性標記。其他標記類型，包括微脂體、免疫凝集分析 201107752 中的乳膠粒子，及染料、媒介劑、金粒子。 ^物分析最重要的要件為分析專—性及分析靈敏度。二：專-性係利用親和性分子或生物辨識分子決定，例如 ::的結合位與其抗原(分析物)或二互補核酸股的雜交之口。生物分析的分析靈敏度也受生物辨識分子所影響， =其與標的物質間的生物交互作用的親和性常數所致。己作用為一標誌(marker)，指示在該標的及該親和性刀子門已發生反應，且能以不同的技術湏4量： (i)光學性，測量染料的吸光度或營光團發出的營光，或由冷光或化學冷光化合物發出的冷光，或測量由凝集的乳膠分子的光散射造成的混濁度； (i i)放射活性，測量放射性同位素； (1 11 )電化學性，測量媒介物或電活性物質；或 (iv)磁性，測量磁力； (v)壓電性（piezoeiectricai iy)，測量質量的改變。放射性免疫分析使用放射性同位素作為標記，許多人仍涊為其係最靈敏的方法。此非常有力的技術於丨959年由 Yalow及Berson引進，代表分析化學、診斷及醫藥的一個新時代。然而，此技術具有對人類及環境有害污染的風險之缺點，因為使用了放射性同位素，而無法完全避免。同時’已有人開發非放射性方法，且經改良後目標達到可匹敵的分析靈敏度。基於螢光、冷光及吸收光譜的光學方法’光學方法的重要性隨時間更加重要且仍在成長。 ELISA技術使用酵素作為標總（marker)以放大訊號。 201107752 於貫施此生物分析後，藉由一酵素標誌分子產生高量$牙分子，將分析物與探針間的生物交互作用放大。酵可使用像葡萄糖氧化酶（G 〇 D，E c i. i 3 · 4)、鹼性碟解酶》（二 EC3. 1.3.1)或過氧化酶（p〇D，EC1U17)，其週轉數分另,P 為每秒（^)2000個基質分子、每秒（s-1)5〇〇〇個受質分刀子別

每秒（moooo個受質分子。ELISA技術的缺點為程序涉及步驟多’且基質的培育費時。 V 螢光方法也已在生物分析使用了許多年，且持續受高度關注。所有螢光系技術確保良好的靈敏度’及10-8〜1(Γ1ΓΜ 的低檢測界限。特別的技術例如”時間解析螢光（time resolved flU0rescence)” 、化學或生物冷光或基於提供刀子（donor)及接受分子（accept〇r)間的能量轉移的技術，可達10 15〜1〇-、的低檢測界限。先前技術已知的螢光免疫分析，使用具反應性官能性連結基團的低分子量螢光標記（s〇UTHWICK，p.L , etal.，

Cytometry, 11，pp. 41 8-430，1 990, MUJUMDAR, R. B.，et al., Bioconjugate Chemistry, 4, pp. 105-111, 1993, MUJUMDAR, R. β. et al., Cytoraetry, 10, pp. 11-19, 1 989)、勞光及染料有色粒子（美國專利號US48371 68及 US6 01 3531 ’及國際專利申請案號w〇95/08772)或螢光團突出的樹枝狀聚合物（DE 1 970371 8)。亦已知採用承載標誌的微脂體於免疫分析中放大訊號 (美國專利號 US 5756362、US4874710 及 US470301 7)。實務上’此等方法的靈敏度受限於能以可溶形式包入微脂體 6 201107752 的標Ί志物質的量體的穩定度有限使用標記的微脂體的另一缺點為，微脂敏度生物分析的開發中，達到非常高的分析靈 "要分析靈敏度定義為對於分析物濃卢的某-=的訊號回應的程度（校正曲線的斜率）。於^化學確二析或料性分析_，分析靈敏度均旦衫日分析靈敏度的另外2個因子為決定所需的樣本 !’及針對結果的整個反應時間。樣本體積愈大，整個反應時間愈長，能被檢測及測量的分析物的濃度愈低。然而，於許多實務情形，並不能獲得足夠體積的樣本（例如，於藥學研究）或成本分佈在非常大體積的樣本中（例如乳類中的抗生素殘留或空氣中的生物防禦性物質）。因此，關鍵的挑戰在於在可得的小樣本體積濃度中檢測及/或決定非常少量的物質，或在大樣本體積中檢測及/或決定非常低濃度分佈的物質。結果’應用的技術必需要有高分析靈敏度，尤其在非常低的濃度範圍。為了使各種已知技術的分析靈敏度可以客觀地於非常低的濃度範圍比較，CLSIC美國的Clinical and Laboratory Standards Institute及/或NCCLS)已使用3個用語定義分析靈敏度：空白界限（Limit of Blank，LoB))、檢測界限（Limit of Detection，LoD)，及定量界限（Limit of Quant i tat ion，LoQ)。針對此等參數的資料被評估，並用 201107752 於在不同的技術之間比較。為了達到高分析靈敏度，已開發出不同的生物標記系統以作用於訊號放大’例如酵素生物標記、有機微晶體生物標記，及膠體金標記等。於酵素標記系統，酵素分子將受質轉變為具有光學或 f化學性質的產物。由於高週轉率，例如辣根過氧化酶 aiofse radish peroxidase)，或由於非常大的線性酵素反應，例如鹼性磷解酶，可生成大量的產物（訊號）而達成放大。另一方法為所謂的”酵素循環”技術，放大檢測訊號而改善分析靈敏度。於歐洲已公開專利申請案號EPi 309867揭示一種利用況號產生物質的固體粒子的新型標記。在每個固體粒子中存在的數十億的訊號產生分子，在曝露於釋放藥劑時可被立即釋出，創造出”超級新秀效應，’。酵素系統的訊號放大原理，係基於轉變酵素基質以產生訊號’釋放到巨觀相（bu 1 k phase)。固體粒子系統的訊號放大原理’係基於產生及釋放大量訊號分子到反應室的巨觀相。然而，釋放訊號分子到巨觀相會造成訊號分子濃度的部分稀釋，並影響分析靈敏度。亦已知一種使用膠體金標記的訊號放大生物分析法。 Taton 等人（T. Andrew Taton, Chad A, Mirkin，Robert L. Letsinger, “Scanometric DNA Array Detection with

Nanoparticles Probes” ， Science, 289(8)， 1757-1760, 201107752 2_)報告-種訊號放大方法，係基於膠體金再以銀強化，其中，該膠體金促進將銀（1)還原到金粒子表面上，使大量的銀金屬累積在膠體金標記上。該銀強化的方法可檢測低達5奈莫耳（nanom〇ie)/公升的濃度的寡核苷酸。另-使用膠體金標記於放大的生物分析法，係基於膠體金的生物親和性引起的凝集，其造成顏色由紅變藍，而可以肉眼觀察。該生物親和性引起的凝集方法，可在1〇罪莫耳（femt〇m〇le)/公升的濃度水平檢測寡核苦酸。膠體金標記的訊號放大原王里’係基於使訊號分子累積或凝集成一濃縮的小體積。與上述標記系統的訊號放大能力相比，利用訊號分子累積-由另一親和性分子固定_在一固相載體 (例如一側向流裝置）上的一目標區域的膠體金放大系統，可達到高分析靈敏度。【發明内容】本發月之具體例提供一種檢測樣本中標的分子的方法’其確保優異的分析靈敏度、低檢測界限，及選擇地，利用重覆性循環放大，侬；^ & # & & _ u 象人佤序進仃程序，進一步強化該檢測訊號。此方法與已知的方法相當不同。本發明另一具體例提供各種測試套組，用於在研究及診斷領域中以光學性、電化學性或化學性檢測標的分子。本發月又另一具體例提供經標記的生物分子，其能可靠地製備且可廣泛應用在生物分析，較佳在人類及獸醫診斷領域、法醫診斷、環境分析、食品分析、生物防禦篩選、 DNA、RNA或基因體研究及診斷。 201107752 【實施方式】 [定義] 親和性/生物辨識分子親和性分子為辯B击 έ識並且專—性地以—定的親和力r却和性/結合性當勃* 疋的覜和力（親吊數）以其結構或其物質的物質。 a具電付結合於另一有許多不同的親和性分 f # ffl r,, 子其可—般性地與特定類型的物貝使用（例如，對抗體的Pr〇tein A/G)，或僅對一物質非常專—Γ你子抗原的抗體、對另一序列的DNA序列、或對生物素的卵白素、 ’、十其基質的某些酵素）。載體蛋白載體蛋白主要涉及海綿狀微膠囊的形成，由打開胞内雙硫鍵，接著容許自組形成分子間及分子類硫鍵；該分子間雙硫鍵負責該蛋白質微球的結構完整性。可使用的栽體蛋白的例子，包括：纖維狀蛋白質(例如，細胞骨架、胞外基體蛋白質，等） -球狀蛋白質可由血清及血漿分離（例如，血紅素蛋白、運送蛋白、DNA結合蛋白等） -脂蛋白 -糖蛋白 -免疫系統蛋白質（例如單株抗體及多株抗體、抗原等） -重組蛋白 -基因改造蛋白 10 201107752 -化學修飾蛋白 -合成蛋白 -各種蛋白的混合物 -營養素蛋白（例如貯存蛋白、運送蛋白等） -酵素 •核糖酵素一般而言，可使用任何人類、動物及植物來源的含硫的蛋白質或含硫的胜肽（包含合成胜肽）。訊號放大才曰任何在2種以上物質/反應伙伴間的反應造成物理化學可測量的訊號。在多數If形，免疫化學及水解反應的訊號太過微弱以致於必需在測量前放大該訊號以便解讀結果。該放大可利用各種方法及技術實施。本發明提供使用訊號放大微球的單步驟及多步驟的放大私序EP1 309867揭示於多步驟放大程序的一變化形式，至少-個放大循環可使用膠囊，其包覆產生訊號的有機物質的固體粒子且於表面載持供專一性辨識並結合至標的分子的親和性分子，其揭示納入於此作為參照。微球本發明的微球不具有固型邊界，且可比作是有孔洞延伸到内4的海綿球。該微球為以共價連結在一起的蛋白質分子網絡。 X微球的形成係藉由於一新鮮的沉澱模板中吸附結合 11 201107752 或共"L澱及打開分子内的雙硫鍵。得到的游離硫醇基接著令料成新的分子間及分子内雙硫鍵，該分子間雙硫鍵貢獻於微球的形成。言玄等微球具有同質結構，且不像以層層相疊的技術例如EPl3〇9867揭示的技術所形成的膠囊。該^^球直彳φ 1 Π 1 丨於，較佳為400nm~l〇 # m。雖然此等限值至少右邱八岔+ 夕有。卩刀洛在微米範圍外，為求便利’在此

