CN110763840A - 纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1包括:第一缓冲液A、第一缓冲液B、氯化钠、稳定剂、表面活性剂、促进剂和防腐剂。试剂R2包括胶乳微球抗体偶联物、偶联缓冲液、封闭液、贮存液。本发明的优点是:将纤溶酶原激活物抑制剂抗体连接生物素,链霉亲和素连接胶乳微球,后再将二者混合反应,可效提高检测试剂的灵敏度,可改善重复性和线性范围可做到1.30‑130.00ng/mL。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种纤溶酶原激活物的检测试剂盒及制备方法。
背景技术
血浆纤溶酶原激活抑制剂(PAI)分为PAI-l和PAl-2,其中在调节血浆纤溶活性方面起主要作用的是PAI-1。PAI-1是一种单链球形糖蛋白,组织型纤溶酶原激活物和PAI-1是调节纤溶活性的一对关键物质,均由血管内皮细胞合成并释放入血。
已有的检测纤溶酶原激活物抑制剂的试剂采用胶乳微球直接偶联纤溶酶原激活物抑制剂抗体,存在着灵敏度和线性范围均较差的缺陷,限制了它的应用。因此,应该提供一种新的技术方案解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是:提供一种稳定性好、灵敏度高、线性范围宽的纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒及制备方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1的各组分及浓度包括:
所述试剂R2的各组分及浓度包括:
胶乳微球抗体偶联物 0.05-0.75%
偶联缓冲液 8-27g/L
封闭液 20-50g/L
所述试剂R2中还包括贮存液,所述贮存液的各组分及浓度包括:
第二缓冲液 3.75-15g/L
稳定剂 5-20g/L
防腐剂 1-3ml/L
所述胶乳微球抗体偶联物的各组分及浓度包括:
进一步的技术方案:
所述试剂R1中的第一缓冲液A、第一缓冲液B分别为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R2中的偶联缓冲液、第二缓冲液分别为PBS缓冲液、 HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲体系、MES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R1、R2中的防腐剂分别为叠氮钠、Proclin950、 Proclin300、硫柳汞中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R1、R2中的稳定剂为酪蛋白、甘露醇、牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R1中的表面活性剂为吐温20、曲拉通X-100、聚乙烯吡咯烷酮、辛基苯基聚氧乙烯醚中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R2中的封闭液的主要成分为牛血清白蛋白。
所述试剂R2中的胶乳微球所选粒径为100-350nm,其表面修饰集团为羧基、羟基、醛基、氨基等中的一种。
所述试剂R2中的纤溶酶原激活物抑制剂抗体为羊多抗,兔多抗,小鼠单抗中的一种。
一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤,
(1)、试剂R1制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200-300rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述浓度要求,边搅拌边投入第一缓冲液A、第一缓冲液B、氯化钠、稳定剂、表面活性剂、促进剂和防腐剂,搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀,调整PH值为5.90-8.90之间,并定容至最终体积。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2)、试剂R2制备
(2-1)、偶联缓冲液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200-300rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述的浓度要求,边搅拌边投入MES缓冲液,搅拌至物料完全溶解,清澈透明,配液罐底部无沉淀,调整PH值到5.50-6.50之间,并定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2-2)、封闭液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入牛血清白蛋白于配液罐中,放到磁力搅拌器上,搅拌10min,待物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,加纯化水至配制量;
(2-3)、贮存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200-300rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述的浓度要求,边搅拌边投入第二缓冲液、稳定剂和防腐剂,搅拌20-30分钟至物料完全溶解,调节pH值到6.00-8.00之间,继续搅拌5-10分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放备用,进行标识;
(2-4)、胶乳微球抗体偶联物的制备
将纤溶酶原激活物抑制剂抗体稀释到0.5-2.0g/L的浓度,与生物素按1:1—1:3比例结合,记为1号偶联物;
