BR112014015935B1 - composição de agentes de detecção de células tumorais epiteliais e seu método de preparação - Google Patents
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Abstract
r e s u m o “composição de agentes de detecção de célu-las tumorais epiteliais e seu método de preparação”. na presente invenção é fornecida uma composição de agentes de detecção de células vivas, especialmente células tumorais epiteliais; a composição contém ácido fólico de 0-5%, complexo de ácido fólico de 0-10%, azul de metileno de 0,01-5%, agente redutor de carboidratos de 0,1-10%, ácido acético de 2-6% e água de 3-95%. são também fornecidos na presente invenção um método de preparação da composição de agentes de detecção e kits contendo a composição de agentes de detecção.
Description
“COMPOSIÇÃO DE AGENTES DE DETECÇÃO DE CÉLULAS TUMORAIS EPITELIAIS E SEU MÉTODO DE PREPARAÇÃO”
Campo da Invenção [001] A invenção refere-se a uma composição de um agente de detecção, em especial a uma composição de agente de detecção de células tumorais epiteliais, baseada em mudança de cor. A invenção refere-se ainda a um método para a preparação da composição do agente de detecção, e um kit que compreende a composição do agente de detecção.
Fundamentos da Invenção [002] Atualmente, os métodos de coloração vital de células tumorais epiteliais humanas incluem, principalmente, os métodos baseados no teste de aceto-branco, teste de iodo, teste de azul de toluidina, coloração azul de metileno, coloração de hematoxilina e similares.
[003] Especificamente, o teste de aceto-branco é para o esfregaço de uma solução de ácido acético, como por exemplo, solução de ácido acético a 3~5%, no tecido epitelial cervical/vaginal, e observar se existe uma região aceto-branco responsiva no tecido epitelial esfregado após um tempo decorrido. Quando não há nenhuma região aceto-branca, suspeita-se que este tecido epitelial contenha células tumorais. No entanto, embora este método tenha uma sensibilidade elevada, a especificidade é ruim, porque além das células tumorais, algumas células inflamatórias podem também gerar o aceto-branqueamento, produzindo, assim, resultados falso-positivos. Além disso, a especificidade deste método é fortemente afetada pelo nível de habilidade e experiência do operador.
[004] O teste de iodo tem como mecanismo a reação com o glicogênio. O teste envolve esfregar o iodo de Lugol em tecidos epiteliais cervicais e detectar pela observação da coloração de iodo das células epiteliais, no qual o epitélio normal exibe uma cor marrom avermelhada ou preta,
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[005] Os métodos que utilizam o azul de toluidina podem provocar a coloração de debris de núcleo de neutrófilos e bactérias, resultando em alta taxa de falsos positivos. É difícil, também, marcar o câncer e a leucoplasia com a queratinização de superfície, o que tende a levar a falsos negativos[2].
[006] Após a coloração dos tecidos epiteliais com hematoxilina, é necessário um microscópio de alta potência para a observação de operação complicada e altas exigências em relação a competência e experiência do operador, bem como um tempo longo de inspeção.
[007] A afinidade entre o azul de metileno e as células cancerosas torna os tecidos malignos propensos à coloração azul. É relatado que a sua utilização para a amostragem IN SITU da biópsia de tecidos epiteliais esofágicos tem o efeito de melhorar a taxa positiva de biopsia[3]. No entanto, não existe nenhum relato na técnica que combine a reação redox de mudança de cor do azul de metileno com o ácido fólico ou o complexo de ácido fólico, de modo a rapidamente localizar e detectar células tumorais epiteliais através da coloração e da reação de mudança de cor.
[008] Uma composição para a detecção de células tumorais epiteliais, em especial as células tumorais de tecido epitelial vaginal/cervical por coloração e mudança de cor, e que tenha uma elevada sensibilidade, uma elevada especificidade e uma operação simples e rápida faz-se urgentemente necessária no estado da técnica.