仍使用”微球”來指太1 ηη & = L I i曰本發明的蛋白質分子的網絡形成的分離的粒子。訊號放大微球訊號放大微球係由載體蛋白+訊號前驅物分子+親和性分子所組成的微球。該訊號放大微球的表面具有對於一待決定的物質（標的或分析物）的專一性結合的特徵。基體形成物質基體形成物質係例如碳酸鈣、海藻酸鈣、多孔質矽土、寡糖或多醣例如葡聚糖等材料，與載體蛋白及/或訊號前驅物分子混合，經共沉澱形成微球模板。還原試劑該還原試劑為造成微球模板中蛋白質分子的分子内雙硫鍵打開的材料。還原試劑的一例為二硫蘇糖醇 (Di thiothrei tol » DTT) ° 基體移除試劑基體移除試劑為例如螯合劑（EDTA)、酸或鹼等材料，用於從微球模板移除基體形成物質，留下蛋白質微球。 12 201107752 訊號前驅物分子訊號前驅物分子係當與1種以上其他試劑反應時’形成一可測量訊號的分子。該訊號前驅物分子可為直接型或間接型。於直接訊號前驅物的情形，該訊號前驅物分子在活化時本身改變以產生欲檢測的訊號。在間接訊號前驅物的情形，該訊號前驅物與另一物質在活化時反應，且此另一物質可能負責產生欲檢測的訊號。該訊號前驅物分子可為低分子量訊號前驅物分子或高分子量訊號前驅物分子。低分子量訊號前驅物分子該訊號前驅物分子可為選自由以下構成之群組的低分子量物質：螢光團（f luoroph〇re)及其衍生物、冷光團 (luminophore)及其衍生物、發色團（chromophore)及其衍生物、假肢（prosthetic)基團，或選自氧化還原（redox) 原活性物質、電極活性物質。高分子量訊號前驅物分子高分子量訊號前驅物分子包括選自由以下構成之群組的高分子量物質：酵素及其前驅物、生物生冷光性及生螢光性蛋白質及核糖酵素；選自以下所構成之群組的胜肽或蛋白質.抗體’包括單株抗體及多株抗體、受體、抗原、重組蛋白質、凝集素、卵白素、脂蛋白及糖蛋白、核酸、核糖酵素及核酸適體（aptamer)，但不限於此。有非常多來自不同化學類型的不同物質會經由一起始反應而得到一可測量的訊號。該可測量的訊號可基於： -螢光測量 13 201107752 -冷光測量 -於紫外光、可見光及近紅外光範圍的顏色變化 -氧化還原電位的改變 -由於形成複合體或沉澱使質量改變標的分子此用語與”分析物，’同義，意指於一分析程序例如免疫分析中’決定的物質或化學成分。於第一態樣’本發明提供一種微球，包含一與訊號前驅物分子結合的載體蛋白，其中’該訊號前驅物分子為可活化以產生一可檢測的訊號，而同時維持與該載體蛋白結合。於一具體例中’該微球為雜合物或異質粒子，竟指該載體蛋白及該訊號前驅物分子為不同。於另一 1體例中，該微球為同質粒子，意指該載體蛋白及該訊號前驅物分子相同。如上所述，該訊號前驅物分子可為直接型或間接型。於直接訊號前驅物的情形’該訊號前驅物分子在活化日夺本身改變以產生欲檢測的訊號。在間接訊號前驅物的情开》，該訊號前驅物與另一物質在活化時反應，且此另_物質可能負責產生欲檢測的訊號。較佳者，該載體蛋白係選自纖維狀蛋白質，包括伸不限於，細胞骨架蛋白或胞外基體蛋白；或球狀蛋白， ^ 巴枯但不限於，血液蛋白、血紅素蛋白、細胞黏著蛋白.戋運送蛋白、生長因子、受體蛋白、DNA-結合蛋白、兄役糸統 14 201107752 蛋白’包括但不限於’單株抗體、多株抗體、營養素貯存/ 運送蛋白、護衛蛋白或酵素；或基因改造蛋自；或重組蛋白或化予修飾蛋白及合成蛋白。更較佳為該載體蛋白為血液中循環的蛋白f ’例如胎牛血清白蛋白。此蛋白質廣泛使用在生化應用，包括ELISA及免疫墨點法。其具有Z 好的穩定性，由於可從家畜產業的副產物，牛血，輕易地大量純化，故可低成本取得。該訊號前驅物分子可為選自由以下構成之群組的低分子里物質：螢光團及其衍生物、冷光團及其衍生物、發色團及其衍生物、假肢（Pros the tic)基團，或選自氧化還原媒介物的氧化還原活性物質、電極活性物質。較佳者，低分子量訊號前驅物分子為螢光團，例如：營光素、花青（cyanine)、羰花青（carbocyanine)、若丹明 (rhodamine)、咕噸、重氮系螢光物質，及小螢光芳香族及雜芳香族分子。或者’該低分子量訊號前驅物分子為發色團，例如： °比 °坐琳蜩（Pyrazolone) ' 蒽醌（anthraquinone)、類胡蘿蔔素及重氮（diazo)及單偶氮（monoazo)、卩萼畊（oxazine)、彀類或核黃素系染料物質。最佳者，該低分子量訊號前驅物分子為螢光素衍生物’例如：螢光素二乙酸酯（FDA)、螢光素二乙酸酯異硫氰酸醋（FDA-異硫氰酸酯）、螢光素二乙酸酯馬來醯亞胺（FDA一馬來醯亞胺）。高分子量蛋白質訊號前驅物分子，包括但不限於選自 15 201107752 以下所構成群組的高分子量物質：酵素及其前驅物、生物生冷光性（bioUminogenic)及生螢光性（f iuorogenic)蛋白質及核糖酵素；選自以下所構成之群組的胜肽或蛋白質：抗體，包括單株抗體及多株抗體、受體、抗原、重組蛋白質、凝集素、卵白素、脂蛋白及糖蛋白、核酸、核糖酵素及核酸適體（aptameiO。較佳者’高分子量訊號前驅物分子為親和性分子，例如.胜肽及蛋白質、核酸股、碳水化合物、小分子量的配體，及分子銘刻聚合物（molecular imprinted p〇lymer， MIP)或上述之混合物。或者，該高分子量訊號前驅物分子可為酵素，例如：過氧化酶、氧化還原酶（〇xid〇reductase)、接合酶 (ligase)、聚合酶及轉移酶。最佳者，該高分子量訊號前驅物分子為卵白素（avidin 及NeutrAvidin(註冊商標）。上述微球具有l〇nm~lmm的體積，較佳為4〇〇nm〜i〇#m 的體積。該微球的結構較佳為實質上均質；即，形成該微球刪在整個該粒子體為實質上均勾分散，及具㈣質上單一的密度及多孔性。 5亥微_球類似縮小的兔Lh -L' -L. B . ^ 邊界時，子， % j旳海綿或綿球，即便其具有可識別的，但仍並非具有界定邊界的固體外殼的膠囊。當該微球與親和性分子組合以結合到溶液中的標的此等親和性分子會附著到微球，該微球包括親和性分或該親和性刀子可能直接或經由連結分子接合或結合 16 201107752 '支求表面、或以吸附結合/附著。該連結分子包括但不限；物刀子，例如卵白素、键親和素' NeutrAvidi η(註冊商標）、Pr〇tein A、Pr〇tein G、凝集素（lectin)或低分子量父聯刀子。然而’有些親和性分子會擴散到微球内部，且在特別的情形，也會附著於微球内部。當然，此種擴散的仏度取決於該親和性分子的相對尺寸及該微球的孔徑。附著於該微球的親和性分子可為生物辨識分子，例如’專一的胜肽及蛋白質、核酸股、碳水化合物、小分子量的配體’及分子銘刻聚合物（ΜIP)或其混合物。該胜肽或蛋白可為：抗體，包括單株及多株抗體、受體、抗原、凝集素、卵白素、寡胜肽、脂蛋白、糖蛋白、胜肽荷爾蒙及過敏原或其部分。該核酸可為DNA、RNA、寡核普酸、核糖酵素、核酸適體（aptamer)及其部分。碳水化合物之例，包括單—、募-及多-醣、糖脂質、蛋白多糖及其部分。該低分子量配體可為生物素或生物素衍生物、類固醇或荷爾蒙、輔因子或輔酶、活化劑、抑制劑、偽基質 (pseudosubstrate)’ 或酵素的假肢基團（prosthetic)、藥物、過敏原或不完全抗原（hapten)。於第二態樣’本發明提供一種生產如此處定義之微球的方法，該微球包含：一與訊號前驅物分子結合的載體蛋白’其中，該訊號前驅物分子為可活化以產生一可檢測的訊號’而同時維持與該載體蛋白結合。