CN105628938A - 一种丙型肝炎病毒ns3抗原检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒，属于病毒检测技术领域，包括如下主要成分：抗HCV-NS3单克隆抗体包被板、HCV-NS3校准品、样品稀释液、浓缩的抗体酶结合物、浓缩的抗体酶结合物稀释液、浓缩洗涤液、单组份TMB显色液、终止液。本发明还提供了上述试剂盒的检测方法及其在检测丙型肝炎病毒中的应用。本发明试剂盒具有更高的灵敏度。

Description

一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体是一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒。
背景技术
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)感染而引起的严重威胁人类健康的传染性疾病。全球约有1.3-1.7亿HCV感染者,大约20％可以自然清除，80％发展为HCV慢性感染。10-20％的HCV慢性感染会进一步发展为慢性进行性肝病，包括肝硬化、肝细胞癌等。HCV是一种非甲非乙型肝炎病毒，后命名为丙型肝炎病毒，归属于肝炎病毒属(Hepacivirus)，黄病毒科(Flaviviridae)。HCV病毒体呈球形，为单股正链RNA病毒。HCV-RNA全长约为9.6kb，包括一个位于基因中央的开放阅读框(ORF)。该阅读框编码3000多氨基酸的前体多聚蛋白，其通过宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成10个具有独立功能的HCV蛋白,根据功能的不同分别命名为核心蛋白Core(C)，包膜蛋白(envelopeprotein)1、2(E1、E2)，p7和非结构蛋白(nonstructuralprotein)NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。NS3蛋白是HCV病毒复制中重要的功能蛋白之一，发挥丝氨酸蛋白酶,解旋酶和NTP酶活性，成为当今HCV诊断，治疗和预防的研究热点。
由于多数丙肝患者不出现明显的临床症状，大部分病人直到出现肝硬化甚至肝癌时，才发现自己患有丙肝。因此早期诊断、早期治疗非常重要。
目前我国阻断丙型肝炎传播的主要方法是：1、酶联免疫吸附法(ELISA)检测丙型肝炎抗体(抗-HCV)筛选供血员，然而抗-HCV的出现是在HCV感染后的6-12周(窗口期)，所以抗-HCV阴性并不能排除携带HCV具有传染性的可能，存在漏检的可能性。2、HCV-RNA检测存在以下问题：价格昂贵，国产为200元，进口为400元。3、由于RNA易降解，易出现假阴性，因此对样本要求高；易出现假阴性、假阳性结果，对检测人员的要求高。
目前国内已有的丙肝抗原检测只针对核心抗原(HCV-CAg)，HCV核心抗原的检测也可缩短HCV诊断的“窗口期”，然而核心抗原是HCV结构区的一部分，检出率低，若能对非结构区抗原进行联合检测，可能将提高检出率。
血清中可存在游离的非结构蛋白NS3，其保守性相对较高，可用于血清学诊断。本公司产品丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒(酶联免疫法)，针对丙肝非结构蛋白NS3，联合上述检测方法可以避免丙型肝炎筛查漏诊的发生，缩短窗口期，具有早期诊断丙型肝炎的临床价值。
