CN103884563B - 过氧化物酶（pox）染色液（化学染色法） - Google Patents

Abstract

本发明属于医学体外诊断领域，公开了一种过氧化物酶的染色液。本发明所述染色液包括显色剂、过氧化物、1,3‑二甲基‑2‑咪唑烷酮和环丙沙星；所述显色剂为3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺或其酸式盐。本发明采用1,3‑二甲基‑2‑咪唑烷酮作为显色剂的溶剂，提高了染色液的稳定性和检测灵敏度；采用环丙沙星作为稳定剂，能够使显色剂和过氧化物长期稳定共存于缓冲液中。本发明染色液增强了染色液的稳定性，降低了背景颜色，可室温放置，多次使用，试剂安全简单，无生物有害性和毒性，且测定时灵敏度较高，广泛适合于临床血细胞内过氧化物酶的染色测定。

Description

过氧化物酶（POX）染色液（化学染色法）

技术领域

本发明属于医学体外诊断领域，具体涉及一种过氧化物酶的染色液，尤其是一种用于血细胞内过氧化物酶染色测定的染色液。

背景技术

运用细胞化学技术研究生理和病理情况下血细胞中某些成分、结构及代谢的改变，可作为白血病诊断、分型及鉴别诊断的重要方法。血细胞过氧化物酶(POX)染色是鉴别急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病类型的常用细胞化学方法之一，其检测原理是利用粒细胞和部分单核细胞液内的过氧化物酶催化过氧化物分解，释放出新生态氧，新生态氧与显色体系中的无色供氢体(生色物)发生氧化还原反应，生色物被氧化，氧化态的生色物产生颜色，反应完成后，显色体系颜色深浅直接反应过氧化物酶活性。

目前POX染色有多种方法，卫生部医政司编写的《全国临床检验操作规程》第三版推荐使用了3,3’-二氨基联苯胺(DAB)染色法和氧化WG-KI法。因DAB有潜在致癌作用，故国内许多实验室采用氧化WG-KI法。虽然氧化WG-KI法试剂安全，但该法有染色时间不易控制、经常因扩散而致假阴性、容易褪色需及时检查、并不能回顾性阅片以及因产物易溶于水不能流水冲洗影响结果观察等缺点。因此，目前临床上多应用无致癌诱变性的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)取代DAB进行染色。

由于检测过氧化物酶的显色体系中过氧化物和生色物之间存在着较高的标准电势差，同时过氧化物本身理化性质不稳定，因此在无过氧化物酶存在的情况下，它们之间仍能够发生一定程度的氧化还原反应，所以在临床使用中常把两物分开，测定时临时混合在一起，这给操作者带来了一定的不便。

美国专利US4891314A中尝试采用青霉素作为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化物共存的稳定剂，但是稳定性只能维持几个星期。美国专利US5206150A中采用杆菌肽作为TMB和过氧化物共存的稳定剂，稳定性有所提高，但是要求其于4℃条件下避光保存，而且操作也比较繁琐。日本专利JP特开平6-22794A采用有机溶媒使二合一得以实现，结果是各种溶媒大大抑制了TMB与过氧化物的反应，要求有很高的过氧化物酶浓度来完成测定，这样降低了该发明的实用性。

针对这一系列缺陷，国内专利CN1202622A提出在采用有机溶媒的同时加少量抗生素，使得TMB和过氧化物能室温稳定保存6个月且检测灵敏度较单用溶媒大大提高，抗生素的加入一定程度上减少了有机溶媒的使用量，但是在实际应用中该染色液的稳定性和灵敏度不能满足要求。另外专利中发色物TMB采用丙酮或二甲基亚砜(DMSO)先行溶解，其中丙酮的溶解性远不如DMSO，相关专利文献中多采用DMSO。DMSO虽然为实验室常用试剂，但其本身不稳定，容易分解且有一定的毒性，长期使用对人体有害，同时由于其用量较高会降低过氧化酶的活性，从而导致颜色生成的强度降低，灵敏度差。

发明内容

针对目前现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种过氧化物酶的染色液，该染色液稳定性好，可在室温下长期放置，且不影响其灵敏度。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种过氧化物酶的染色液，包括显色剂、过氧化物、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮和环丙沙星；所述显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺或其酸式盐。