本方法包括：將該載體蛋白與訊號前驅物分子及基體形成物質在溶液中攪拌混合’較佳在水溶液中；以攪拌添加小分子還原試劑；清 201107752 洗以移除該小分子還原試劑；以搜拌添加基體移除試劑；清洗以去除該基體形成物質，及留下與訊號前驅物分子結合的载體蛋白之微球。，佳者該方法於水溶液中以水性試劑實施，較佳在室溫。該混合的較佳方法，係以磁性攪拌器攪拌。基體形成物質的功能在於將蛋白質分子捕捉於微球模 a s基體形成物質可為碳酸鈣、海藻酸鈣、多孔性矽土 :寡-或多醣’例如葡聚糖。碳酸㈣佳為藉由添加碳酸納載體蛋白、汛號前驅物分子及氣化鈣於溶液狀態的混合物所形成。 —微球的尺寸可利用控制攪拌速度控制。微球的密度可糟由調整載體蛋白、訊號前驅物分子、基體形成物質及還原試劑的相對比例而調整。月j所述s玄微球可為雜合粒子，其中該載體蛋白及吞亥SfL號前驅物分义I ρτΐ λ.. 不同。或者’該載體蛋白及該訊號前驅〇同又同剛說明，該訊號前驅物可為直接或間接型。較佳者，該載體蛋白選自纖維狀蛋白於，細胞骨架蛋白或胞外基體蛋白；或球狀蛋白，二於血液蛋白、血紅素蛋白、細胞黏著蛋白；或運送蛋白、生長因子、受體蛋白、DNA-結合蛋白、免‘疫系統蛋白，包括但不限於單株抗體、多株抗體、營養素貯存/運送蛋白 '護衛蛋白或酵素；s戈基因改造蛋白；或重組蛋白或化學修飾蛋白及合成蛋白。更較佳為，該載體蛋白為循環在 18 201107752 血液中的蛋白質，例如胎牛血清該訊號前驅物分子可為選自由以下所八工旦此# 丨傅战之群組的低刀里物質：螢光團及其衍生物、冷光團及其衍生物、發色團及其衍生物、假肢（Prosthetic)基團，或選自氧化還原媒介物的氧化還原活性物質、電極活性物質。、較佳者’低分子量訊號前驅物分子為螢光團，例如：螢光素、花青素、羰花青（carbocyanine)、若丹明 (rhodamine)、咕噸（xanthene)、重氮系螢光物質及小螢光芳香族及雜芳香族分子。或者，該低分子量訊號前驅物分子為發色團，例如：吡唑啉酉同（pyraz〇l〇ne)、蒽醌（anthraquin〇ne)、類胡蘿萄素及重氮及單偶氮、噚畊（oxazine)、靛類或核黃素系染物質。木' 最佳者，該低分子量訊號前驅物分子為螢光素衍生物，例如：螢光素二乙酸酯（FDA)、螢光素二乙酸酯異^氰酸醋（FDA-異硫氰酸酷）或螢光素二乙酸醋馬來醯^胺 (FDA-馬來醯亞胺）。高分子量蛋白質訊號前驅物分子’包括但不限於，選自以下所構成群組的高分子量物質：酵素及其前驅物、生物生冷光性及生螢光性蛋白質及核糖酵素；選自以下所構成之群組的胜肽或蛋白質：抗體’包括單株抗體及多株抗體、受體、抗原、重組蛋白質、凝集素、卵白素、脂蛋白及糖蛋白、核酸、核糖酵素及核酸適。較佳者’咼分子量訊號前驅物分子為親和性分子，例 19 201107752 如：胜肽及蛋白質、核酸股、碳水化合物、小分子的配體，及分子銘刻聚合物（ΜIP)或上述之混合物。或者，該高分子量訊號前驅物分子可為酵素，例如：過氧化酶、氧化還原酶、接合酶、聚合酶及轉移酶。最佳者，該高分子量訊號前驅物分子為卵白素及 “111：^¥丨(1丨11(註冊商標）。該生產微球的方法，可更包含使親和性分子附著於該微球的表面。該親和性分子可利用例如凡得瓦力、氫鍵或靜電父互作用接合至微球的外表面，或可以直接或經由連結分子共價鍵結到該微球外表面，若為間接結合，該連接分子包括但不限於：生物分子，例如卵白素、鏈親和素、 NeutrAvidin(註冊商標）、Protein a、Pr〇tein G、凝集素或低分子量交聯分子。該親和性分子可在添加該基體移除試劑的步驟前添加到反應混合物中。典型的親和性分子可為生物辨識分子，例如：專一性胜肽及蛋白質、核酸股、碳水化合物、小分子的配體受體分子及分子銘刻聚合物（MIP)或其混合物。該胜肽或蛋白可為抗體，包括單株及多株抗體、受體、抗原、凝集素、卵白素、寡胜肽、脂蛋白、糖蛋白、胜肽荷爾蒙及過敏原或其部分。該核酸可為DNA、RNA、寡核苷酸、核糖酵素、核酸適體及其部分。碳水化合物之例，包括單-、寡-及多-醣、糖脂質、蛋白多糖及其部分。該低分子量配體可為生物素或生物素衍生物、類固醇或荷爾蒙、輔因子或輔酶、活化劑、抑制劑、假基質，或酵素的假肢 20 201107752 基團、藥物、過敏原或不完全抗原。第三態樣中，本發明提供一種訊號放大方法，使用微球檢測樣本中1種或以上的標的分子，該微球包含結合於訊號前驅物分子的載體蛋白，其中，該訊號前驅物分子為了活化以產生一可檢測的訊號，而同時維持與該載體蛋白 3且該微球具有親和性分子以供專一性辨識及表面結合至該標的分子，該方法包含： (a) 將該標的分子與該微球一起溫育； (b) 將在表面上有親和性分子_標的分子複合體的微球與沒有親和性分子—標的分子複合體的微球分離； (c) 以發展試劑處理上述經分離的表面具有親和性分子-標的分子複合體的微球，以活化該訊號前驅物分子，產生訊號，及 (Ο檢測或定量該訊號。由此所產生的訊號與樣本中的標的分子的量直接或間接相關。又，因為該訊號前驅物分子維持結合在該微球中且並未釋放到溶液中，該訊號被局部化。因此，該訊號未被稀釋。相反地，該訊號被放大，原因在於，對於在溫育步驟期間形成的各親和性分子-標的分子複合體，在活化步驟期間許多訊號前驅物分子被活化。較佳者，該載體蛋白係選自纖維狀蛋白質，包括但不限於’細胞骨架蛋白或胞外基體蛋白；或球狀蛋白，包括但不限於血液蛋白、血紅素蛋白、細胞黏著蛋白；或運送蛋白、生長因子、受體蛋白、DNA-結合蛋白、免疫系統蛋 21 201107752 白包括但不限於單株打a 蛋白、護衛蛋白或酵素.或=㈣、#養切存/運送化學修飾蛋白及合成蛋白乂蛋白；或重組蛋白或在血液中的更較佳為，該載體蛋白為循環液中的蛋白質’例如胎牛血清白蛋白。該訊號前驅物分子可发、登量物質.n _ .，、，、自以下所構成群組的低分子重物質.螢光團及其衍生物卞及苴彳, 團及其何生物、發色團及，、何生物、假肢（㈣sthetlG)基團介物:氧化還原活性物質、電極活性物質。’化還原媒、·較佳者，低分子量訊號前驅物分子為榮光團，例如：螢光素H幾花青、若丹明、㈣、重氮系螢光物質，及小螢光芳香族及雜芳香族分子。或者，該低分子量訊號前驅物分子為發色團，例如：匕坐啉酮、恩醌 '類胡蘿蔔素及重氮及單偶氮、噚哄 (oxaz i ne)、靛類或核黃素系染料物質。最佳者，該低分子量訊號前驅物分子為螢光素衍生物例如，螢光素二乙酸酯（FDA)、螢光素二乙酸酯異硫氰酸醋（FDA—異硫氰酸S旨）或f光素二乙SUi馬來醯亞胺 (FDA-馬來醯亞胺）。向分子量蛋白質訊號前驅物分子，包括但不限於選自以下所構成群組的高分子量物質：酵素及其前驅物、生物生冷光性及生螢光性蛋白質及核糖酵素；選自以下所構成之群組的胜肽或蛋白質：抗體，包括單株抗體及多株抗體、文體、抗原、重組蛋白質 '凝集素、卵白素、脂蛋白及糖蛋白、核酸、核糖酵素及核酸適體（aptamer )。 22 201107752 較佳者’高分子量訊號前驅物分子為親和性分子，例如：胜肽及蛋白質、核酸股、碳水化合物、小分子的配體，及分子銘刻聚合物（MIP)或其混合物。或，該高分子量訊號前驅物分子可為酵素，例如：過氧化酶、氧化還原酶、接合酶、聚合酶及轉移酶。最佳者’該高分子量訊號前驅物分子為卵白素及 NeutrAvidin(註冊商標）。該親和性分子可為生物辨識分子，例如：胜肽、蛋白質、核酸、碳水化合物、小分子的配體，受體及分子銘刻聚合物（ΜIP)或上述之混合物。該胜肽或蛋白可為：抗體，包括單株及多株抗體、受體、抗原、凝集素、卵白素、寡胜肽、脂蛋白、糖蛋白、胜肽荷爾蒙及過敏原或其部分。該單股核酸可為MA、rna、寡核苷酸、核糖酵素、核酸適體及其部分。碳水化合物之例，包括單_、募-及多-醣、糖脂質、蛋白多糖及其部分。該低为子量配體可為生物素或生物素衍生物、類固醇或荷爾蒙、辅因子或輔酶、活化劑、抑制劑、假基質，或酵素的假肢基團、藥物、過敏原或不完全抗原。上达微球的特別較佳的形式為，其中該載體蛋白為胎牛血清白蛋白（BSA)，及該訊號前驅物分子為選自螢光素二乙酸酯（FDA)、螢光素二乙酸酯異硫氰酸酯（F])A_異硫氰酸醋）或榮光素二乙酸酯馬來醯亞胺（FDA_馬來醯亞胺）。發展試劑適於在活化步驟中，，活化”此等螢光素衍生物，例如經由化學反應，例如鹼性試劑，或經由生化反應，例如酯 23 201107752 解酶，將其轉變為螢光素，因而產生可檢測的訊號。或者，該活化步驟可利用物理手段進行，例如微波加熱。