将胶乳微球稀释到0.5-7.5%的浓度,与链霉亲和素按1:2—1:5 比例结合,记为2号偶联物;
将上述1、2号偶联物按1:0.5-1:4比例混匀,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,边摇匀边滴加入上述混合溶液中,室温反应120分钟,加入牛血清白蛋白封闭,振荡混匀,室温反应60分钟,将混合液以14000rpm的转速离心30分钟,吸去上清,加入保存液,超声重悬,重复离心清洗3次,最后一次离心去上清后,加入保存液,超声重悬,室温搅拌1-2小时后,将制备好的R2装入成品罐中,进行标识。
由于上述技术方案的应用,本发明与现有技术相比具有如下优点:
本发明将纤溶酶原激活物抑制剂抗体连接生物素,链霉亲和素连接胶乳微球,后再将二者混合反应,可效提高检测试剂的灵敏度,可改善重复性和线性范围可做到1.30-130.00ng/mL。
附图说明
图1是校准品定标曲线图
其中:X轴表示校准品浓度,Y轴表示吸光度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述:
实施例1:
一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,包括试剂R1和试剂 R2,所述试剂R1包括缓冲液、电解质、稳定剂、表面活性剂、促进剂和防腐剂,所述缓冲液是浓度为1.6g/L的二水合磷酸二氢钠和浓度为8g/L的十二水合磷酸氢二钠的混合溶液,所述电解质是浓度为5g/L的氯化钠,所述稳定剂是浓度为1g/L的牛血清白蛋白,所述表面活性剂是浓度为1ml/L的曲拉通-100,所述促进剂是浓度为60g/L 的聚乙二醇6000以及浓度是0.5ml/L的Proclin950。
所述试剂R2的各组分及浓度包括:胶乳微球抗体偶联物,其浓度为0.05%、作为偶联缓冲液的MES,其浓度为8g/L,作为封闭液的牛血清白蛋白,其浓度为20g/L,所述试剂R2中还包括贮存液,所述贮存液的各组分及浓度包括:作为第二缓冲液的甘氨酸,其浓度为3.75g/L,作为稳定剂的牛血清白蛋白,其浓度为5g/L,作为防腐剂的Proclin950,其浓度为1ml/L,所述胶乳微球抗体偶联物的各组分及浓度包括:浓度为5ml/L的胶乳微球,浓度为5g/L的生物素、浓度为5g/L的链霉亲和素、浓度为0.05g/L的纤溶酶原激活物抑制剂抗体以及浓度为0.08g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤,
(1)、试剂R1制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述浓度要求,边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、氯化钠、牛血清白蛋白、曲拉通-100、聚乙二醇6000和Proclin950,搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀,调整PH值为5.90,并定容至最终体积。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2)、试剂R2制备
(2-1)、偶联缓冲液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述的浓度要求,边搅拌边投入MES缓冲液,搅拌至物料完全溶解,清澈透明,配液罐底部无沉淀,调整PH值为5.50,并定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2-2)、封闭液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入牛血清白蛋白于配液罐中,放到磁力搅拌器上,搅拌10min,待物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,加纯化水至配制量;
(2-3)、贮存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述的浓度要求,边搅拌边投入甘氨酸、牛血清白蛋白和Proclin950,搅拌20分钟至物料完全溶解,调节pH值为6.00,继续搅拌8分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放备用,进行标识;
(2-4)、胶乳微球抗体偶联物的制备
将纤溶酶原激活物抑制剂抗体稀释到0.5g/L的浓度,与生物素按1:2比例结合,记为1号偶联物;
将胶乳微球稀释到0.5%的浓度,与链霉亲和素按1:1比例结合,记为2号偶联物;
将上述1、2号偶联物按1:1比例混匀,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,边摇匀边滴加入上述混合溶液中,室温反应120分钟,加入牛血清白蛋白封闭,振荡混匀,室温反应60 分钟,将混合液以14000rpm的转速离心30分钟,吸去上清,加入保存液,超声重悬,重复离心清洗3次,最后一次离心去上清后,加入保存液,超声重悬,室温搅拌1.5小时后,将制备好的R2装入成品罐中,进行标识。
实施例2
一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1包括缓冲液、电解质、稳定剂、表面活性剂、促进剂和防腐剂,所述缓冲液是浓度为3g/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和浓度为16g/L的十二水合磷酸氢二钠的混合溶液,所述电解质是浓度为16g/L的氯化钠,所述稳定剂是浓度为3g/L的牛血清白蛋白,所述表面活性剂是浓度为3ml/L的聚乙烯吡咯烷酮,所述促进剂是浓度为100g/L的聚乙二醇6000以及浓度是1.2ml/L的Proclin300。