在染色液中溶剂的浓度一般取决于显色剂的浓度，即显色剂的浓度越高，所需要的溶剂的浓度也会越高，而高浓度的有机溶剂会对过氧化物酶的活性有一定的影响，通常会降低过氧化酶的活性，从而降低TMB与过氧化物反应的颜色生成强度，降低检测的灵敏度。1,3-二甲基-2-咪唑烷酮，英文名1,3-dimethyl-2-Imidazolidinone，简称DMI，为非质子强极性溶剂，毒性较小，生物 安全性高，且在高温碱性条件下相当稳定，不会发生快速分解。本发明采用1,3-二甲基-2-咪唑烷酮作为显色剂的溶剂，在没有过氧化酶的条件下能够有效抑制TMB与过氧化物的反应，提高了染色液的稳定性，并且1,3-二甲基-2-咪唑烷酮与丙酮、DMSO相比具有更好的溶解性，1,3-二甲基-2-咪唑烷酮作为显色剂的溶剂，相同浓度的显色剂所需的有机溶媒的量更少，进一步提高了染色液的检测灵敏度。

按照本发明，上述染色液中，所述1,3-二甲基-2-咪唑烷酮在染色液中的体积百分比浓度优选为1％-15％，更优选为2％-5％。在一些实施例中为3％。

按照本发明，上述染色液中，所述稳定剂为环丙沙星。环丙沙星，属于喹诺酮类，可螯合二价、三价金属阳离子，如Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Zn²⁺等，因此可作为重金属离子螯合剂络合缓冲液中可能存在的重金属高价阳离子，从而消除重金属离子对过氧化物的催化分解作用。同时环丙沙星的抗菌活性可使其作为抑菌剂或防腐剂，延长染色液的保存时间。因此本发明染色液采用环丙沙星作为显色剂和过氧化物共存的稳定剂，能够使显色剂和过氧化物长期稳定共存于缓冲液中。

进一步的，所述环丙沙星在染色液中的终浓度为2mmol/L-30mmol/L，优选浓度为5mmol/L-10mmol/L。在一些实施例中为7.5mmol/L。

上述染色液中，所述显色剂为非诱变性3,3’,5,5’-四甲基联苯胺或其酸式盐。在具体实施例中可以为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐二水合物。

上述染色液中，所述显色剂在染色液中终浓度优选为1mmol/L-2mmol/L，更优选终浓度为1.5mmol/L。

上述染色液中，所述过氧化物选自过氧化氢、有机过氧化物或无机过氧化物中的一种，优选过氧化氢或过氧化脲。

上述染色液中，所述过氧化物在染色液中的终浓度优选为1mmol/L-10mmol/L，更优选终浓度为5mmol/L。

进一步的，本发明所述过氧化物酶的染色液还包括缓冲液。所述缓冲液选自醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中的一种。

按照本发明，上述染色液中，所述缓冲液在染色液中pH值范围为3.0-8.0。作为优选，缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，浓度为0.05mol/L-0.2mol/L，更优选为0.1mol/L；pH值范围为3.0-8.0，更优选pH值范围为4.0-6.0。

本发明还提供了上述染色液制备方法，为显色剂用1,3-二甲基-2-咪唑烷酮溶解后，与过氧化物、环丙沙星和缓冲液混合即得。

与现有技术相比，本发明所述氧化物酶的染色液具有如下特点：

(1)产品稳定性好，背景颜色低。

(2)有机溶媒加入量小，检测灵敏度高。

(3)试剂安全，对人体毒性小，生物安全性高。

(4)试剂单一，配制方便。

附图说明

图1为正常血细胞涂片(未复染)。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种过氧化物酶的染色液。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：

实施例1：有机溶剂和稳定剂对染色液稳定性的影响

将TMB分别用DMSO和DMI两种有机溶剂溶解后，配制成以下染色液：

染色液①：DMSO 0.15mL/mL、TMB 1.5mmol/L，过氧化脲5mmol/L，环丙沙星7.5mmol/L和醋酸钠100mmol/L。

染色液②：DMI 0.03mL/mL，TMB 1.5mmol/L，过氧化脲5mmol/L，环丙沙星7.5mmol/L和醋酸钠100mmol/L。

染色液③：DMI 0.03mL/mL，TMB 1.5mmol/L，过氧化脲5mmol/L，青霉素7.5mmol/L和醋酸钠100mmol/L。

将上述三种制备好的染色液均放置于37℃，用分光光度计检测其在450nm处的吸光度，采用蒸馏水作为空白对照，检测结果如下表：

表1 染色液稳定性比较

上述检测结果显示，随着放置时间的延长，染色液②的吸光度增长速率比染色液①要低，表明含有DMI的染色液②中过氧化物在长时间放置过程中发生了较少的氧化分解，有效提高染色液的稳定性。同时，染色液②与染色液③检测结果比较表明，环丙沙星的加入大大提高了染色液的稳定性。另外，染色液②与其它染色液相比，吸光度值更低，表明该染色液在用于细胞染色时将具有更低的背景颜色。

