CN1202622A - 过氧化物酶测定用显色底物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及将以往测定过氧化物酶用的两种显色底物合为一种显色底物且能长期稳定保存而灵敏度增加的过氧化物酶测定用显色底物组合物,该组合物中包括四甲基联苯胺类发色物质,有机溶媒,过氧化物,缓冲溶液及起稳定作用的抗生素。该显色底物组合物能方便有效地应用于过氧化物酶测定用的免疫检测和生化检测。

Description

过氧化物酶测定用显色底物组合物及其用途
本发明涉及由联苯胺类发色物质，有机或无机过氧化物，有机溶媒，缓冲溶液以及起稳定作用的抗生素组成的过氧化物酶测定用显色底物组合物，特别是用于过氧化物酶测定的免疫检测和生化检测中的显色底物。
过氧化物酶是免疫学，生物化学上应用非常广泛的一种生物酶，比如酶免疫组织化学技术中应用的PAP法即过氧化物酶-抗过氧化物酶法。又比如在酶联免疫诊断试验(ELISA)中，将已知抗体(抗原)包被于聚苯乙烯管或微量滴定板的载体上，将待检抗原(抗体)样品加入载体板孔中充分反应后洗去未结合样品，再加入用过氧化物酶标记的抗抗体(抗体)，充分反应后再次洗去标记和未标记的游离抗抗体(抗体)，最后加入底物显色。若待检样品中有相应抗原(抗体)存在，必与用过氧化物酶标记的抗抗体(抗体)竞争抗体(抗原)，竞争力大小与样品抗原(抗体)量成正比，所以底物颜色深浅反映过氧化物酶标记物的多少，也就反映样品抗原(抗体)的多少，便可用酶标仪或光电比色计测出样品抗原(抗体)的量。
测定过氧化物酶的显色底物通常由发色物(氢给体)及过氧化物两种成分组成，由于这两种物质之间存在着较高的标准电势差，根据能斯特方程，它们之间能够发生氧化还原反应，所以在临床使用中常把两物分开，测定过氧化物酶时临时混合在一起。这对临床操作者来说增加了操作步骤，对生产者来说增加了一道工序。如果能采用什么方法，使得这两种底物长期稳定共存在一种溶液中而不发生反应，而当用其测定过氧化物酶时其灵敏度不变，这将大大地给该领域的测定带来方便。美国专利4,891,314中采用青霉素作TMB与H2O2的稳定剂，但它们共存的时间最多只有几个星期；美国专利5,206,150中采用杆菌肽作TMB与H2O2两种存储液的稳定剂，叙述了特殊的配制条件和方法，其二合一底物要求避光保存在2-4C条件下，而且操作也过于繁琐；日本专利特开平6-2279采用有机溶媒使二合一得以实现，结果是各种溶媒大大抑制了TMB与过氧化物的反应，以致临床操作中发现其检测灵敏度受到限制，要求有很高的过氧化物酶浓度来完成测定，这样降低了该发明的实用性。现已发现，在采用有机溶媒的同时，加少量在酸性条件下能稳定存放而不失活的抗生素给上述底物(包括TMB和过氧化物及其缓冲溶液)中，这样底物不仅能长期稳定保存而且检测灵敏度较单用溶媒大大提高。本发明阐述了这种显色底物组合物的配方以及使用方法。需要强调的是，本组合物所需各成份均为实验室常用试剂，配制方法简单，只需将制备好的存储液(A)，(C)按比例混和后加入(B)，(D)充分混匀即可。所组成的显色底物在室温保存6个月不会失效，也不用避光保存。
根据本发明，一种过氧化物酶测定用显色底物组合物包括(A)，(B)，(C)及)(D)四种成分。组合(A)为联苯胺类的生色物质，可以采用四甲基联苯胺，四乙基联苯胺或其盐酸盐，最好的发色物为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(简称TMB)该物不易溶解于水，使用时用丙酮或二甲基亚砜先溶解，再用缓冲溶配成存储液使用，固体TMB在组合物中终浓度可以为0.02-0.06％，最好为0.05％。
其中组分(B)为(A)的增溶或助溶剂，结构通式为：
R-O-(CH2CH2O)n-H
当R取为H时，该助溶剂主要为聚乙二醇(即PEG)。n取值为4-18，可得一系列PEG200-600，最佳为聚乙二醇600。
当R取高级脂肪烷基时，该式一系列聚氧化乙烯高级脂肪醇醚。R的独立C原子数为10-20，n取值4-18，其中最好为C12H25O-(CH2CH2O)12H；
当R取高级脂肪羰基时，该式指一系列聚乙二醇高级脂肪酸酯，R的独立C原子数为10-20，n取值4-18，其中最好为C11H13COO(CH2CH2O)8H.。
组分(B)在组合物中体积终浓度可以为10％-40％，最好为10％-15％。
本发明组合物中(C)为过氧化物，可以为过氧化氢或有机过氧化物或无机过氧化物，其中最好为过氧化脲固体，使用时用缓冲溶液配成存储液，重量终浓度为0.02％-0.06％，最佳含量为0.06％。