HCAg是HCV复制的直接指标，在血液中含量少，为了研究HCV在宿主体内有无复制，对他人有无传染性，以及解决HCV感染的早期诊断，需要用特异性强、敏感度高的抗-HCVMcAb建立敏感、特异和快速的血液中HCAg直接检测试剂。由于丙型肝炎病毒的高度变异性，人们在设计测定丙肝抗原的试剂盒时，自然地把注意力集中在病毒基因序列相对保守的结构蛋白核心抗原。因此，目前商品化的试剂盒都是针对核心抗原，忽略了非结构蛋白NS3抗原作为抗原靶点的可行性。国际上美国强生公司已推出了用双抗体夹心法定性或定量检测血清样品中总的或游离的HCV核心抗原ELISA试剂，雅培公司采用化学发光法定量检测血清或血浆样品的HCV核心抗原ELISA试剂。但其试剂价格昂贵，不适合在国内普及应用。最近，国外有报道：NS3抗原区域具有相对保守的抗原决定簇和较高的抗原性，是目前HCV抗体诊断试剂盒的关键抗原。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒，包括如下主要成分：抗HCV-NS3单克隆抗体包被板、HCV-NS3校准品、样品稀释液、浓缩的抗体酶结合物、浓缩的抗体酶结合物稀释液、浓缩洗涤液、单组份TMB显色液、终止液、封板膜。
进一步地，所述抗HCV-NS3单克隆抗体包被板为两种抗HCV-NS3单克隆抗体包被的酶标板。
进一步地，所述浓缩的抗体酶结合物为第三种抗HCV-NS3单克隆抗体与辣根过氧化物的酶结合物。
本发明还提供了上述丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)准备试剂盒和待测样本，将浓缩洗涤液和浓缩的抗体酶结合物分别进行稀释；
(2)加入准备好的待测样本、HCV-NS3校准品和样品稀释液，轻轻震荡均匀，封板，37℃振荡温浴40min；
(3)洗板6次，拍干，加入稀释后的浓缩的抗体酶结合物，封板，37℃振荡温浴30min；
(4)洗板6次，拍干，加入单组份TMB显色液，封板，37℃振荡温浴10min；
(5)加入终止液，10min内在酶标仪上测定OD值；
(6)处理数据。
本发明还提供了上述试剂盒在检测丙型肝炎病毒中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
(1)本发明应用纯化HCV基因工程表达抗原HCAg对Balb/c小鼠进行皮下多点免疫，共免疫3次，小鼠产生抗体滴度高达1：25600，取得了良好的免疫效果，所获的五株抗-HCVMcAb只与HCV抗原蛋白产生反应，同HDV重组蛋白和大肠杆菌BL-21菌体均无交叉反应，具有良好的特异性。经鉴定，该抗体均属IgG1型，K链。
(2)本发明制备的抗-HCVMcAb具有以下特点：1)纯化HCV基因工程表达抗原蛋白效价高，纯度好，为成功免疫动物和细胞融合打下了良好的基础；2)所建立的5株单克隆杂交瘤细胞株分泌的抗-HCV蛋白效价高，特异性良好，保存于液氮中多次复苏传代后仍能稳定分泌抗体，用ELISA测定效价均未降低；3)所获得的抗-HCVMcAb同时含有抗HCV核心蛋白和非结构蛋白NS3，为建立灵敏而有较宽检测范围的HCAg检测试剂奠定了基础。
(3)本发明通过对242份HCV-NS3抗原阳性样品的基因分型结果进行统计，1b型178份，占73.6％，2a型53份，占21.9％，3a型4份，占1.7％，3b型5份，占2.1％，6a型2份，占0.8％，说明本发明试剂盒可以覆盖在我国流行的HCV主要基因型。
(4)本发明在对1245例临床乙型肝炎患者血清样本的检测中，应用本发明试剂盒测得HCV-NS3抗原阳性率为59％，与HCV-RNA阳性重合率为80％，与抗-HCV阳性重合率为64％。
(5)本发明在对319名丙肝患者进行针对NS3的药物(Simprevir)疗效的对比研究中，应用本发明试剂盒监测患者治疗效果，结果发现；丙肝患者在接受针对NS3治疗时，在监测治疗效果方面，本发明试剂盒显示出较HCV-RNA检测方法更高的灵敏度。
具体实施方式
实施例一
单克隆抗体的制备材料与方法
1.1材料
纯化HCV基因工程表达抗原HCAg，为中国预防医学科学院病毒学研究所提供，NS3抗原的氨基酸位置为175-423，蛋白质1.275g/L；
RPM1640和胎牛血清购自GibcoBRLP公司；
SP2/0骨髓瘤细胞由军事医学科学院微生物流行病研究所提供；
Balb/c小鼠购自军事医学科学院动物中心；
单克隆抗体IgG亚类鉴定试剂为Sigma公司产品；