实施例2：本发明染色液的制备

A液：量取醋酸5.76mL，加水定容至1000mL；B液：称取8.2g无水醋 酸钠，加水定容至1000mL。量取A液296mL、B液704mL，混匀，制备0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为5.0。

称取TMB 0.36g溶于30mL DMI溶解，加入到800mL醋酸-醋酸钠缓冲液，再加入0.46g过氧化脲，2.5g环丙沙星，振荡混匀，用醋酸-醋酸钠缓冲液定容至1000mL，即得。

实施例3：本发明染色液与传统方法长期稳定性比较

将本发明实施例2所制备的染色液和参考专利CN1202622A实施例1编号(6)配方制备的染色液分别在室温下放置12个月，通过染色液OD值的变化进行染色稳定性比较。

专利CN1202622A实施例1编号(6)显色液组合物配制方法：称取TMB1.0g，溶于100mL甲醇和300mL异丙醇混合溶剂中，加入600mL 0.01M柠檬酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.0)，配制存储液A。称取过氧化脲固体1.0g加入1000mL 0.01M柠檬酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.0)，配制存储液C。取40mL存储液A液、20mL PEG600、40mL存储液C液混合均匀，并加入庆大霉素C1a使其浓度为1.0mM。

将两种染色液放置于室温下，每月定时各取250μL染色液，分别用酶标仪检测其在450nm处的OD值(不含辣根过氧化物酶组，-HRP)。另外，两种染色液各取100μL染色液与100μL辣根过氧化物酶于室温条件下反应10min，加50μL 2mol/L磷酸终止反应，用酶标仪分别检测其在450nm处的OD值(含辣根过氧化物酶组，+HRP)。检测结果如下表：

表2 不同染色液稳定性比较

上述检测结果显示，对比染色液在室温条件放置了12个月，-HRP和+HRP两组检测的OD值均较明显的变化，而本发明染色液两组检测的OD值变化相对更小。实验表明：本发明染色液中采用DMI为溶剂，并加入环丙沙星，进一步提高产品的稳定性，生色物TMB和过氧化物能够长期室温稳定保存，且不影响其生色灵敏度。

实施例4：本发明染色液对过氧化物酶检测的灵敏度

为了观察本发明染色液对过氧化物酶检测的灵敏度，将本发明实施例2和根据专利CN1202622A实施例1中编号(6)制备的显色液组合物分别与HRP梯度稀释液于室温反应10min，加2mol/L磷酸终止反应，用酶标仪检测其在450nm处的OD值。检测结果如下表：

表3 染色液检测HRP的灵敏度比较

实验结果显示：与对比染色液相比，本发明染色液对于不同稀释浓度的HRP具有更大的OD值，表明本发明染色液用于细胞过氧化物酶的染色，显色更明显，将具有更高的灵敏度。

实施例5本发明染色液用于血细胞染色效果

用正常人外周血进行涂片，滴加工作液数滴(覆盖血膜为宜)，室温放置1-2分钟后，流水冲洗，滤纸吸干，镜检。镜检结果见图1。

染色结果判断：阳性产物呈棕黄到蓝黑色不等颗粒状定位于胞浆中；弱阳性时，阳性反应呈棕色；强阳性时，阳性反应呈棕黑色至蓝黑色，阳性颗粒充满整个胞浆，甚至覆盖细胞核。

染色效果：图1正常人血细胞涂片，粒系细胞呈棕黑色颗粒状强阳性。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种过氧化物酶的染色液，其特征在于，包括显色剂、过氧化物、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮和环丙沙星；所述显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺或其酸式盐。

2.如权利要求1所述的染色液，其特征在于，所述1,3-二甲基-2-咪唑烷酮在染色液中体积百分比浓度为1%-15%。

3.如权利要求1所述的染色液，其特征在于，所述环丙沙星在染色液中的终浓度为2mmol/L-30mmol/L。

4.如权利要求1所述的染色液，其特征在于，所述显色剂在染色液中的终浓度为1mmol/L-2mmol/L。

5.如权利要求1所述的染色液，其特征在于，所述过氧化物为过氧化氢或过氧化脲。

6.如权利要求1所述的染色液，其特征在于，所述过氧化物在染色液中的终浓度为1mmol/L-10mmol/L。

7.如权利要求1所述的染色液，其特征在于，还包括缓冲液。

8.如权利要求7所述的染色液，其特征在于，所述缓冲液选自醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液中的一种。

9.如权利要求7所述的染色液，其特征在于，所述缓冲液在染色液中pH值范围为3.0-8.0。

10.一种过氧化物酶的染色液的制备方法，其特征在于，显色剂用1,3-二甲基-2-咪唑烷酮溶解后，与过氧化物、环丙沙星和缓冲液混合即得。