本发明组合物中(A)，(C)均由缓冲溶液配成存储液使用，缓冲溶液pH范围为2.5-5.5，可供选择的缓冲对有柠檬酸/乙酸钠，冰醋酸/乙酸钠，柠檬酸/柠檬酸三钠，琥珀酸/四硼酸钠，柠檬酸/磷酸二氢钠，缓冲溶液浓度为0.01-0.3M，最佳为0.1M。
本发明组合物中(D)为起稳定作用的抗生素，可以为(i)或(ii)或(iii)，终浓度为1-30mM，最佳为1.0mM，其中(i)为通式如下的青霉素：
Figure A9711239300061
式中R1代表以下官能团：
Figure A9711239300062
式中R2代表Na或K；其中(ii)为通式如下的庆大霉素：
本发明过氧化物酶测定用显色底物组合物所需各成份均为实验室常用试剂，配制方法简单，只需将制备好的存储液(A)，(C)按比例混和后加入(B)，(D)充分混匀即可。所组成的显色底物在室温保存6个月不会失效，也不用避光保存。
实施例：以下所述实施例详细说明了本发明，但本发明不仅限于此。实施例1
存储液所需0.01M缓冲溶液(pH5.0)配制：含一分结晶水的柠檬酸晶体21.010克与含三分结晶水的乙酸钠晶体122.470克溶液于10000ml纯水即可
(A)存储液的配制：准确称取固体TMB1.000克溶解于100ml甲醇和300ml异丙醇混匀，加入上述缓冲溶液600ml即可
(C)存储液的配制：准确称取过氧化脲固体1.000克加入上述缓冲溶液1000ml即可
按照本发明分别配制编号为(1)-(10)及作对照试验的比(1)，比(2)，比(3)显色底物组合物，各编号配制情况如下表：
Figure A9711239300081
上述各编号显色底物组合物在室温下不避光放置1周，3个月以及6个月之后稳定性情况如下表：(表中用″+″表示有沉淀，用″-″表示无沉淀，用″+″表示有颜色，用″-″表无颜色)
   编号                     有无沉淀                     有无变色
  配制时   一周后  3个月后  6个月后  配制时 一周后 3个月后 6个月后
    (1)     -     -     -     -   -     -     -     -
    (2)     -     -     +-     +   -     -     -     -
    (3)     -     -     -     +-   -     -     -     +
    (4)     -     -     -     +-   -     -     +     +
    (5)     -     -     -     -   -     -     -     -
    (6)     -     -     -     -   -     -     -     -
    (7)     -     -     -     -   -     -     -     -
    (8)     -     -     -     -   -     -     -     -
    (9)     -     -     +-     +   -     -     -     -
    (10)     -     -     -     -   -     -     -     -
   比(1)     +     +-     +-     +   -     -     +     +
   比(2)     -     -     +-     +   -     -     -     +
   比(3)     +-     +-     +-     +   -     +     +     +
实施例2
为了观察各编号显色底物组合物稳定性情况，测定了不同时间的OD值，结果如下：
编号 (1) (6) (3) (9) 比(1)
    +(B)+(D)    +(B)+(D)    +(B)-(D)     -(B)+(D)     -(B)-(D)
    刚配制时     0.005     0.006     0.018     0.019     0.009
一周后 +4度     0.006     0.006     0.026     0.089     0.010
+25度     0.005     0.007     0.088     0.098     0.014
+37度     0.007     0.008     0.089     0.097     0.016