所述试剂R2的各组分及浓度包括:胶乳微球抗体偶联物,其浓度为0.4%、作为偶联缓冲液的MES,其浓度为18g/L,作为封闭液的牛血清白蛋白,其浓度为35g/L,所述试剂R2中还包括贮存液,所述贮存液的各组分及浓度包括:作为第二缓冲液的甘氨酸,其浓度为8g/L,作为稳定剂的牛血清白蛋白,其浓度为13g/L,作为防腐剂的 Proclin300,其浓度为2ml/L,所述胶乳微球抗体偶联物的各组分及浓度包括:浓度为40ml/L的胶乳微球,浓度为12g/L的生物素、浓度为12g/L的链霉亲和素、浓度为0.1g/L的纤溶酶原激活物抑制剂抗体以及浓度为0.25g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤,
(1)、试剂R1制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至250rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述浓度要求,边搅拌边投入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、十二水合磷酸氢二钠、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇6000和Proclin300,搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀,调整PH值为6.50,并定容至最终体积。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2)、试剂R2制备
(2-1)、偶联缓冲液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至250rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述的浓度要求,边搅拌边投入MES缓冲液,搅拌至物料完全溶解,清澈透明,配液罐底部无沉淀,调整PH值为6,并定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2-2)、封闭液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入牛血清白蛋白于配液罐中,放到磁力搅拌器上,搅拌10min,待物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,加纯化水至配制量;
(2-3)、贮存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述的浓度要求,边搅拌边投入甘氨酸、牛血清白蛋白和Proclin300,搅拌20分钟至物料完全溶解,调节pH值为7.00,继续搅拌5分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放备用,进行标识;
(2-4)、胶乳微球抗体偶联物的制备
将纤溶酶原激活物抑制剂抗体稀释到1.3g/L的浓度,与生物素按1:3比例结合,记为1号偶联物;
将胶乳微球稀释到4%的浓度,与链霉亲和素按1:2比例结合,记为2号偶联物;
将上述1、2号偶联物按1:1比例混匀,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,边摇匀边滴加入上述混合溶液中,室温反应120分钟,加入牛血清白蛋白封闭,振荡混匀,室温反应60 分钟,将混合液以14000rpm的转速离心30分钟,吸去上清,加入保存液,超声重悬,重复离心清洗3次,最后一次离心去上清后,加入保存液,超声重悬,室温搅拌1小时后,将制备好的R2装入成品罐中,进行标识。
实施例3
一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,包括试剂R1和试剂 R2,所述试剂R1包括缓冲液、电解质、稳定剂、表面活性剂、促进剂和防腐剂,所述缓冲液是浓度为4.8g/L的二水合磷酸二氢钠和浓度为24g/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸的混合溶液,所述电解质是浓度为27g/L的氯化钠,所述稳定剂是浓度为5g/L的牛血清白蛋白,所述表面活性剂是浓度为5ml/L的辛基苯基聚氧乙烯醚,所述促进剂是浓度为120g/L的聚乙二醇6000以及浓度是2.0ml/L的硫柳汞。
所述试剂R2的各组分及浓度包括:胶乳微球抗体偶联物,其浓度为0.75%、作为偶联缓冲液的MES,其浓度为27g/L,作为封闭液的牛血清白蛋白,其浓度为35g/L,所述试剂R2中还包括贮存液,所述贮存液的各组分及浓度包括:作为第二缓冲液的甘氨酸,其浓度为15g/L,作为稳定剂的牛血清白蛋白,其浓度为20g/L,作为防腐剂的硫柳汞,其浓度为3ml/L,所述胶乳微球抗体偶联物的各组分及浓度包括:浓度为40ml/L的胶乳微球,浓度为20g/L的生物素、浓度为20g/L的链霉亲和素、浓度为0.2g/L的纤溶酶原激活物抑制剂抗体以及浓度为0.3g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤,
(1)、试剂R1制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至300rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述浓度要求,边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、牛血清白蛋白、辛基苯基聚氧乙烯醚、聚乙二醇6000和硫柳汞,搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀,调整PH值为8.90,并定容至最终体积。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2)、试剂R2制备
