CN102128919A - 一种组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定溶液中过氧化物含量或通过反应后所产生的过氧化物含量的组合物。所述的组合物包括过氧化物酶、缓冲盐、显色剂、两种显色稳定剂。其中，一种显色稳定剂具有比显色剂较强的还原能力，另一种显色稳定剂具有介于显色剂和第一种显色稳定剂之间的还原能力。本发明所述组合物扩大了被检测物质的检测范围，并且显色结果稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种组合物及其应用，特别涉及一种用于测定过氧化物含量的组合物及其在用于测定过氧化氢含量的应用。
背景技术
干化学试纸检测法能用少量的样品在很短的时间内获得被检测样品的多种化学或生物学信息。干化学检测法作为筛选试验被广泛的应用于医学检验、食品安全检测等的判断。例如，利用干化学试纸检测尿样中的葡萄糖、红细胞，检测血液中的谷丙转氨酶和检测蔬菜中的农药残留等。
干化学试纸检测法包括“浸”与“读”两个检测步骤。根据不同的检测项目，反应试剂被预先干燥固定在干化学试纸的膜载体上。检测时，将需检测的液体样本直接加到试纸上，被测物质与试剂发生反应产生颜色变化，利用检测仪器或人工对颜色的深浅变化进行判读，得出被测物定性或定量的分析结果。
氧化还原显色反应是显色反应中的一种类型，利用氧化性物质氧化还原性物质，并产生有色物质的显色反应。例如检测尿液或血液中的葡萄糖含量时，通常利用葡萄糖氧化酶(GOD)与样品中的葡萄糖(Glu)作用生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2)：
反应过程中产生的过氧化氢被过氧化氢酶(POD)催化，释放出新生态的氧(O)：
新生态的氧作用于四甲基联苯胺、碘化钾等色源指示剂，从而呈现出不同的颜色变化，例如检测色块从无色变成蓝色，其深浅程度与样品中葡萄糖的含量呈正比。
当暴露在空气或遇到光时，作为显色反应中的氧化还原指示剂非常的不稳定。如果保存不当，产品未被使用前很容易提前氧化发生颜色变化，造成产品失效或检测结果不准确。为解决指示剂的稳定性问题，美国专利US4220713公开了将通式(1)中的物质作为指示剂的稳定剂，例如1-苯基氨基脲(1-arylsemicarbazide，简称1-PSC)作为指示剂的稳定剂添加到反应体系中，可以很好的稳定氧化性的显色剂。
当通式(1)应用在具有多层结构的干化学试纸时，能够检测出较大浓度范围内的被检测物质。所述的多层结构的干化学试纸例如罗氏Combur-10
M尿液葡萄糖分析试纸。但当通式(1)应用在只有单层结构的干化学试纸时，其检测的浓度范围较窄。例如仅有一层滤纸作为检测试剂载体，检测较低浓度范围的葡萄糖含量时，检测结果与被检测物的浓度有较好的线性关系，检测结果的颜色变化梯度明显。但当被检测物质含量较高时，例如样品中葡萄糖浓度大于3g/L时，出现不同葡萄糖浓度的样品，其检测结果的颜色变化梯度不明显的现象，使得检测结果不准确。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种组合物及其在测定过氧化物含量的应用。
本发明为实现上述目的，提供了一种测定溶液中过氧化物含量或通过反应后所产生的过氧化物含量的组合物。包括过氧化物酶、缓冲盐、显色剂、还原能力比显色剂强的显色剂稳定剂I，还包括至少一种显色剂稳定剂II，其还原能力介于显色剂和显色剂稳定剂I之间。
在测定通过反应后所产生的过氧化物含量时，本发明所述的组合物中还添加氧化酶。
本发明所述组合物可用于疾病快速诊断领域，例如溶液中葡萄糖、胆固醇、尿酸等含量的测定。
在葡萄糖含量测定时，优选的氧化酶为葡萄糖氧化酶，其含量50ku/L-500ku/L。优选的过氧化物酶为辣根过氧化氢酶，其含量为10ku/L-500ku/L。优选的显色剂为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)，其含量为1g/L-10g/L。优选的显色剂稳定剂I为1-苯基氨基脲，其含量为0.1g/L-1g/L。优选的显色剂稳定剂II为4-苯基氨基脲，其含量为0.2g/L-2g/L。缓冲盐为0.2mol/L-2mol/L的柠檬酸缓冲盐。
本发明的有益效果是在使用单层试剂载体时，扩大了被检测物质的检测浓度范围，并且显色结果稳定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。
本发明提供了用于测定溶液中过氧化物含量或通过反应后所产生的过氧化物含量的组合物。所述的组合物包括过氧化物酶、缓冲液、显色剂、还原能力比显色剂强的显色剂稳定剂I和还原能力介于显色剂和显色剂稳定剂I之间的显色剂稳定剂II。
本发明所述的显色剂稳定剂II选自通式(2)所述的结构、双酚A或五倍子酸等。显色剂稳定剂II浓度为0.1g/L-2g/L。
其中X代表以下官能团O、S等；
其中R选自H、C1-C20烷基、C1-C20烯基、C1-C20炔基、C1-C8烷氧基、苯基、萘基、氨基等基团，所述基团可以是未被取代基取代的或者被取代基取代的。所述的取代基可以选自C1-C8烷基，C1-C8烷氧基、卤素、苯基等。
例如通式(3)所述的显色剂稳定剂II选自以下物质：4-苯基氨基脲、氨基胍硝酸盐、碳酰肼、二苯氨基脲、4-烯丙基硫氨基脲(4-Allythiosemicarbazide，CAS：3766-55-0)、4-乙基-3-硫代氨基脲(4-Ethyl-3-thiosemicarbazide，CAS：134131-34-0)、4-甲基氨基硫脲(4-Methylthiosemicarbazide，CAS：6610-29-3)、(Z)-1-(1-苯乙烷)氨基脲((Z)-1-(1-Phenylethylidene)semicarbazide)等。