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Resumo da Invenção [009] O autor da invenção descobriu que os tecidos epiteliais anormais podem ser rapidamente e precisamente corados de forma específica através da ligação do ácido fólico e/ou do complexo de ácido fólico ao receptor de ácido fólico excessivamente expresso em células tumorais, endocitose, e a mudança de cor de azul de metileno na reação redox com azul de metileno com estado de redução que participa no sistema redox das células tumorais, distinguindo-os, assim, dos tecidos normais, e pela mudança de cor da composição da invenção, sejam as células dos tecidos testados de células tumorais que são mostradas rapidamente, proporcionando, deste modo, local rápido, simples, preciso e sensível e a detecção de tecidos epiteliais anormais, completando, assim, a invenção. A composição do agente de detecção da presente invenção tem uma sensibilidade alta, especificidade alta, operação sim-ples e tempo curto de inspeção, e o operador não necessita de treino técnico. Além disso, o azul de metileno, como agente bastante utilizado clinicamente, tem a vantagem de ser eficaz, seguro, barato e de fácil obtenção, permitindo, assim, que a composição e o método da invenção tenham essas vantagens, também.
[010] Portanto, a invenção proporciona uma composição de agente de detecção que compreende os seguintes componentes (por porcentagem do peso):
| Ácido Fólico | 0-5% |
| Complexos do Ácido Fólico | 0-10% |
| Azul de metileno | 0.01-5% |
| Agente redutor de carboidratos | 0.1-10% |
| Ácido Acético | 2-6% |
| Água | 3-95% |
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4/15 [011] Em uma incorporação desejável da composição do agente de detecção acima referido, a quantidade preferível de ácido fólico é de 0-4,5%, mais preferivelmente de 0-1%.
[012] Numa outra incorporação desejável, a quantidade preferível do complexo de ácido fólico é de 0-8%, mais preferivelmente de 01%.
[013] Em uma outra forma também de incorporação desejável, a quantidade preferível de azul de metileno é de 0,05-4,5%, mais preferivelmente de 0,05-0,5%.
[014] Em ainda outra forma de incorporação desejada, a quantidade preferível de ácido acético é de 3-5%.
[015] O agente redutor de carboidratos utilizado na composição do agente de detecção da invenção inclui vários carboidratos e seus derivados, de preferência a glicose, frutose, galactose, hexose, lactose, maltose, e seus derivados, e semelhantes.
[016] Outro aspecto da invenção refere-se a um método para a preparação do agente de detecção da invenção, que compreende ou consiste, em ordem, das seguintes etapas:
(a) dissolver o ácido fólico e/ou do complexo de ácido fólico em um solvente aquoso pela porcentagem do peso acima mencionado, para formar uma solução, (b) adicionar, agitar e dissolver o azul de metileno na solução (a) pela porcentagem do peso acima referido, (c) adicionar o agente redutor de carboidratos na solução (b) pela porcentagem do peso acima referido, (d) agitar a solução obtida na etapa (c) durante 30 minutos, (e) adicionar, agitar e dissolver o ácido acético na solução (d) pela percentagem de peso acima referido, e
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5/15 as etapas acima referidas são todas conduzidas em condições normais de temperatura e pressão.
[017] Em um aspecto de preferência, o agente de detecção da invenção ou o agente de detecção preparado pelo método da invenção é utilizado para a detecção de células tumorais epiteliais.
[018] A invenção refere-se ainda a um método para detectar a lesão de um tecido epitelial, que compreende:
(a) aplicar os agentes de detecção de células vitais da invenção à superfície do tecido epitelial da área por um transportador;
(b) observar a mudança de cor do transportador; e (c) determinar se existe lesão no tecido epitelial testado pela mudança de cor.
[019] Em uma incorporação de preferência, o método para a detecção da lesão de um tecido epitelial compreende, adicionalmente:
(d) observar se a resposta do teste aceto-branco é gerada na região da superfície do tecido epitelial na qual é aplicado o agente de detecção de células vitais da invenção.
[020] Em uma incorporação de preferência, no método para a detecção da lesão de um tecido epitelial de acordo com a invenção, a observação na etapa (b) é feita visualmente.