於第四態樣，本發明提供另一訊號放大方法，使用微球以檢測樣本中i種或以上的標的分子，該微球包含W 至第1訊號前驅物分子的-載體蛋白，其中，肖第i訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號而仍然維持結合於載體蛋白’且該微球具有親和性分子供專一性辨識並結合該標的分子於其表面，該方法包含： (a) 將該標的分子與該微球一起溫育； (b) 將在表面上有親和性分子_標的分子複合體的微球與沒有親和性分子-標的分子複合體的微球分離； (c) 以釋放試劑處理上述經分離的表面上具有親和性分子-標的分子複合體的微球，使該微球解體，釋放該第j 訊號前驅物分子； (d) 以再一批經第2親和性分子功能化之微球，處理該釋放的第1訊號前驅物分子，該第2親和性分子對該釋放的第1訊號前驅物分子具有親和性’該微球包含結合至第 2訊號前驅物分子的載體蛋白，其中’該第2訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號，而維持結合於該載體蛋白； (e) 將表面上具有第2親和性分子-第1訊號前驅物分子複合體的微球與表面沒有第2親和性分子--第1訊號前驅物分子複合體的微球分離； (f )以發展試劑處理上述經分離的表面上有第2親和 24 201107752 性分子-第1訊號前驅物分子複合體的微球，以活化該第2 訊號前驅物分子，產生訊號，及 (g)檢測或定量該訊號。由此所產生的sfl號與該樣本中的標的分子的量相關。因為對於溫育步驟（a)期間形成的各親和性分子_標的分子複合體，有許多在步驟（c)釋放的第丨訊號前驅物分子，之後與一批經功能化而對該第丨訊號前驅物分子具有親和性的不同微球一起溫育，所以該訊號在2個不同階段放大許多倍。許多被釋放的第1訊號前驅物分子與不同的微球形成複合體，及在移除未與被釋放的第丨訊號前驅物分子形成複合體的微球之後，加入一活化試劑以活化在各複合體微球中的許多第2訊號前驅物分子，以產生一訊號。應瞭解此訊號前驅物分子的釋放及再度複合的循環，可重複非常多次以達到非常顯著的放大倍數。換言之，在實施步驟（f)及（g)之前，步驟（c)至（e)可重複i至η次，η 為正整數，其中，至少在最終重複的循環中，該訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號。該標的分子代表該第1分析物；該第1訊號前驅物分子代表該第2分析物，且該第2訊號前驅物分子代表該第 3分析物，依此類推。於一變形例中，僅有在最終重複循環的訊號前驅物分子必須為可活化以產生可檢測的訊號。在較早的循環中被釋放的訊號前驅物分子，不需要可活化以產生可檢測的訊號-該訊號前驅物分子可為結合分子’例如卵白素-但被視 25 201107752 為號前驅物分子’因為其為反應串列（cascade)中的重要部分，最終會得到訊號。使用周知的且廣用的配對’例如卵白素及生物素作為前驅物分子-親和性分子對，本放大過程可得到高度可信度及可罪性’尤其在本方法的較後面的階段，亦即當第1標的分子-親和性分子配對已選擇為適合欲檢測或決定的標的之後。需注意到，於最終放大步驟，若最後的訊號前驅物分子仍然結合於最後的微球而且未被釋放到溶液中，則該訊唬可被局部化。此可使訊號的稀釋最小化。另一方面’不必去檢測最後訊號前驅物分子的未釋放狀態；若最後訊號前驅物分子被釋放，也可在溶液中確認，或可引起另一放大步驟。例如，如果具有高週轉率的酵素為最後訊號前驅物分子，則該酵素可容許作用在基質產生螢光或冷光 >=另-例可使用經膠囊化的FDA作為最後訊號 °物刀子在添加發展試劑例如氫氧化鈉水溶液時，fda 溶解、水解並釋放大量的螢光素分子，因此提供經放大的螢光訊號。車乂佳者’至夕對於在溫育步驟(a)使用的微球，載體蛋白選自纖維狀蛋白質，7 、匕括但不限於，細胞骨架蛋白或胞外基體蛋白；或球狀蛋白，束曰或金液蛋白，包括但不限於血紅素蛋白、細胞黏著蛋白. 、，禽白’或運达蛋白、生長因子、蛋白、DNA-結合蛋白、.疬. 尤及系統蛋白，包括但不限於株抗體、多株抗體' 營春音呂蚕素貝丁存/運送蛋白、護衛蛋白體單酵 26 201107752 素；或基因改造蛋白；岑番該載體蛋白為成蛋白。更較佳為，載蛋白為血液中猶環的蛋白質，例如胎牛血清白蛋白。二同樣地，至少對於在溫育步驟⑷使料微球，該訊號刚驅物分子可為選自由以下構成之群組的低分子量物質：螢光團及其衍生物、冷光團及其衍生物、發色團及其衍生物、假肢（Pr〇Sthetlc)基圏，或選自氧化還原媒介物的氧化還原活性物質、電極活性物質。較佳者，低分子量訊號則驅物分子為螢光團，例如：螢光素、花青、叛花青、若 :明、㈣、重氣系榮光物質，及小勞光芳香族及雜芳香族分子。或者’該低分子量訊號前驅物分子為發色團，例如：吼哇琳酮，、類胡蘿葡素及重氣及單偶氮、㈣ (〇—)、㈣或核黃素系染料物質。最佳者，該低分子量訊號前驅物分子為螢光素衍生物，例如：螢光素二乙酸酷则、勞光素二乙酸酿異硫氰酸酿(fda—異硫氰酸酯）或蟹光素二乙酸醋馬來醯亞胺（FDA_馬來醯亞胺）。高分子罝蛋白質訊號前驅物分子’包括但不限於選自以下所構成群組的高分子量物質：酵素及其前驅物、生物生冷光性及生螢光性蛋白質及核糖酵素；選自以下所構成之群組的胜肽或蛋白質：抗體，包括單株抗體及多株抗體、受體、抗原、重組蛋白質、凝集素、卵白素、脂蛋白及糖蛋白二酸、核糖酵素及核酸適體（aptamer)。較佳者，高分子量訊號前驅物分子為親和性分子，例如：胜肽及蛋白質、核酸股、碳水化合物、小分子的配體，及分子銘刻聚合物“π) 或其混合物。或，該高分子量訊號前驅物分子可為酵素， 27 201107752 例如：過氧化酶、氧化還 ^ 最佳者，該高分子量:、酶、接合酶、聚合酶及轉移酶。 —(註冊商標號前驅物分子為印白素及至少對於溫育步驟（8)使生物辨識分子，例如專—的m勺微球，該親和性分子可為 , 、肽及蛋白質、核酸股、碳水化合物、小分子的配體， ^ 混合物。子銘刻聚合物（MIP)或上述之該胜肽或蛋白可為 r m 體，包括單株及多株抗體、受 # ^ 素养胜肽、脂蛋白、糖蛋白、胜肽何爾豕及過敏原或复八乂 /、4刀。該核酸可為DNA、RNA、塞核苷酸、核糖酵素、核酸〇〇酼通體及其部分。碳水化合物之例，包括単-、寡-及多—糖、糖糖月曰買蛋白多糖及其部分。該低 y 刀子量配體可為生物辛或峰京次生物素竹生物、類固醇或荷爾蒙、輔因子或輔醢、、、去^ 活化劑、抑制劑、假基質，或酵素的假肢基團、藥物、過敏原或不完全抗原。最後微球的特別較佳的形式為其中該載體蛋白為胎牛月蛋白（BSA)’且該訊號前驅物分子選自螢光素二乙醆西旨（FDA)、螢光素異硫氰酸酯（F⑽及螢光素：酿亞胺（FDA-馬來酿亞胺）。發展試劑係適於在活化步驟中活化上述螢光素衍生物，例如經由化學反應例如：驗挫D式劑或經由生化反應，例如酯解酶，將螢光素衍生物轉變為螢光素者，以產生可檢測的訊號。用於使微球解體並釋放訊號前驅物分子的化學釋放試劑，可為小分子還原試劑，其有效破壞微球中的雙硫鍵（分 28 201107752 子間及分子内）。二硫蘇糖醇（Dithiothrei tol，DTT)為一特別佳的釋放試劑。微球的解體也可利用超音波、高溫、光照或pH改變而達到。本發明以下將參照圖式僅例示敘述。首先看圖1，（a)圖顯示一第1容器100，含有氣化鈣 (CaCh)、載體蛋白及訊號前驅物分子的混合溶液，及一第 2容器200，含有碳酸鈉（NazCOO溶液。將2容器的内容物快速混合，使蛋白質及訊號前驅物分子，例如BSA-FDA藉由共沉澱被捕捉於支持碳酸鈣（CaC〇3)微球模板300中。圖（b)顯示在其次的步驟發生的事。將帶有捕捉的蛋白質及訊號前驅物分子之CaCCh微球模板300，以還原試劑二硫蘇糖醇（Dithiothrei tol ’ DTT)處理，使得蛋白質分子内的分子内雙硫鍵打開。然後，於數個重複的清洗步驟中將 DTT移除。在蛋白質分子間形成新的分子間及分子内雙硫鍵。新形成的分子間雙硫鍵使該蛋白質分子與也包含該訊號前驅物分子的微球20組合。將該CaCCh模板材料移除，留下蛋白質/訊號前驅物分子微球20，不需使用化學交聯劑。現在看圖2，圖2為依照上述程序製造的蛋白質微球的相位差顯微圖。該圖顯示良好尺寸均一性，偏離平均值的偏差小。重要的是，該微球帶有相同的表面電荷.，所以不會黏在一起。在圖中明顯可見未黏在一起。又，對於定量分析而言’狹窄的尺寸分布（narrow 、 ιτι out 1 on) 亦為重要。 29 201107752 圖3顯示使用濃度範圍0.01〜imM的dtt在15〜60分鐘的期間製備BSA微球的SEM顯微圖。得到的微球直徑相似，微球的表面粗糙度及孔徑隨著DTT濃度減少而增加。較高濃度的DTT會在BSA分子内造成較高程度的分子内雙硫鍵破壞，即蛋白質分子内的游離硫醇基數增加。