本发明所述的过氧化物酶可以选自辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、甲状腺过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、髓过氧化物酶、抗甲状腺过氧化物酶等。过氧化物酶的浓度为10ku/L-500ku/L。
本发明所述的显色剂可以选自3，3’，5，5’-四甲基联苯胺、3，3’-二甲基联苯胺、3，3’-二甲氧基联苯胺、邻联甲苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、2，2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。显色剂的浓度为1g/L-10g/L。
本发明所述的显色剂稳定剂I选自通式(3)所述的结构或1，5-二苯基脲、N，N，N-三甲基氨基脲(Girard’s reagent)等。显色剂稳定剂I的浓度为0.1g/L-2g/L。
其中Ar选自苯基、苯甲基、萘基等。优选的通式(3)为1-苯基氨基脲。
本发明所述的缓冲液选自柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液等。所述缓冲液浓度为0.2mol/L-2mol/L。整个溶液的pH为5.0-6.5。
测定通过反应后所产生的过氧化物含量时，本发明所述的组合物中还添加氧化酶。根据不同的检测物质可以选自葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、甘油磷酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、L-α-羟基酸氧化酶、细胞色素氧化酶、酚氧化酶等。氧化酶的浓度为50ku/L-500ku/L。
本发明所述组合物用于检测尿液中葡萄糖含量时，优选的氧化酶为葡萄糖氧化酶，其含量50ku/L-500ku/L。优选的过氧化物酶为辣根过氧化氢酶，其含量为10ku/L-500ku/L。优选的显色剂为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)，其含量为1g/L-10g/L。优选的还原能力较强的显色剂稳定剂为1-苯基氨基脲，其含量为0.1g/L-1g/L。优选的还原能力较弱的显色剂稳定剂为4-苯基氨基脲，其含量为0.2g/L-2g/L。优选的缓冲盐为0.2mol/L-2mol/L的柠檬酸缓冲盐。
本发明所述的过氧化物包括过氧化氢等。
本发明所述组合物可用于疾病快速诊断领域，例如溶液中葡萄糖、胆固醇、尿酸等含量的测定。
所述的溶液包括尿液、血液、唾液、脊髓液、阴道分泌物、精子、粪便、汗液、分泌物、组织、器官、瘤、组织和器官的培养物、细胞培养物等。
实施例1不含显色剂稳定剂II的组合物用于检测尿液中葡萄糖的含量
将Whatman 3MM试纸浸入溶液I中，在70℃烘箱中烘25分钟后，浸入溶液II中，在70℃烘箱中烘15分钟。
溶液I
| 药品 | 每1000ml溶液用量 |
| 纯化水 | 1000ml |
| 柠檬酸缓冲盐 | 1mol，pH5.5 |
| 葡萄糖氧化酶 | 120ku |
| 辣根过氧化物酶 | 50ku |
溶液II
| 药品 | 每1000ml溶液用量 |
| 丙酮 | 1000ml |
| 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺 | 3g |
| 1-苯基氨基脲 | 0.4-1.2g |
将以上试纸切割成5mm×5mm的方块并粘贴到塑料卡片上，分别浸入葡萄糖含量为0.5g/L、1.0g/L、3.0g/L、10g/L的标准品溶液中，取出试纸并吸去多余溶液，自然放置1分钟后在520nm下扫描，测定反射率。结果如下表1所示
表1
实施例1的测定结果表明，在使用仅含有1-苯基氨基脲作为显色剂稳定剂的组合物进行测定时，当葡萄糖浓度从0.5g/L到10g/L范围内依梯度变化时，会出现某个葡萄糖浓度范围内的测试数据比较接近，测试结果颜色梯度没有明显区别。例如1-苯基氨基脲浓度选择0.4g/L时，葡萄糖浓度为1g/L所测得数据为25.2，葡萄糖浓度为3g/L时测得数据为19.9，葡萄糖浓度为10g/L时测得数据为15.2g/L。这三组数据的差异非常小，不足以区分出不同的葡萄糖浓度。因此，仅使用1-苯基氨基脲作为显色剂稳定剂的组合物进行测定时，肉眼或者仪器无法准确测定葡萄糖浓度从0.5g/L到10g/L范围内变化时的含量，因此测试失败。
实施例2含4-苯基氨基脲的组合物用于检测尿液中葡萄糖的含量
将Whatman 3MM试纸浸入溶液I中，在70℃烘箱中烘25分钟后，浸入溶液II中，取出后在70℃烘箱中烘15分钟。
溶液I
| 药品 | 每1000ml溶液用量 |
| 纯化水 | 1000ml |
| 柠檬酸缓冲盐 | 1mol，pH5.5 |
| 葡萄糖氧化酶 | 120ku |
| 辣根过氧化物酶 | 50ku |
溶液II
| 药品 | 每1000ml溶液用量 |
| 无水乙醇 | 1000ml |
| 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺 | 3g |
| 1-苯基氨基脲 | 0.4g |
| 4-苯基氨基脲 | 0.1～2g |
将以上试纸切割成5mm×5mm的方块并粘贴到塑料卡片上，分别浸入葡萄糖含量为0.5g/L、1.0g/L、3.0g/L、10g/L的标准品中，取出试纸后吸去多余溶液，自然放置1分钟后在520nm下扫描，测定反射率。结果如下表2所示：
表2
实施例2的测定结果表明，当组合物中含有显色剂稳定剂II，并且所述显色剂稳定剂II为4-苯基氨基脲时，所测数据间隔较大，测试结果颜色梯度有明显区别，可以准确测定葡萄糖从0g/L到10g/L范围内的含量，因此测试成功。
实施例3含双酚A或五倍子酸的组合物检测尿液中葡萄糖的含量
将Whatman 3MM试纸浸入溶液I中，在70℃烘箱中烘25分钟后，浸入溶液II中，取出后在70℃烘箱中烘15分钟。
溶液I
| 药品 | 每1000ml溶液用量 |
| 纯化水 | 1000ml |
| 柠檬酸缓冲盐 | 1mol，pH5.5 |
| 葡萄糖氧化酶 | 120ku |
| 辣根过氧化物酶 | 50ku |
溶液II
| 药品 | 每1000ml溶液用量 |
| 无水乙醇 | 1000ml |
| 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺 | 3g |
| 1-苯基氨基脲 | 0.4g |
| 双酚A或五倍子酸 | 0.8g |
将以上试纸切割成5mm×5mm的方块并粘贴到塑料卡片上，分别浸入葡萄糖含量为0.5g/L、1.0g/L、3.0g/L、10g/L的标准品中，取出试纸后吸去多余溶液，自然放置1分钟后在520nm下扫描，测定反射率。结果如下表3所示：
表3
实施例3的测定结果表明，当组合物中含有显色剂稳定剂II，并且所述显色剂稳定剂II为双酚A或五倍子酸时，所测数据间隔较大，测试结果颜色梯度有明显区别，可以准确测定葡萄糖从0g/L到10g/L范围内的含量，因此测试成功。
Claims (10)
1.一种组合物，包括过氧化物酶、缓冲盐、显色剂、还原能力比显色剂强的显色剂稳定剂I，其特征在于，还包括至少一种显色剂稳定剂II，其还原能力介于显色剂和显色剂稳定剂I之间。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，显色剂稳定剂II选自通式(2)所述的化合物、双酚A或五倍子酸；
其中X代表以下官能团O、S；
其中R代表C1-C20烷基、C1-C20烯基、C1-C20炔基、C1-C8烷氧基、苯基、萘基、氨基等基团，所述基团可以是未被取代基取代的或者被取代基取代的，所述的取代基可以选自C1-C8烷基，C1-C8烷氧基、卤素、苯基。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，显色剂稳定剂II选自4-苯基氨基脲、4-烯丙基硫氨基脲、氨基胍硝酸盐、碳酰肼、二苯氨基脲、4-乙基-3-硫代氨基脲、4-甲基氨基硫脲、(Z)-1-(1-苯乙烷)氨基脲。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，显色剂稳定剂II含量为0.2g/L-2g/L。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，过氧化物酶选自辣根过氧化物酶、过氧化氢酶、甲状腺过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、髓过氧化物酶、抗甲状腺过氧化物酶或自血红蛋白、肌酐铜复合物等类过氧化物酶，所述过氧化物酶或类过氧化物酶的含量为10ku/L-500ku/L。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，显色剂选自3，3’，5，5’-四甲基联苯胺、邻联甲苯胺、N-乙基N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、2，2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，所述的显色剂含量为1g/L-10g/L。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，显色稳定剂I选自1-苯基氨基脲、1，5-二苯基脲、N，N，N-三甲基氨基脲，显色及稳定剂I含量为0.1g/L-1g/L。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的缓冲盐选自柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，缓冲液浓度为0.2mol/L-2mol/L，溶液的pH为5.0-6.5。
9.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，组合物中还包括氧化酶，所述氧化酶选自葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、甘油磷酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、L-α-羟基酸氧化酶、细胞色素氧化酶、酚氧化酶。
10.根据权利要求1-9之任一项所述的组合物在检测尿液中过氧化物含量、过氧化氢含量或者葡萄糖含量的应用。
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