[021] Em uma forma de incorporação de preferência, no método para a detecção da lesão de um tecido epitelial de acordo com a invenção, a observação e a determinação nas etapas (b) e (c) é realizada com base nos seguintes padrões: sem alteração de cor do transportador, indicando que não há nenhuma lesão do tecido epitelial; o transportador que se torna verde azulado claro, indicando que não há lesão anormal do tecido epitelial; o transportador que se torna em verde azulado escuro/verde escuro/roxo escuro, indicando lesão anormal do tecido epitelial. Além disso, se o transportador se
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6/15 torna verde escuro/roxo escuro, a região do tecido epitelial que gera a resposta aceto-branco pode ser amostrado, através de biópsia, para exame histopatológico, com o consentimento do paciente, caso o acompanhamento do paciente não possa ser garantido.
[022] Numa forma de realização preferida, a lesão anormal é uma neoplasia (> CIN II), sendo a carcinogênese dentro de tecido epitelial.
[023] A composição de agente de detecção de células tumorais epiteliais da invenção pode ser administrada utilizando-se diferentes formas. As formas de administração incluem, entre outras, os esfregaços. A administração pode ser realizada utilizando-se um transportador que inclui, entre outros, swabs de algodão absorvente, gaze, microcápsulas, membranas de celulose, papel de filtro, nano-materiais, aerogel, e similares.
[024] A composição de agente de detecção de células tumorais epiteliais da invenção pode ser administrada aos tecidos epiteliais de diferentes locais, que incluem, entre outros, os tecidos epiteliais do colo do útero, da vagina, da cavidade oral, esôfago, tecidos epiteliais gastrointestinais, e outros similares.
[025] As porcentagens envolvidas na invenção são todas as percentagens de peso, salvo especificação em contrário.
Descrição Detalhada da Invenção [026] Estudos clínicos mostram que os receptores do ácido fólico são excessivamente expressos na superfície da maioria das células tumorais, ao passo que só estão presentes em pouca quantidade de células normais. Portanto, o ácido fólico e os complexos de ácido fólico (derivados de ácido fólico) podem servir como molécula alvo de tumor específico para o diagnóstico e o tratamento de tumores[4-5].
[027] Na invenção, o termo “complexo de ácido fólico” é definido como um complexo formado a partir da ligação da molécula de ácido
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7/15 fólico a um ou mais componentes, em que o grupo carboxílico do ácido fólico liga-se a um ou mais componentes por acoplamento ou conjugação. Os um ou mais componentes podem ser, por exemplo, drogas, nuclídeos radioativos, corantes, genes, agentes de desenvolvimento e similares. Exemplos do complexo de ácido fólico são o complexo de ácido fólico-mitomicina e o complexo de ácido fólico-DTPA, e similares. Na composição e no método da invenção, o ácido fólico e/ou o complexo de ácido fólico pode ser administrado simultaneamente, ou pode ser utilizado sozinho. O complexo de ácido fólico utilizado na composição de um agente de detecção descrito na invenção inclui os conjugados de ácido fólico formados pelo acoplamento de vários compostos de várias moléculas pequenas com o ácido fólico, as quais incluem, entre outros, o ácido fólico-y-cisteína, (R)-2-(2-(R)-3,4-dihidroxi-5-carbonil-2,5dihidrofurano)-2-hidroxietil-4-(6-(2-amino-4-carbonil-3,4-dihidropteridina) metilamino) benzoato, e similares.
[028] A quantidade de ácido fólico na composição da invenção é de 0-5%, preferivelmente de 0-4,5%, 0-4%, 0-3,5%, 0-3%, 0-2,5%, 0-2%, 0-1,5%, e ainda mais preferivelmente de 0-1%, em porcentagem do peso. A quantidade do complexo de ácido fólico na composição da invenção é de 0-10%, preferivelmente de 0-8%, 0-7%, 0-6%, 0-5%, 0-4%, 0-3%, 0-2%, e ainda mais preferivelmente de 0-1%, em porcentagem do peso.