當以清洗移除DTT後（使用重複清洗步驟），BSA分子内的游離硫醇基自組合形成新的分子間及分子内雙硫鍵，該分子間雙硫鍵使移除碳酸鈣模板後留下的蛋白質微球形成。使用低濃度DTT製作的微球，含有較少分子間雙硫鍵，因此更為多孔。現在看圖顯不使用本發明之微球於夾心生物分析中訊號的累積及局部化的工作原理於（a)視圖，固體支持件 10顯示在其表面具有親和性分子50。微球20在此顯示為梢微扁平的圓，含有結合於訊號前驅物分子40的載體蛋白3〇。注意此為示意圖，僅為了便於理解，使微球有實體的邊界。而且，在載體蛋白分子間@ S-S結合線（及載體蛋白分子與訊號前驅物分子間的鍵結）’為了清楚表示而省略。實際上，微球不是具有實體邊界的膠囊’而是類似縮小的海綿球，有孔洞延伸到其内部，且為載體蛋白分子與訊號前驅物分子彼此結合的均勻分布的形式。微球2 0的表面有親和性分子5 〇附著親和性分子5 0與位於微球一標的分子或分析物60。位於固體支持件1 〇上的一上的一親和性分子50之間，為 30 201107752 該固體支持件可為膜、微滴定盤的井、磁珠”戈更一般地為’使用在免疫或雜交分析中的任何固相平台。於圖⑻，顯示同一微球20 ’仍藉由2個親和性分子 50之間的標的分子6。的，，炎心，，而附著在該固體支持件 10。然而，於此圖中，在以恭葳4杰，占在乂發展4劑處理之後顯示微球20，且微球20具有以小太陽符號表示的訊號分子4G*，之前為鑽石表示的訊號前驅物分子4〇。簡言之，圖4(a)顯示微球熄滅，圖4(b)顯示微球點亮。僅為了及明’圖4顯示在固體支持件丄〇及微球2 〇表面為同類型的親和性分子 '然而在大部分的實務情形，該 2種親和性分子不會相同’除非當使用多株抗體或該標的分析物具有重複性的抗原決定基。貫務上，於生物分析中，視分析物（標的）分子的尺寸及微球尺寸，許多微球生物標記會專一性地結合到對應的標的分析物。於免疫分析中，微球生物標記會專一性地結合於抗原標的分子的抗原決定基；於雜交分析中，微球生物標記會結合至專一的DNA序列標的分析物。當添加發展試劑時，在生物標記中的數百萬產生訊號前驅物分子會轉變為高度螢光性分子，且該等生物標記會發亮並產生局部化的訊號。圖5顯示以山羊抗小鼠I gG (Gt- α -Μ I gG)功能化的 BSA-FDA微球的固相夾心螢光免疫分析示意圖。於圖（a)’顯示溫育步驟，其中，Gt-a-MIgG附著於一固體支持件。於步驟（b)，該結合在固體支持件的 31 201107752

Gt-α -MIgG曝露於含有標的物質或分析物MIg(；的溶液。該標的物質被結合的Gt-a _MlgG所捕捉。清洗步驟（未圖不）移除未捕捉的標的物質。於步驟（c)，實施夾心分析，以表面具有山羊抗小鼠IgG(Gt_a _MIgG)作為親和性分子功能化的BSA-FDA所形成的微球，處理該被捕捉的標的物質。於另-清洗步驟(未圖示），洗去未結合於被捕捉的標的物質的微球。於步驟⑷’添加發展試劑，使m水解為螢光素以產生局部化的可見訊號。圖6顯示放大循環的原理示意圖。於圖（a)，顯示經由在標的互補核酸3〇及與微球2〇, 接合的親和性分子5G’之間的夾心雜交，使單—捕捉分二 60,的-端附著於固體支持# 1〇，，另一端附著於微$ 2〇。圖中’該捕捉分子6〇顯示為雜交於標的互補核酉 30及與微球2G’接合的親和性分子5()，之標的核酸。 ,圖⑻顯示以釋放試劑處理後的微球，該釋放試劑造万微球的解體。於此圖中，該微球正開始破裂並釋出多數(X 的第2分析物4°’至,]溶液中。該第2分析物例如為卵白素圖（c)顯示第2分析物4〇’被親和性分子5〇,，捕在不同的固體支持件1〇, ’。在第2分析物40,為卵白」的例子中，親和性分子50’ ’可為結合於白蛋白12，’ \ 生物素。力此形式中，親和性分子會附。被捕捉的第2分析物⑼，“間接結合於：持件H)’ ’的親和性分子5〇’ ’與結合至一不同微〗 20 的另一親和性分子50，，之間。 32 201107752 圖（d)顯不以釋放試劑處理後造成解體的微球 20 。於此圖中，微球體正開始破裂並釋出多數第2分析物40’，。因此，單一標的分子6〇可能在2個放大循環後變成數以百萬的第2分析物。視需要，可再進行更多的放大循環。本發明以下將參照各種實施例更具體敘述，應瞭解此等為非限定的。 [實施例1 ] 製備BSA-FDA微球步驟1 :形成BSA架構將BSA(10mg/ml)於氯化⑽5m〇1/1)的溶液快速地與碳酸鈉溶液（(K 5mo 1 /1)混合。形成石厌酉夂飼’且僅微溶，片字BSA捕捉在碳酸舞基體的核心/内部。該碳酸鈣作為捕捉BSA的模板。下一步驟為打開BSA的八2 M w ^

的刀子内雙硫鍵，形成新的B s A 分子間雙硫鍵。每一步驟包含數個清洗及離心的循環。將所得的承載BSA的碳酸每微球與濃度為G()i七㈣圍的DTT溶液於ρΗ7·5於室溫—起溫育15〜6〇分鐘。接著，將此承載冑BSA的碳酸_球以緩衝液(邱74)利用離心 (2000rPm，2min)及再分散循環清洗5次。 +加DTT造成BSA中的分子内雙硫鍵還原/斷裂，而在此等清洗步驟中移除DTT造成在m分子間形成新的分子内及分子間雙硫鍵，維持蛋白f在-起並形成微球。 33 201107752 步驟2 :將訊號分子結合至BSA架構基體對於再懸浮的含碳酸鈣的微球，添加螢光素二乙酸酉旨 -5-異硫氰酸酯（lmg/ml) ’並將此反應混合物於室溫溫育i 小時，使BSA胺基與螢光素二乙酸酯的硫氰酸酯之間形成共價鍵。步驟3 : BSA-FDA微球的功能化將山羊抗小鼠抗體結合至帶有訊號分子的微球的步驟，使用EDC/NHS化學實施。步驟3 -1 :製備親和性分子的溶液將含有山羊抗小鼠IgG(0. 2mg/ml)的溶液於pH7. 4各添加到於MES緩衝液中2mM的卜乙基-3(3-二曱基胺基丙基）兔一酿亞胺（EDC)及及5mM的N-經基琥站酿亞胺 (NHS)。使該溶液於室溫振盪反應15分鐘。步驟3 - 2 .以抗體使微球功能化溫育15分鐘後’將經活化供結合山羊抗小鼠IgG的親和性分子的溶液添加到預清洗的BSA-FDA微球懸浮液，此 /見合物於室溫振盪反應2小時。將結合於BSA-FDA微球的親和性分子溶液，於1800rpm離心2分鐘。移除上輕液’將丸粒以MES緩衝液（pH7.4)2ml再復水。以親和性分子功能化的BSA-FDA微球經MES緩衝液 (仙7.4)清洗3次，於2ml的MES緩衝液（pH7.4)中再懸浮。步驟4 :移除碳酸鈣模板然後添加1 Oml的0. 2M EDTA到該BSA-FDA微球懸浮液中’整體攪拌5分鐘。EDTA的處理將微球中的碳酸|丐基體 34 201107752 去除。此反應混合物之後於至溫進行3 〇〇〇 r p m離心2分鐘。移除上清液’以抗體功能化的BSA-FDA微球丸粒再懸浮於 2ml 的 MES 緩衝液（PH7.4)。 [實施例2 ] 使用海藻酸鈣（calcium alginate)基體形成物質形成 BSA架構將BSA( 1 Omg/ml )於氣化妈（〇. 5mol/1)的溶液快速地與海藻酸鈉溶液（0. 5 m ο 1 /1 )混合。开> 成海藻酸約’僅微溶’將BSA捕捉在碳酸約基體的核心/内部。該海藻酸鈣作為捕捉BSA的模板。下一步驟為打開BSA分子内雙硫鍵，形成新的BSa分子内雙硫鍵。各步驟包含數個清洗及離心循環。將所得到的承載有BSA的海藻酸鈣微球與濃度為〇·〇卜lmM範圍的DTT溶液於PH7.5於室溫一起溫育15~6〇分鐘。接著，將此承載有BSA的海藻酸鈣微球以緩衝液 (PH7. 4)利用離心（2〇〇〇rpm，2min)及再分散循環清洗5次。添加DTT造成BSA中的分子内雙硫鍵還原/斷裂，而在此等清洗步驟中移除DTT造成在BSA分子間形成新的分子内及分子間雙硫鍵，維持蛋白質在一起並形成微球。 [實施例3 ] 用於確認小鼠-1 gG的夾心型分析法小鼠I gG的確認，以夾心型分析法實施。於確認期間，小鼠IgG專一性地結合於2抗體之間。該抗體為相同，因 35 201107752 為使用多株山羊抗體。以山羊抗小鼠丨gG抗體吸附性包覆一固相（例如微滴定盤之井）。第2抗體為山羊抗小鼠，結合至BSA-FDA微球。此實施例如圖5所示。將100# 1的Gt-α -MIgG(2ng/ // 1的包覆緩衝液）移到一微滴疋盤’於4 °C溫育整夜。之後將微滴定盤以清洗緩衝液（10mM PBS，0. l%(w/v)BSA、0. 5%(w/v)Tween-20(Tween 為註冊商標））清洗3次。此井（we π )以30 0 μ 1的後包覆溶液（PCS)於37°C封鎖30分鐘。將1〇〇 # 1不同濃度 (1 -1 0 0 g/1)的ΜI gG分別加到各井，於3 7。(：溫育1小時。將未結合的MIgG洗掉後’將Gt-α -MIgG-{BSA-FDA微球} 的懸浮液分配到井中（1 〇〇 #丨/井），並將此微滴定盤再於 37°C溫育1小時。