抗-HCVELISA检测试剂盒由本所制备；
抗-HCVMcAb分片断鉴定试剂为INNOGENETICSN.V.公司产品。
1.2方法
1.2.1动物免疫
取HCV重组抗原蛋白300mg/L与完全福氏佐剂等量混合制成乳化剂，共免疫Balb/c小鼠5只。第1次免疫100μg/只，皮下多点注射，2周后用不完全福氏佐剂第2次免疫，剂量、途径与第1次相同。2周后尾静脉取血测定效价，抗-HCV效价达1：1000～1：5000时供融合用。融合前3d用抗原直接腹腔脾区加强免疫1次。
采用常规间接ELISA法测定抗-HCV：包被聚苯乙烯板的纯化重组HCAg浓度为5mg/L，酶标记抗体为羊抗鼠IgG，工作浓度为1：5000，酶标仪450nm波长测定OD值。P/N值≥2.1倍为阳性，＜2.1倍为阴性(N值<0.05，按0.05计算)。
1.2.2细胞融合及克隆化和腹水制备
(1)免疫脾细胞的制备
取已免疫Balb/c小鼠，眼球放血供检测抗体用。无菌操作取出脾脏，轻轻清洗并去除结缔组织，置于铜网上挤压研磨，并通过网孔挤到溶液中，离心1000r/min，5min，弃上清，重悬于溶液中制成脾细胞悬液，加台盼兰染液作细胞计数。
(2)髓瘤细胞液制备
将骨髓瘤细胞置于37℃5％CO2培养箱中扩大培养。融合当天收集处于对数生长期的SP2/O骨髓瘤细胞，离心1000r/min,5min，弃上清，重悬于液体后作细胞计数。
(3)细胞融合
分别吸取脾细胞和骨髓瘤细胞悬液按5：1混合，置于离心管内充分混匀后离心，弃上清，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。取50％的聚乙二醇(PEG)0.7mL加入混合细胞中促进融合，严格控制作用时间在2～3min内，立即加入不完全培养液稀释，使PEG中止作用。离心800r/min,7min,弃上清。加入10mLHAT培养液制成细胞悬液,并加入已铺成饲养细胞层的96孔板中，每孔0.1mL，置37℃5％CO2培养箱中培养，4～5d后换液1次，8～10d时取上清，用ELISA法测抗-HCV，进行初筛，阳性孔进行亚克隆。
(4)杂交瘤细胞的克隆化及腹水制备
将96孔板中待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，取少许细胞悬液置另一无菌小瓶中。将此细胞悬液准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞。将稀释好的细胞悬液接种于已铺有饲养细胞层的96孔板中，每孔0.1mL，即每孔含一个细胞，置37℃5％CO2培养箱中培养，5d左右在倒置显微镜下观察细胞克隆生长情况。反复克隆3次，确定阳性单克隆细胞株，最后克隆株编号，置液氮中保存。取出部分阳性克隆株转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培养。将接种的杂交瘤细胞吹打下来,1000r/min离心10min，弃上清，沉淀物用无血清培养液悬浮混匀,并将细胞调至(1～2)×106个/mL。选择健康Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL。7～12d后其腹部明显膨大。用5mL注射器抽取腹水或杀死后吸出腹水，3000r/min离心15min，分离腹水上清，低温分装保存备用。
1.2.3抗-HCVMcAb鉴定
(1)亚类鉴定
用HCAg(2.5mg/L)包被96孔板条,4℃过夜。2％BSA-PBS-Tween20封闭后，0.1mL/孔加入不同株细胞培养上清液，室温2h，洗涤后加入抗小鼠Ig及其亚类的兔免疫血清，37℃孵育1h，洗涤后加入酶标记羊抗兔Ig抗体，37℃1h，洗涤，显色，判断结果。
(2)特异性鉴定
以重组HCV基因工程表达抗原、大肠杆菌BL-21菌体和HDV重组蛋白分别包被聚苯乙烯板条，置4℃过夜。用2％BSA-PBS封闭后，分别加入不同株细胞培养上清液，室温2h后，加入抗IgG-HRP标记物，室温1h，洗涤后显色，观察各细胞株与不同抗原有无交叉反应。