[029] O azul de metileno é um corante comumente utilizado clinicamente. Seu mecanismo de coloração e mudança de cor é baseado principalmente em suas cores diferentes no estado de oxidação e de redução. Especificamente, o azul de metileno em estado redução é incolor, enquanto que uma solução aquosa de azul de metileno no estado de oxidação apresenta uma cor azul. Adicionalmente, azul de metileno oxidado, enquanto presente na composição da invenção, pode também exibir cor verde azulada, verde-escura (verde acastanhada), e a cor preta arroxeada. O corante azul de metileno
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8/15 bioológico tem uma alta afinidade com as células cancerosas e a melanina[7], cuja oxidação e propriedades de oxidação e redução fazem com que o azul de metileno apareça em diferentes espectros de mudança de cor nos estados de oxidação e redução dos tecidos tumorais. Essas mudanças de cor podem ser diretamente identificadas por rápida observação visual.
[030] A capacidade antioxidante dos tecidos tumorais é significativamente aumentada em comparação com os tecidos normais em geral. No entanto, o estresse oxidativo significativo ainda existe em tais tecidos tumorais[6]. O estresse oxidativo indica uma lesão oxidativa do tecido, que é um período de progressão patológica oculta do tecido. Embora a propriedade de redução de células tumorais seja aumentada, o seu equilíbrio de oxidaçãoredução é ainda inclinado à oxidação, a menos que as células tumorais se encontrem em um estado de apoptose ou inibição. Portanto, no ambiente intracelular de tais células vitais, o azul de metileno na composição da invenção é oxidado para mostrar a cor verde, verde azulada, verde escura e a cor preta arroxeada do estado de oxidação.
[031] Na composição da invenção, o complexo de ácido fólico e algumas quantidades de ácido fólico podem formar um complexo azul de metileno-ácido fólico com azul de metileno. Por causa do efeito de ligação entre a molécula de ácido fólico e o receptor do ácido fólico excessivamente expresso na superfície das células tumorais, o complexo azul de metileno-ácido fólico pode entrar nas células mais facilmente com a promoção do ácido acético, e liberar o azul de metileno em estado de redução. Além disso, em células tumorais em estresse oxidativo, o azul de metileno é rapidamente oxidado, gerando, assim, a mudança de cor. Com os diferentes graus de malignidade do tumor, o azul de metileno se torna verde azulado escuro, verde escuro, e preto arroxeado, enquanto que na presença de lesão inflamatória,
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9/15 excrescência em forma de couve-flor (infecção pelo vírus HPV) ou lesão CIN I, a cor do azul de metileno é verde ou verde azulado claro.
[032] O “agente de redutor de carboidrato” na invenção refere-se a qualquer carboidrato redutivo, seus derivados, ou suas combinações. O carboidrato inclui, entre outros, um monossacarídeo, um dissacarídeo, ou um polissacarídeo. Especificamente, o agente redutor de carboidratos s pode ser a glicose, frutose, galactose, hexose, lactose, maltose, e similares. A expressão “derivado de carboidrato” descrito na invenção é definida como os derivados tais como um polissacarídeo, uma glicoproteína, um ácido orgânico e similares, formados pela polimerização, esterificação, oxidação e similares, de carboidratos. A quantidade do agente redutor de carboidratos na composição e método da in-venção é de 0,1-10%, preferivelmente 0,3-8%, 0,1-3%, e 0,05-1%.
[033] O agente redutor de carboidratos na composição e método da invenção reduz o azul de metileno no estado de oxidação para azul de metileno incolor no estado de redução. O ácido fólico e/ou o complexo de ácido fólico se liga ao receptor do ácido fólico na superfície da célula tumoral. Em um meio ácido de pH 5,0-5,5, o ácido fólico e/ou o complexo de ácido fólico medeia a internalização e a liberação de azul de metileno no estado de redução em citosol. O azul de metileno no estado redutor participa do estresse oxidativo dos tecidos tumorais. O azul de metileno no estado redutor se transforma em estado oxidativo. Enquanto isso, a pressão osmótica dos fluidos intracelulares aumenta, fazendo com que o azul de metileno no estado oxidativo escape das células, e passe a exibir imediatamente a mudança diferente de cor. Esse azul de metileno que escapou pode aderir ao transportador para a administração da invenção, e desse modo, fazer com que a composição imediatamente mostre a mudança de cor. Especificamente, a composição muda de marrom claro amare-lado para verde azulado escuro, verde escuro e preto arroxeado.