溫育後’將過多的Gt- a -MIgG- {BSA-FDA 微球}以清洗緩衝液洗掉。接著加入1 〇〇 # 1的釋放溶液到各井’並測定井的螢光強度。 [實施例4] 製備卵白素微球實施例4為載體蛋白與親和性結合分子為一分子及相同分子的例子。步驟1 :形成卵白素架構將卵白素（10mg/ml)於氯化鈣（〇. 5mol/l)的溶液快速地與碳酸鈉溶液（0. 5mo 1 /1 )混合。形成碳酸鈣’且僅微溶，在碳酸鈣形成的晶體表面沉澱並附著/吸附卵白素。該碳酸鈣作為沉澱卵白素的模板。下一步驟藉由打開卵白素分子内雙硫鍵使卵白素交 36 201107752 聯’形成卵白素分子間的雙硫鍵。各步驟包含數個清洗及離心循環。將付到的承載有卵白素的碳酸鈣微球與濃度為〇.〇1~1碰範圍的DTT溶液於ρΗ7·5於室溫一起溫育为鐘。接著，將此承載有卵白素的碳酸鈣微球以緩衝液 (PH7. 4)利用離心（2〇〇〇rpm，2min)及再分散循環清洗5次。添加DTT造成卵白素中的分子内雙硫鍵還原/斷裂，在此等清洗步驟中㈣DTT’造成在印白素分子間形成新的分子内及分子間雙硫鍵，以保持蛋白質在一起並形成微球。在蛋白中的還原SH鍵經歷自組合，形成新的分子内及分子間雙硫鍵。步驟2 :訊號分子的功能化藉由將專一性檢測分子（親和性分子）結合於含游離胺基、SH基及羧基的卵白素供該親和性分子與該不具有親和性結合分子的微球共價結合而達成。對於含卵白素微球的功能化程序的細節，見上述實施例2 〇該功能化程序比起鏈親和素（streptavidin)或去糖化卵白素例如NeutrAvidin(註冊商標）簡單很多，原因為此專直接結合在私的（分析物）辨識分子，即親和性分子。若使用鏈親和素或NeutrAvidin(註冊商標），則正常生物素化的親和性分子像是例如生物素化抗體，利用鏈親和素對生物素的強結合力（K約10,直接結合在鏈親和素或 NeutrAvidin(註冊商標）。因此，不需要化學性接合，例如 201107752 EDC/NHS 。步驟3 :將碳酸鈣溶出到微球外此係利用添加EDTA(〇. 2m〇l/l)到卵白素微球的懸浮液中以實施。此程序後，便已製備了該卵白素訊號前驅物微球。 /主思’如同以上的實施例1，移除碳酸约模板的步驟可在功能化步驟前實施。實施例5 固相直接分析法（雙重放大系統，dna分析模型之後為生物素/卵白素模型）此為載體蛋白與親和性結合分子為一個且相同分子之例’且證明其在新的訊號放大循環技術巾的制性。此實施例在圖6中示意表示。人類乳突狀瘤病毒（HPV)DNA的確認係於夾心型分析實施。在HPV確認時，醜股專一性地雜交於其互補的經生 :素化的核酸、然後此雜交產物與由註冊商標）製作的微球反應。添加會造成㈣素微球解體的釋放試劑以將印白素釋放到溶液中。然後在後續的固相直接分析中，將釋放的卵白素視為分析物。步驟1 :固相直接分析A(HPV DNA模型）。將1〇〇以1的HPV探針（HPv16)轉移到微滴定井，連 4主°C溫育整夜。然後將該微滴定盤以1的清洗緩掏清洗5次。然後將該等井以3〇〇# i阻斷溶液於π艺封 3〇分鐘。然後將該微滴定盤以300 # 1 的π洗緩衝液清线 38 201107752 次。將不同稀釋度的30以的1μν_及50M的PCR產物（經生物素化的HPV—病毒—職）分別添加到各井並容許其在室溫靜置1〇分鐘。然後添加5Ml的中和緩衝液，並 & 65C^濕㈣子中溫育3Q分鐘1後將此微滴定盤以 300M清洗緩衝液清洗5次。各井分別添加㈣白素微球’並力3rc溫育3〇分鐘。溫育後將盤取出，並以DNA清洗緩衝液清洗5次。添加濃度在〇.〇卜_範圍的 ρΗ7· 5的DTT >谷液120 // 1到各井，並於室溫靜置15_6〇刀鐘添加DTT使卵白素中的分子間雙硫鍵還原/斷裂，使微球解體並釋放_白素到溶液中。此釋放的㈣素於後續的固相分析中成為分析物（“第2分析物，，）(生物素/印白素模型）。步驟2:固相直接分析Β(生物素/卵白素模型）

將100/ζ 1的BSA-生物素（2ng/y 1的包覆緩衝液）直接包覆在Nunc Maxisorp 96井微滴定盤（Nunc為Nunc International，R0chester，Νγ 的註冊商標）於〇 lm〇i/L 碳酸鹽緩衝液（ρΗ9·6)中於4t整夜。以清洗緩衝液（1〇1^ PBS、0. 1%(W/V)、BSA、〇. 5%(w/v) Tween 2〇(Tween 為註冊商標）清洗3次後，將此等井以300 " i的1%BSA溶液於 37 C阻斷半小時。然後將此盤清洗4次並將對應的，，第2 分析物”（卵白素）溶液分配到井中（1〇〇//丨/井）。將此微滴疋盤於3 7 C再次溫育1小時。清洗掉未結合的第2分析物後’將生物素-FDA微球懸浮液分配到井中（1 〇〇 "丨/井），並將此微滴定盤於37°C再次溫育1小時《溫育後，將過多 39 201107752 的生物素-FDA微球以清洗緩衝液洗掉。錢於每井中加入 10 0 # 1的發展試劑，以供測量螢光強度。於上所述可知，本發明係可多方適用且有用的。該系統全使用簡單的化學/生化及溫和的條件。製備不費時且在放大流程中’可達成許多倍放大而不需要高度技藝要求，例如對於PCR的要求。該微球技術可應用在多種檢測形式，包括但不限於流通裝置、微流體裝置、及側向流裝置。也可使用磁性及非磁性珠，及微滴定井。另外的應用係在免疫化學領域、組織學領域，及使用此訊號分子在西方、南方及北方墨點法供檢測細胞結構或至今為止例如’在F ITC標記的親和性分子的分析靈敏度界限尚無人能檢測的額外的譜帶。本訊號微球的用途打開了免疫化學、組織學及所有各種形式的檢測技術的新的可能性。古典的檢測原理可非常輕易地改善許多等級倍。因此’本發明也提供各種用於檢測及/或決定樣本中的標的分子的測試套組，該套組包含微球，該微球包含結合於訊號前驅物分子的載體蛋白，其中，該訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號，而仍然結合於該載體蛋白，該微球適用於攜帶供專一性認識及結合於標的分子的親和性分子於其表面。另一套組形式可更包含用於修飾親和性分子的試劑’ 使其適於結合在微球表面，及用於實施介於微球及親和性 40 201107752 分子之間的結合反應的試劑。另一測試套組可包含一測_ 而忒裝置，例如側向流、流通或量油尺類型的裝置，其中，、中欲/刀析的流體樣本係添加在測試裝置的吸附材料的-端。該流體利用毛細管力，選擇性由位在另一端的吸收塾加诒势加強毛細官力’而移動到另一端。經微球標記的檢測物f枯 J卿負抗體（包含訊號產生基質）在測試裝置的起始點過量地鬆散地結合。該訊號產生物質可為螢光染料、可見染料、生物冷光或化學冷光材料、磁性材料或酵素。源自該樣本的抗原與該檢測物質抗體交互作用，並产著微球移動到裝置的另一端。在該吸收墊的附近’在指示 =點或條）與捕捉者抗體形成央心。在此，捕捉者抗體較為緊密地結合在吸附材料，因而無法移動。樣本中的分析物愈多，形成愈多的夾心結構，且愈多微球結合在指示區。今·气號吝斗仏拼 „ v 該虎產生物質可依存於該訊號前驅物分子的結構，由久再由各種私序活化。例如，使用FDA為訊號前驅物時，可將敕伽壯κ μ 1個裝置次入驗性活化溶液或滴加驗性活化劑到該指示區。有一部分的檢測者抗體（經微球標記）未結合於指示反廡I:續移動。在指示區後方的控制區顯示是否此固相反應適當地運作。 =心狀的固相膜系技術’可針對低分子量物質使用脱爭性分析原理修飾。本發明可在不偏離下的申 τ明寻利靶圍的範疇内做各 41 201107752 種修飾。【圖式簡單說明】圖（）（b)顯不根據本發明微球製造技術的流程圖。圖2顯示本發明第一態樣之蛋白質微球的相位差 (phase contrast)顯微圖。圖3顯不不同多孔度的蛋白質微球的掃描式電子顯微影像；上排影像顯示放Λ 22，刚⑮，下排影冑顯示放大 1 50, 000 倍。圖4(a) (b)顯示於夹心分析法（san(jwich bioassay) 中的訊號累積及局部化的工作原理示意圖。圖5(a)〜（d)顯示以山羊抗小鼠igG(Gt—aMIgG)功能化的BSA-FDA微球的固相失心螢光免疫分析的示意圖。圖6(a)〜（d)顯示放大循環的原理示意圖。【主要元件符號說明】 1〇, 10’ ，10’ ’固體支持件 12’ ’ 白蛋白 20,20’ ，20’ ’ 微球 30 載體蛋白 40 訊號前驅物分子 40木訊號分子 40’ ，40’ ’ 第2分析物 5 0，5 0 ’ ，5 0 ’ ’親和性分子 60 分析物、標的分子、捕捉分子 42 201107752 100第1容器 200第2容器 3 0 0微球模板

Claims