三月后 +4度     0.008     0.008     0.210     0.111     0.238
+25度     0.009     0.009     0.210     0.112     0.394
+37度     0.009     0.010     0.211     0.113     0.422
六月后 +4度     0.009     0.013     0.312     0.314     0.524
+25度     0.010     0.014     0.333     0.342     0.558
+37度     0.010     0.014     0.340     0.348     0.569
实施例3
为检测按发明配制显色底物组合物对过氧化物酶检测的灵敏度，选稳定性较好的编号组(1)，(3)，(6)，(9)及对照组中的比(2)做ELISA试验：
选取免疫检测的待检标准品(抗体)加入致敏载体板孔(已被相关抗原包被)100ul/孔，摄氏37度温育30分钟后将样品液弃去，用PBS洗液反复洗5遍，随后加入用辣根过氧化物酶标记的抗体工作液100ul/孔，摄氏37度温育20分钟后将酶标液弃去，再用PBS洗液反复洗5遍，然后加入所配制编号的显色底物液100ul/孔，摄氏37度反应10分钟，加2MH2SO4100ul/孔终止反应，用酶标仪双波长法读取450nm及630nmOD值，结果如下：
  编号   (3)+(B)-(D)     (9)-(B)+(D)     (1)-(B)+(D)     (6)+(B)+(D)   比(1)-(B)-(D)
刚配制时   1.035     0.893     1.264     1.265   1.220
一周后 +4度   1.030     0.890     1.264     1.263   1.034
+25度   1.029     0.890     1.264     1.262   0.987
+37度   1.028     0.881     1.262     1.263   0.969
三月后 +4度 1.027 0.875 1.261 1.260 0.835
+25度   1.025     0.863     1.261     1.259   0.827
+37度   1.024     0.850     1.260     1.256   0.825
六月后 +4度   1.024     0.850     1.260     1.255   0.638
+25度   1.023     0.835     1.260     1.255   0.437
+37度   1.022     0.834     1.259     1.254   0.388

Claims (7)

1.一种过氧化物酶测定用显色底物组合物由组分(A)，(B)，(C)，和(D)构成。其中组分(A)为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺类发色物溶解于丙酮或二甲基亚砜组成的存储液；组分(B)为一种通式为RO-(CH2CH2O)n-H的有机溶媒，式中R4代表H或碳原子数为10-20的高级脂肪烷基或羰基，n取值为4-18；组分(C)为过氧化物存储液；组分(D)为组合物稳定剂，可以为(i)或(ii)或(iii)结构的抗生素，其中(i)为通式如下的青霉素：式中R1代表以下官能团：
Figure A9711239300023
式中R2代表Na，K；其中(ii)为通式如下的庆大霉素：式中R3代表CH3或H，R4代表H或CH3；
Figure A9711239300032
式中R5代表CH3或H.。本发明组合物由上述(A)的存储液与(C)的存储液混和后直接加入(B)，(D)组分充分混匀而制得。
2.按照权利要求1所述组合物(A)，(C)存储液均由pH为2.5-5.5的缓冲溶液配制，该缓冲溶液浓度为0.01-0.30M。
3.按照权利要求1-2所述组合物，(A)的固体重量终浓度为0.02％-0.06％。
4.按照权利要求1-3所述组合物，(C)的固体重量终浓度为0.02％-0.06％。
5.按照权利要求1-4所述组合物，(B)的体积终浓度为10％-40％。
6.按照权利要求1-5所述组合物，(D)的终浓度为1-30mM。
7.按照权利要求1-6所述组合物，该显色底物组合物应用于一切与过氧化物酶测定有关的免疫学，生物化学领域。
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