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Enquanto isso, as células tumorais têm os núcleos aumentados e a proteína nuclear aumentada, que são precipitados e coagulados pelo ácido acético para produzir uma resposta transiente, em que o tecido epitelial anormal é apresentado como uma região responsiva ao aceto-branco, o que pode proporcionar um local para a amostragem patológica do tecido epitelial anormal.
[034] O termo “ácido acético” utilizado na invenção é o ácido etanoico. A composição da invenção compreende o ácido acético a 2-6% do peso. O ácido acético utilizado na composição da invenção e seu método de preparação proporcionam um pH ácido, de preferência um pH 5,0-5,5. Além disso, o uso de ácido acético ajuda a composição da invenção a rapidamente penetrar na célula, interagindo, assim, com o conteúdo da célula de modo a promover a ocorrência do desenvolvimento da cor. Adicionalmente, como mencionado acima, após o azul de metileno, que o componente é utilizado para mostrar a mudança de cor, escapa da célula, a resposta do aceto-branco gerada pelo ácido acético no tecido epitelial anormal, proporciona ainda uma base adicional para o local do tecido epitelial anormal.
[035] As células que podem ser coradas pela composição da invenção são as células tumorais, preferivelmente as células tumorais epiteliais. Os ditos tecidos epiteliais incluem, entre outros, o epitélio cervical, epitélio vaginal, epitélio gastrointestinal, epitélio oral, e similares. Tais células podem ser provenientes de amostras de biópsia de tecido.
[036] As células da invenção podem ser derivadas de espécies de mamíferos, e os ditos mamíferos incluem, entre outros, os humanos.
[037] A invenção é ainda ilustrada nos exemplos e em exemplos comparativos abaixo. Nos seguintes exemplos e nos exemplos comparativos, o tecido epitelial cervical é usado como objeto de inspeção, e os
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11/15 resultados da inspeção patológica de tecidos cervicais são utilizados como padrão de referência, a sensibilidade é utilizada para ilustrar a taxa de detecção do agente de detecção: quanto mais alta a sensibilidade, mais forte é a capacidade de localizar o tecido epitelial anormal; e, a especificidade é utilizada para ilustrar a precisão do agente de detecção: quanto mais alta a especificidade, maior a associação entre o tecido epitelial anormal detectado e os resultados da inspeção patológica.
[038] Na invenção, a sensibilidade e a especificidade são definidas e calculadas como se segue:
Sensibilidade = número de positivo verdadeiro / (número de positivo verdadeiro + número de falso positivo) * 100%,
Especificidade = número de negativo verdadeiro / (número de negativo verdadeiro + número de falso negativo) * 100%.
Exemplo 1 [039] Em condições normais de temperatura e pressão, cada um dos vários componentes, conforme especificado na Tabela 1 abaixo, foram dissolvidos individualmente em solvente aquoso, ao qual foram adicionados, agitados e dissolvidos o azul de metileno e o agente de detecção biológica, seguido pela adição do agente redutor de glicose e agitado durante 30 minutos; em seguida, foi adicionado, agitado e misturado o ácido acético puro analítico, para fazer uma composição de agente de detecção. Um swab grande foi mergulhado na composição do agente de detecção e feito o esfregaço em um tecido epitelial cervical. O swab foi retirado imediatamente e, no mesmo instante, foi observada a mudança de cor do swab. Quando a cor do swab era castanho amarelado, isto indicava que não havia lesões do tecido epitelial; quando a cor do swab era verde azulada clara, isto indicava uma lesão inflamatória, uma excrescência em formato de couve-flor (infecção pelo vírus HPV) ou lesão CIN I; quando a cor do swab era verde azulado escuro, verde
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12/15 escuro, e preto arroxeado, isto indicava uma lesão anormal de CIN II ou superior. Enquanto isso, a foi recomendada a colposcopia para amostrar tecidos vivos de vários locais para exame histopatológico, e, depois, foram testadas a sensibilidade e a especificidade do agente de detecção usando-se os resultados dos testes histopatológicos como padrão. Os resultados dos testes são apresentados na Tabela 1.