201107752 七、申請專利範圍： 1 · 一種微球，包含 (i)蛋白質訊號前驅物分子’或 (i i)結合於訊號前驅物分子的載體蛋白’ 其中，該微球在蛋白質分子間具有分子間鍵結，該微球係由以下方法形成，包含：混合蛋白質分子與基體形成物質在溶液中；添加一還原試劑至此混合物；移除該還原試劑；添加基體移除試劑，及移除該基體以留下蛋白質分子的微球。 2 ·如申請專利範圍第1頊所述之微球，其中’該蛋白質訊號前驅物分子係用於結合炱/標的的親和性分子。 3. 如申請專利範圍第1頊所述之微球’在表面上更包含用於結合至一標的的親和性分子。 4. 如申請專利範圍第1項所述之微球，其中’該訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號而仍維持結合於微球。 5.如申請專利範圍第丨項所述之微球’其中’該載體蛋白選自纖維狀蛋白質，包括俱不限於，細胞骨架蛋白或胞外基體蛋白；或球狀蛋白、血液蛋白、血紅素蛋白、細胞黏著蛋白；或運送蛋白、生長因子、受體蛋白、DNA-結合蛋白、免疫系統蛋白、單株抗體、多株抗體、營養素貯存/運送蛋白、護衛蛋白或酵素；或基因改造蛋白；或重組 44 201107752 蛋白、或化學修飾蛋白及合成蛋白。 6. 如申請專利範圍第5項所述之微球，其中，該載體蛋白為血液蛋白質。 7. 如申請專利範圍第5或6項所述之微球，其中，該載體蛋白為胎牛血清白蛋白。 8. 如申凊專利範圍第1-7項任一項所述之微球，其中’該sfl號前驅物分子為：低分子量物質選自由以下構成群’.且的榮光團及其衍生物、冷光團及其衍生物、發色團及其衍生物、酵素基質、假肢（pr〇sthetic)基團，或氧化還原活性物質選自氧化還原媒介物、電極活性物質，或南分子董物質選自以下所構成群組：酵素及其前驅物、生物生冷光性及生營光性蛋白質、核酸、核糖酵素及核酸適體（aptamer)。 9. 如申請專利範圍第8項所述之微球，其中，該訊號前驅物分子為螢光團。 10. 如申請專利範圍第8項所述之微球，其中，該螢光團選自於以下所構成之群組：螢光素、花青（Cyanjne)、幾花青（carbocyanine)、若丹明（rhodamine)、。占嘲、重氮系螢光物質’及小螢光芳香族及雜芳香族分子。 11. 如申請專利範圍第1〇項所述之微球，其中，該螢光團選自於：螢光素二乙酸酯（FDA)、螢光素二乙酸酯異硫乱酸S旨（FDA-異硫氰酸醋）及榮光素一乙酸自旨馬來酿亞胺 (FDA-馬來醯亞胺）。 12. 如申請專利範圍第8項所述之微球，其中，該訊 45 201107752 號前驅物分子為發色團。 1 3.如申請專利範圍第1 2項所述之微球，其中，該發色團選自於以下所構成之群組：花青、吼〇坐琳嗣、蒽醒、幾花青、若丹明、咕噸、類胡蘿蔔素及重氮及單偶氮、噚哄（oxazine)、靛類或核黃素系染料物質。 14.如申請專利範圍第2或3項或第4至13項中任一項依附於第2或3項所述之微球，其中，該親和性分子為生物辨識分子。 15·如申請專利範圍第14項所述之微球，其中，該親和性分子選自由以下所構成之群組：胜肽及蛋白質、核酸股' *反水化合物、小分子的配體，及分子銘刻聚合物（M丨p ) 或其混合物。 1 6.如申請專利範圍第1 5項所述之微球，其中，該胜肽或蛋白質選自於由以下所構成之群組：抗體，包括單株及多株抗體、受體、抗原、重組蛋白、凝集素、卵白素、券胜肽、脂蛋白、糖蛋白、胜肽荷爾蒙及過敏原或部分的上述胜肽或蛋白質。 17. 如申請專利範圍第15項所述之微球，其中，該核酉文選自於由以下所構成之群組：DNA、RNA、寡核苷酸、核糖酵素、核酸適體及部分的上述合酸。 X 18. 如申請專利範圍第15項所述之微球，其中，該碳水化合物選自於由以下所構成之群組：單_、寡_及多—糖、糖脂質、蛋白多糖及部分的上述碳水化合物。 19. 如申請專利範圍第15項所述之微球，其中，該低 46 201107752 刀子量配體為.生物素或生物素衍生物、類固醇或荷爾蒙、輔因子或輔酶、活化劑、抑制劑、假基質，或酵素的假肢基團、藥物、過敏原或不完全抗原。 20.如申請專利範圍第丨5項依附於第3項所述之微球，其中，該親和性分子直接接合或結合，或經由連結物分子接合或結合於該微球。 21 ·如申請專利範圍第15項依附於第3項所述之微球’其中’該親和性分子利用物理性吸附接合於該微球。 22. 如申請專利範圍第21項所述之微球，其中，該連結为子選自於由以下構成之群組：卵白素、鏈親和素、去糖化卵白素、protein A、protein G、凝集素，或低分子量交聯分子。 23. 如申請專利範圍第ι_2ι項任一項所述之微球，具有10nm〜lmm範圍的體積。 24. 如申請專利範圍第23項所述之微球，具有 400nm〜10μ m範圍的體積。 25. 如申請專利範圍第1項所述之微球，其中，該蛋白質為一載體蛋白’該微球係藉由將訊號前驅物分子結合於該載體蛋白而形成。 26. 如申請專利範圍第25項所述之微球，其中，該载體蛋白及該訊號前驅物分子係藉由共價接合、物理性吸附或經由連結分子而組合。 27. 如申請專利範圍第25或26項所述之微球，其中，該載體蛋白為如申請專利範圍第5至7頊中任一項定義之 47 201107752 載體蛋白。如甲請專利範球夂 < 〖項中任·-項所述之微 ’其中’該訊號前驅物分早兔物刀子為如申請專利範圍第8至13 項中任一項定義者。 29.如申請專利範圍第丄 . 球造至28項中任一項所述之微更藉由使親和性分子附芸^Λ 了者於忒微球之表面之步驟所製 30. 如申請專利範圍第29項所述之微球，其中，該親和性分子藉由物理性吸附或直接化學接合而接合或結合於該微球。 31. 如申請專利範圍第29項所述之微球，其中，該親寿性刀子經由連接分子而接合或結合於該微球。 32. 如申請專利範圍第31項所述之微球，其中，該連結分子選自於由以下構成之群組：卵白素、鏈親和素、去糖化卵白去 ,. , '、protein A、protein G、凝集素，或低分子量交聯分子。 33·如申請專利範圍第29至32項中任一項所述之微球，JL tb ^ 丹甲’該親和性分子為如申請專利範圍第14至19項中任一項定義者。 34·如申請專利範圍第1至33項中任一項所述之微球，甘 + ''、T ’該基體形成物質選自：碳酸鈣、海藻酸鈣、多孔丨生矽土及寡糖或多醣。 35·如申請專利範圍第34項所述之微球，其中，該基體形成物質為碳酸鈣。 48 201107752 36. 如申請專利範圍第35項所述之微球，其中，該碳酸約係藉由將碳酸鈉溶液涞哲合饮添加到蛋白質與氣化鈣於溶液中的混合物而形成。 37. Μ請專利範圍第1至36項中任-項所述之微球’其中，該基體移除試劑係選自螯合劑、edta、酸或驗。 38. >申請專利範圍第i至36項中任一項所述之微球，其中，該還原試劑為二硫蘇糖醇（DTT)。 39. —種產生蛋白質微球的方法，包含：將蛋白質分子與基體形成物質在溶液中混合；添加一還原試劑至此混合物；移除該還原試劑，及移除該基體以留下蛋白質分子的微球。 40·如申請專利範圍第39項所述之產生蛋白質微球的方去，其中，該基體係利用選自高溫處理或pH改變的物理方法移除。 41. 如申請專利範圍第39項所述之產生蛋白質微球的方去，其中，該移除基體的步驟，包含添加一基體移除劑。 42. 如申請專利範圍第41項所述之產生蛋白質微球的方法’其中’該基體移除試劑選自螯合劑、EDTA、酸或驗0 43. 如申請專利範圍第39至42項中任一項所述之產生蛋白質微球的方法，其中，該還原試劑為二硫蘇糖醇 (DTT)。 49 201107752 44.如申請專利範圍第39至43項中任一項所述之產生蛋白質微球的方法，其中，該基體形成物質選自於：碳酸鈣、海藻酸鈣、多孔性矽土及寡糖或多醣 4 5.如申叫專利範圍第4 4項所述之產生蛋白質微球的方去，其中，該基體形成物質為碳酸鈣。、46 ·如申叫專利範圍第4 5項所述之產生蛋白質微球的方法，其中，該碳酸鈣係藉由將碳酸鈉溶液添加到蛋白質與氣化鈣於溶液中的混合物所形成。 47. 如申請專利範圍第39至46項中任一項所述之產生蛋白質微球的方法中，該蛋白質分子係用於在溶液中結合標的的親和性分子。 48. 如申請專利範圍第39至46項中任一項所述之產土蛋白質微球的方法’纟中，該蛋白質為一載體蛋白，且 '、中該方法更包含將訊號前驅物分子結合到該載體蛋白的步驟。 49. 如申請專利範圍第48項所述之產生蛋白質微球勺方去’纟中’該載體蛋白及該訊號前驅物分子係藉由共價接合、物理性吸附或經由連結分子而組合。八 / 5〇·如申請專利範圍第48或49項所述之產生蛋白質〜：、的方法’其中’ 3亥載體蛋白為如申請專利範圍第5至 7項中任一項定義的載體蛋白。 51.