(2-1)、偶联缓冲液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至300rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述的浓度要求,边搅拌边投入MES缓冲液,搅拌至物料完全溶解,清澈透明,配液罐底部无沉淀,调整PH值为6.50,并定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2-2)、封闭液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入牛血清白蛋白于配液罐中,放到磁力搅拌器上,搅拌10min,待物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,加纯化水至配制量;
(2-3)、贮存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至300rpm,使搅拌保持匀速状态,按照上述的浓度要求,边搅拌边投入甘氨酸、牛血清白蛋白和硫柳汞,搅拌20分钟至物料完全溶解,调节pH值为8.00,继续搅拌10分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放备用,进行标识;
(2-4)、胶乳微球抗体偶联物的制备
将纤溶酶原激活物抑制剂抗体稀释到2.0g/L的浓度,与生物素按1:4比例结合,记为1号偶联物;
将胶乳微球稀释到7.5%的浓度,与链霉亲和素按1:3比例结合,记为2号偶联物;
将上述1、2号偶联物按1:1比例混匀,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,边摇匀边滴加入上述混合溶液中,室温反应120分钟,加入牛血清白蛋白封闭,振荡混匀,室温反应60 分钟,将混合液以14000rpm的转速离心30分钟,吸去上清,加入保存液,超声重悬,重复离心清洗3次,最后一次离心去上清后,加入保存液,超声重悬,室温搅拌2小时后,将制备好的R2装入成品罐中,进行标识。
下面通过具体的实验,结合表格和曲线图,对本发明的纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒的几个重要指标进行说明,具体如下:
1、定标:
使用校准品进行定标,结果如表1所示,定标曲线如图1所示。
表1、校准品定标结果:波长主波长:546nm、副波长:800nm。
2、线性范围检测:
选取待测低值血浆样本用生理盐水进行稀释,产生接近于方法线性范围低限浓度水平的样本,一般为4个浓度水平,分别为: 1.56ng/mL、1.30ng/mL、1.04ng/mL和0.83ng/mL。每个浓度水平样本重复测定10次。以CV≤8%为可接受界值,由数据中选取CV值等于或小于可接受界值的最低浓度水平做为检测范围低限。
选取待测高值样本添加纤溶酶原激活物抑制剂标准品,产生接近于方法线性范围高限浓度水平的样本,一般为4个浓度水平,分别为: 123.50ng/mL、130.00ng/mL、143.00ng/mL、156.00ng/mL。每个浓度水平样本重复测定10次。以CV≤8%为可接受界值,由数据中选取 CV值等于或小于可接受界值的最高浓度水平做为检测范围高限。
线性范围低限
结论:当样本浓度低于1.04ng/mL时,CV>8%。当样本浓度高于 1.30ng/mL时,CV<8%。故线性范围低限定为1.30ng/mL。
线性范围高限
结论:当样本浓度高于143.00ng/mL时,CV>8%。当样本浓度低于130.00ng/mL时,CV<8%。故线性范围高限定为130.00ng/mL。
综上所述,该发明的线性范围可做到1.30-130.00ng/mL。
3、重复性CV检测:
1 | 2.51 | 24.74 | 83.74 | 118.07 |
2 | 2.48 | 23.92 | 82.21 | 120.60 |
3 | 2.60 | 24.41 | 84.21 | 125.12 |
4 | 2.66 | 24.51 | 86.56 | 121.35 |
5 | 2.71 | 24.24 | 86.58 | 123.01 |
6 | 2.69 | 23.79 | 83.59 | 117.71 |
7 | 2.72 | 22.49 | 86.38 | 117.44 |
8 | 2.71 | 24.59 | 83.31 | 119.71 |
9 | 2.60 | 24.27 | 86.17 | 122.65 |
10 | 2.63 | 23.29 | 87.33 | 125.35 |
均值 | 2.63 | 24.03 | 85.01 | 121.10 |
SD | 0.084 | 0.690 | 1.779 | 2.917 |
CV% | 3.21% | 2.87% | 2.09% | 2.41% |
结论:检测临床血浆样本,重复性CV均较小,5%以内。
4、灵敏度检测:
将已知浓度的临床血浆样本用生理盐水稀释至<1.30ng/mL,重复测试10遍,计算SD和CV。变异系数(CV)应不大于10%。
1 | 0.72 |
2 | 0.91 |
3 | 0.90 |
4 | 0.78 |
5 | 0.79 |
6 | 0.80 |
7 | 0.83 |
8 | 0.86 |
9 | 0.92 |
10 | 0.91 |
均值 | 0.84 |
SD | 0.069 |
CV% | 8.15% |
血清样本浓度<1.30ng/mL时,重复性不大于10%。