Exemplo 2 [040] O método do Exemplo 1 foi repetido usando-se os vários componentes cujas quantidades foram especificadas na Tabela 1 a seguir, exceto que o complexo de ácido fólico ‘γ-cisteína ácido fólico' foi usado no lugar do ácido fólico. Os resultados dos testes são apresentados na Tabela
1.
Exemplo 3 [041] O método do Exemplo 1 foi repetido usando-se os vários componentes cujas quantidades foram especificados na Tabela 1 a seguir, exceto que o ácido fólico e o complexo de ácido fólico (R)-2-(2-(R)-3,4dihidroxi-5-carbonil-2,5-dihidrofurano)-2-hidroxietil-4-(6-(2-amino-4-carbonil-3,4dihidropteridina)metilamino)benzoato foram dissolvidos juntos no solvente aquoso. Os resultados dos testes são apresentados na Tabela 1.
Exemplo 4 [042] O método do Exemplo 1 foi repetido usando-se os vários componentes cujas quantidades foram especificadas na Tabela 1 a seguir, exceto que o ácido fólico e o complexo de ácido fólico (R)-2-(2-(R)-3,4dihidroxi-5-carbonil-2,5-dihidrofurano)-2-hidroxietil-4-(6-(2-amino-4-carbonil-3,4dihidropteridina)metilamino)benzoato foram dissolvidos juntos no solvente aquoso, e o agente redutor, um derivado da hexose, foi usado no lugar do agente redutor da glicose. Os resultados dos testes são apresentados na Tabela 1.
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Exemplo Comparativo 1 [043] Em temperatura e pressão normais, foram adicionados 5 ml de ácido acético a 95 ml de água destilada para a mistura, para formar uma solução de ácido acético a 5%. Um swab grande foi mergulhado na solução e esfregado sobre um tecido epitelial cervical. Após um minuto de espera, a presença ou ausência de região aceto-branco no tecido epitelial foi observada perto do limite da coluna de células escamosas da cervical, e foram observados o seu limite, sua espessura, cor e tempo de resposta. Quando havia uma região aceto-branco com limite claro, isto indicava lesão de CIN I ou superior. A colposcopia foi conduzida para amostrar tecidos vivos de diversos locais para o exame histopatológico, e, em seguida, a sensibilidade e a especificidade da solução de ácido acético a 5% foram testadas usando-se os resultados dos testes histopatológicos como padrão. Os resultados dos testes são apresentados na Tabela 1.
Exemplo Comparativo 2 [044] Em temperatura e pressão normal, foram dissolvidos 10 g de iodeto de potássio em 100 ml de água destilada, à qual foram adicionados, agitados e dissolvidos 5 g de iodo para produzir uma solução de iodo de Lugol. Um swab grande foi mergulhado na solução e depois esfregado sobre um tecido epitelial cervical, para observar se o tecido epitelial foi corado pelo iodo. O epitélio normal mostrou uma coloração marrom avermelhada ou preta, enquanto que o epitélio anormal apresentou coloração mostarda amarela espessa ou marrom amarelada. Foi realizada a colposcopia para amostrar os tecidos vivos de diversos locais para exame histopatológico, e, em depois, a sensibilidade e a especificidade da solução de iodo de Lugol foram testados utilizando-se os resultados dos testes histopatológicos como padrão. Os resultados dos testes são apresentados na Tabela 1.