如中請專利範圍第48至5()項中任—項所述之產生蛋白質微球的方法，“，該訊號前驅物分子為如申請專利範圍第8至13項中任-項定義者。 50 201107752 52.如申請專利範圍第48至51項中任一項所述之產生蛋白質微球的方法’更包含將親和性分子附著於該微球之表面的步驟。 53_如申請專利範圍第52項所述之產生蛋白質微球的方法’其中’該親和性分子藉由物理性吸附或直接化學接合而接合或結合於該微球。 54.如申請專利範圍第52項所述之產生蛋白質微球的方法’其中’包含將該親和性分子經由連結分子而接合或結合於該微球的步驟。 55·如申請專利範圍第54項所述之產生蛋白質微球的方法，其中，該連結分子選自於由以下構成之群組：卵白素鏈親和素去糖化卵白素、proteinA、proteinG、凝集素’或低分子量交聯物質。 56. 如申請專利範圍第47或52至55項中任一項所述之產生蛋白質微球的方法，其中，該親和性分子為如申請專利範圍第14至19項中任一項定義者。 57. 一種使用微球檢測樣本中的1或以上標的分子的方法，該微球包含結合於訊號前驅物分子的載體蛋白，其中’該訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號而仍維持結合於該載體蛋白，且該微球在其表面上有專一性辨識並結合於該標的分子的親和性分子，該方法包含： (a) 將該標的分子與該微球一起溫育； (b) 將在表面上有親和性分子-標的分子複合體的微球與沒有親和性分子-標的分子複合體的微球分離； 51 201107752 (C)以一發展試劑處理該分離的表面上有親和性分子一標的分子複合體的微球以活化訊號前驅物分子刀丁 M產生訊號，及 (d)檢測或定量該訊號。 58. 如申請專利範圍第57項所述之使用微球檢測樣本中的1或以上標的分子的方法，其中，該微球如申請專利範圍第3項或申請專利範圍第4至24項依附於第3項定義者。 ' 59. 如申請專利範圍第57或58項所述之使用微球檢測樣本中的1或以上標的分子的方法，其中，該載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA) ’該訊號前驅物分子為螢光素二乙酸 6旨（F D A) 〇 60. 如如申請專利範圍第59項所述之使用微球檢測樣本中的1或以上標的分子的方法，其中，該發展試劑為鹼或醋解酶。 61· 一種訊號放大方法，供檢測樣本中的1或以上的標的分子’使用包含結合至訊號前驅物分子的載體蛋白之第1微球’其中，該訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號，而仍然維持結合於載體蛋白，且該微球具有親和性分子’供專一性辨識並結合該標的分子於其表面該方法包含： (a) 將該標的分子與該微球一起溫育； (b) 將在表面上有親和性分子—標的分子複合體的微球與 >又有親和性分子-標的分子複合體的微球分離； 52 201107752 (C)處理該分離的表面上有親和性分子-標的分子複合體的微球，使該微球解體，並釋放該訊號前驅物分子； (d) 以第2微球處理該釋放的訊號前驅物分子，該第2 微球經以對於該釋放的訊號前驅物分子具親和性的另一親和性分子功能化，該微球包含結合至該另一訊號前驅物分子的載體蛋白’其中，肖另-訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號’而維持結合於該載體蛋白； (e) 將在表面上有另一親和性分子_訊號前驅物分子複合體的微球與沒有另一親和性分子_訊號前驅物分子複合體的微球分離； (f)以一發展試劑處理該分離的表面上有另一親和性分子-訊號前驅物分子複合體的微球以活化該另一訊號前驅物分子以產生訊號，及 (g)檢測或定量該訊號。 62.如申明專利範圍第61項所述之訊號放大方法更包含在實施步驟⑴及⑷前，重複步驟（c)至（e)ih次。 63_ —種訊號放大方法，供檢測樣本中的1或以上的標的分子，使用包含結合至訊號前驅物分子的載體蛋白之第、1微球’且該微球於其表面具有親和性分子供專一性辨識並結合該標的分子，該方法包含： (a)將該標的分子與該微球一起溫育；一標的分子複合體的微球體的微球分離；和性分子-標的分子複合 (b) 將在表面上有親和性分子與沒有親和性分子-標的分子複合 (c) 處理该分離的表面上有親 53 201107752 體的微球，使該微球解體，並釋放該訊號前驅物分子； (d) 以另一微球處理該釋放的訊號前驅物分子，該微球經以對於該釋放的訊號前驅物分子具親和性的另一親和性分子功能化，該另一微球包含結合至該另一訊號前驅物分子的載體蛋白； (e) 將在表面上有另一親和性分子_訊號前驅物分子複合體的微球與沒有另一親和性分子_訊號前驅物分子複合體的微球分離； (〇以一發展試劑處理該分離的表面上有另一親和性 /刀子-§TL號别驅物分子複合體的微球以活化該另一訊號前驅物分子以產生訊號，及 (g )檢測或定量該訊號。 64.如申請專利範圍第63項所述之訊號放大方法更包含在實施步驟（f)及（g)前，重複步驟（c)至（e)1至η次， π為正整數’其中至少在最終重複循環中的訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號。 65·如申請專利範圍第61至64項中任一項所述之訊唬放大方法，其中，該微球之解體係藉由化學性、物理性或熱性方法實施。 6 6.如申請專利範圍第6 5項所述之訊號放大方法，其中’該微球之解體係藉由化學性方法實施，使用釋放試劑打斷微球中的分子間鍵結。 67·如申請專利範圍第66項所述之訊號放大方法，其中’該釋放試劑打斷微球中蛋白質分子間的分子間雙硫鍵。 54 201107752 68. 法，其中 69. 如申請專利範圍第66或67項所述之訊號放大方 ’該釋放試劑為小分子還原試劑。如申請專利範圍第68項所述之訊號放大方法，其中，該釋放*式劑為二硫蘇糖醇（)。所述之訊號放大方法，其加熱、光照或藉由改變 7 0 如申請專利範圍第6 5項中，該微球之解體係藉由超音波 pH實施。 ^ 71.如中請專利範圍第61至7G項中任-項所述之訊说放大方中，至少該第丨微球如中請專利範圍第3 項或第4至24項中任一項依附於第3項所定義者。 72. 如中請專利範心61至7^項中任—項所述之訊唬放大方中’至少】個放大循環使用膠囊，其封裝有訊號產生有機物質的固體粒子並在其外表面帶有用於專一辨識及結合於標的分子之親和性分子。 73. 如中請專利範圍第62、64至？1項中任_項所述之訊號放大m巾’至少在最後微料，該載體蛋白為胎牛血清白蛋白_’且該訊號前驅物分子為螢光素二乙酸自旨（FDA)。 74. 如申咕專利範圍第73項所述之訊號放大方法，其中，該發展試劑為驗或酯解酶。 75. -種用於檢測樣本中標的分子的套組該套植包含如申請專利範圍第i項或第4至13項中任—項依附於第 1項之微球中，該訊號前驅物分子可活化以產生可檢測的訊號，該微球適於在其表面帶有用於專一性辨識及= 55 201107752 合標的分子的親和性分子。 76·如申請專利範圍第75項所述之用於檢測樣本中標的分子的套組’更包含用於修飾親和性分子以使其結合於微球表面的試劑’及用於在該微球與該親和性分子之間實施結合反應的試劑。 11'如申請專利範圍第75或76項所述之用於檢測樣本中標的分子的套組，包含一固體基質，選自於由以下構成之群組：膜、微滴定盤、珠、管，及載玻片。 78·如申請專利範圍第75至77項中任一項所述之用於^測樣本中的標的分子的套組，其中，該訊號前驅物分子包3 —螢光染料、一可見染料、一生物冷光或化學冷光材料、一磁性材料或一酵素。 79.—種申請專利範圍第1至24項中任一項所述之微球的用途’係用於分析程序以在研究領域、人類及獸醫診斷v員域、法醫診斷、環境分析、食品分析及生物防禦篩檢 ^的物質中供檢測及/或決定樣本中的1或以上標的分子。 8 Π •—種如申請專利範圍第1至24項中任一項所述之微球的用途’係用於異質及固相膜分析。〇 1 • ''種如申請專利範圍第1至24項中任一項所述之微球的用冷用途’係用於免疫組織化學。 Ο Ο .一種如申請專利範圍第1至24項中任一項所述之微求的用途，係用於西方、北方及南方墨點法，及點技術，以使特疋蛋白質讀帶、DNA及RNA序列之存在可見化。 83 .~種如申請專利範圍第1至24項中任一項所述之 56 201107752 微球的用途’係用於分析靈敏度的放大。 84.如申請專利範圍第1項所述之微球，實質上如上述敘述參照圖3者。 85.如申請專利範圍第39項所述之產生蛋白質微球的方法，實質上如上述敘述參照實施例丨者。 8 6.如申請專利範種以上標的分子的方法 5者。圍第57項所述之檢測樣本中的1 實質上如上述敘述參照圖4或圖 57