综上:本发明将纤溶酶原激活物抑制剂抗体连接生物素,链霉亲和素连接胶乳微球,后再将二者混合反应,可效提高检测试剂的灵敏度,可改善重复性和线性范围可做到1.30-130.00ng/mL。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进或替换,这些改进或替换也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R1中的第一缓冲液A、第一缓冲液B分别为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或两种以上混合物。
3.根据权利要求1所述的一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中的偶联缓冲液、第二缓冲液分别为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲体系、MES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或两种以上混合物。
4.根据权利要求1或2所述的一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R1、R2中的防腐剂分别为叠氮钠、Proclin950、Proclin300、硫柳汞中的一种或两种以上混合物。
5.根据权利要求3所述的一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R1、R2中的稳定剂为酪蛋白、甘露醇、牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。
6.根据权利要求4所述的一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R1中的表面活性剂为吐温20、曲拉通X-100、聚乙烯吡咯烷酮、辛基苯基聚氧乙烯醚中的一种或两种以上混合物。
7.根据权利要求1所述的一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中的封闭液的主要成分为牛血清白蛋白。
8.根据权利要求6或7所述的一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中的胶乳微球所选粒径为100-350nm,其表面修饰集团为羧基、羟基、醛基、氨基等中的一种。
9.根据权利要求6或7所述的一种纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R2中的纤溶酶原激活物抑制剂抗体为羊多抗,兔多抗,小鼠单抗中的一种。
10.如权利要求1-9任一项的纤溶酶原激活物抑制剂的检测试剂盒的制备方法,其特征在于:包括如下步骤,
(1)、试剂R1制备
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200-300rpm,使搅拌保持匀速状态,按照权利要求1的浓度要求,边搅拌边投入第一缓冲液A、第一缓冲液B、氯化钠、稳定剂、表面活性剂、促进剂和防腐剂,搅拌至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀,调整PH值为5.90-8.90之间,并定容至最终体积。
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2)、试剂R2制备
(2-1)、偶联缓冲液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200-300rpm,使搅拌保持匀速状态,按照权利要求1的浓度要求,边搅拌边投入MES缓冲液,搅拌至物料完全溶解,清澈透明,配液罐底部无沉淀,调整PH值到5.50-6.50之间,并定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放在成品罐中,进行标识;
(2-2)、封闭液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌子至中档转速,使溶液保持中速转动状态,边搅拌边投入牛血清白蛋白于配液罐中,放到磁力搅拌器上,搅拌10min,待物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,加纯化水至配制量;
(2-3)、贮存液配制
在配液罐中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上,调节搅拌器转速至200-300rpm,使搅拌保持匀速状态,按照权利要求1的浓度要求,边搅拌边投入第二缓冲液、稳定剂和防腐剂,搅拌20-30分钟至物料完全溶解,调节pH值到6.00-8.00之间,继续搅拌5-10分钟至全部物料完全溶解,溶液清澈透明,配液罐底部无沉淀,定容至最终体积;
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程,通过微孔滤膜过滤,过滤后的溶液存放备用,进行标识;
(2-4)、胶乳微球抗体偶联物的制备
将纤溶酶原激活物抑制剂抗体稀释到0.5-2.0g/L的浓度,与生物素按1:1—1:3比例结合,记为1号偶联物;
将胶乳微球稀释到0.5-7.5%的浓度,与链霉亲和素按1:2—1:5比例结合,记为2号偶联物;
将上述1、2号偶联物按1:0.5-1:4比例混匀,将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,边摇匀边滴加入上述混合溶液中,室温反应120分钟,加入牛血清白蛋白封闭,振荡混匀,室温反应60分钟,将混合液以14000rpm的转速离心30分钟,吸去上清,加入保存液,超声重悬,重复离心清洗3次,最后一次离心去上清后,加入保存液,超声重悬,室温搅拌1-2小时后,将制备好的R2装入成品罐中,进行标识。
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