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Tabela 1
| Desempenho e quantidade de vários componentes (porcentagem do peso) | Exemplo 1 | Exemplo | Exemplo 3 | Exemplo 4 | Exemplo Comparativo 1 | Exemplo Comparativo 2 |
| Ácido Fólico | 1 | 1 | 1 | |||
| Complexo de Ácido Fólico | 1,0 | 0,5 | 0,5 | |||
| Azul de metileno | 0.3 | 0.3 | 0,3 | 0.3 | / | |
| Glicose | 1.0 | 0.5 | 0.5 | / | ||
| Derivado de Hexose | / | 1.0 | f | |||
| Ácido Acético | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| Agua destilada | 5 | 5 | 3 | 3 | 95 | 100 |
| lodeto de Potássio | / | / | 10 | |||
| Iodo | y | 5 | ||||
| Sensibilidade (Porcentagem) | 94,1 | 94,7 | 97,9 | 95,8 | 65,7 | 58,5 |
| Espe ci fi c idad e (Porc e ntagem) | 92, 6 | 90,5 | 95,3 | 94,6 | 54,9 | 50,2 |
[045] A partir da Tabela 1 referida acima, pode-se observar que os exemplos que usam a composição do agente de detecção da presente invenção, todos têm vantagens significativas na sensibilidade e especificidade, em comparação com os agentes de detecção nos exemplos comparativos, indicando que a composição da invenção pode ser sensivelmente e especificamente usada para a detecção de tecido epitelial anormal.
Referências
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Claims (11)
- R E I V I N D I C A Ç Õ E S1) Composição do agente de detecção caracterizado pelos seguintes componentes em porcentagem de peso:Ácido Fólico 0-5%Complexos do Ácido Fólico 0-10%Azul de metileno 0.01-5%Agente redutor de carboidratos 0.1-10%Ácido Acético 2-6%Água 3-95% em que o ácido fólico e o complexo de ácido fólico não são 0% simultaneamente.
- 2) Composição do agente de detecção, de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade do ácido fólico é de 0-4,5%, preferencialmente de 0-1%.
- 3) Composição do agente de detecção, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a quantidade do complexo de ácido fólico é de 08%, preferencialmente de 0-1%.
- 4) Composição do agente de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a quantidade de azul de metileno é de 0,05-4,5%, preferencialmente de 0,05-0,5%.
- 5) Composição do agente de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o agente redutor de carboidratos é selecionado dentre carboidratos e seus derivados.
- 6) Composição do agente de detecção, de acordo com a reivindicação 5, em que o agente redutor de carboidratos é selecionado dentre glicose, frutose, galactose, hexose, lactose, maltose e seus derivados.Petição 870190113884, de 07/11/2019, pág. 24/292/2
- 7) Composição do agente de detecção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, em que a quantidade de ácido acético é de 3-5%.
- 8) Utilização da composição do agente de detecção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7 para a detecção in vitro de células tumorais epiteliais.
- 9) Método para preparar a composição do agente de detecção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado de modo que compreenda as seguintes etapas:(a) dissolução do ácido fólico e/ou complexo de ácido fólico em um solvente aquoso, (b) adição, agitação e dissolução do azul de metileno na solução acima mencionada, (c) adição de um agente redutor de carboidratos na solução, (d) agitação da solução por 30 minutos, (e) adição do ácido acético para agitação, e as etapas acima são todas conduzidas sob temperatura e pressão normais.
- 10) Kit para detectar células tumorais epiteliais compreendendo a composição do agente de detecção de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, e opcionalmente um veículo, preferencialmente, selecionado dentre: cotonetes absorventes de algodão, gaze, microcápsulas, membranas de celulose, filtro de papel, nanomateriais, e aerogel.
- 11) Composição do agente de detecção, de acordo com as reivindicações 1-10, em que o complexo de ácido fólico é ácido fólico - γcisteína, (R)-2-(2-(R)-3,4-di-hidroxi-5-carbonil-2,5-di-hidrofurano)-2-hidroxietil-4(6-(2-amino-4-carbonil-3,4-di-hidropteridina) metilamina)benzoato.
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