(3)分片断鉴定
应用INNOGENETICSN.V.公司产品，按产品说明书操作。
1.3结果
1.3.1HCV免疫Balb/c小鼠血清反应结果
3只Balb/c小鼠采用100μg/只HCV抗原蛋白皮下多点注射，按计划进行免疫，每次免疫后取血，测定其混合血清抗-HCV效价，得到较好的免疫效果。小鼠1、2、3的抗-HCV效价分别为1：12800、1：6400和1：25600，取小鼠3做融合用。
1.3.2抗-HCVMcAb阳性细胞株筛选结果
应用B淋巴细胞杂交瘤技术融合细胞，共用5块96孔板，融合率100％，阳性率20％。初筛阳性孔进行3次克隆，阳性率达100％。共获得5株能稳定分泌抗-HCVMcAb的杂交瘤细胞株，分别命名为抗-HCV1，2，3，4，5。经扩大培养后，分别制备腹水。培养上清液和腹水中抗-HCVMcAb的效价见表1。
表15株抗-HCVMcAb上清液和腹水的效价测定
1.3.3抗-HCVMcAb鉴定
(1)亚类鉴定结果
对5株抗-HCVMcAb上清分别进行IgG亚类鉴定，除第3株(抗-HCV3)属IgA，K链(Kapa链)，其余4株均属IgG1，K链(Kapa链)。于液氮中保存2～3个月以上，多次复苏传代后仍能稳定分泌抗体，用ELISA测定抗-HCV效价均未见降低。
(2)抗-HCVMcAb特异性鉴定结果
应用重组HCV基因工程表达抗原、大肠杆菌BL-21菌体和HDV重组蛋白分别包被聚苯乙烯板条，与5株抗-HCVMcAb进行交叉反应，结果此5株抗-HCVMcAb杂交瘤细胞株分泌的抗体，只能与HCV重组蛋白起反应，与大肠杆菌BL-21菌体和HDV重组蛋白均无交叉反应，证明这5株单抗特异性强。见表2。
表25株抗-HCVMcAb与其他抗原蛋白的交叉反应OD值
1.3.4分片断鉴定结果
5株单抗均为抗-HCVNS3单克隆抗体，其中抗-HCV4株还有抗核心蛋白单克隆抗体。
实施例二
试验方法
本实试验中，抗HCV-NS3单克隆抗体包被板为1号和5号两种抗HCV-NS3单克隆抗体包被的酶标板；
样品稀释液中含有质量分数为0.05％的吐温-20，0.05mol/L的PBS磷酸盐缓冲液；
HCV-NS3校准品的浓度分别为：0ng/mL、104ng/mL、175ng/mL、332ng/mL、588ng/mL、641ng/mL；
浓缩的抗体酶结合物为2号抗HCV-NS3单克隆抗体与辣根过氧化物的酶结合物；
浓缩的抗体酶结合物稀释液中含有质量分数为1％的BSA，质量分数为5％的甘油，质量分数为1％的兔血清，0.05mol/L的PBS磷酸盐缓冲液；
浓缩洗涤液中含有质量分数为1％的吐温-20，1mol/L的PBS磷酸盐缓冲液；
单组份TMB显色液为0.172mg/mLTMB(3.3’,5,5’-四甲基联苯胺)，质量分数为1％的DMSO，0.1mol/L的醋酸钠，质量分数为0.06％的过氧化氢，和水的混合物；
终止液为2mol/L的硫酸。
2.1实验准备
(1)取出试剂盒和待测样本，在室温下平衡至少30min；
在合适的洁净容器内用新鲜的蒸馏水或去离子水将浓缩洗涤液稀释20倍，混匀得到稀释后的洗涤液备用，在使用前确保浓缩洗涤液无结晶析出；
按样本编号，在抗HCV-NS3单克隆抗体包被板上作标记；
准确吸取240μl浓缩的抗体酶结合物，加入至含有24mL的浓缩的抗体酶结合物稀释液瓶中，轻轻混匀；
(2)分别在相应孔中加入100μlHCV-NS3校准品或血清样本，然后，每孔加100μl样品稀释液，充分振荡混匀，用封板膜封板后，置37℃振荡温浴40min。
(3)小心揭掉封板膜，甩干孔内液体，用稀释后的洗涤液充分洗涤6遍，每次每孔应加入至少300μl稀释后的洗涤液，最后在干净的吸水纸上拍干，每孔加入200μl稀释后的浓缩的抗体酶结合物，振荡混匀，用另一张封板膜封板后，置37℃振荡温浴30min。
(4)小心揭掉封板膜，甩干孔内液体，用稀释后的洗涤液充分洗涤6遍，每次每孔应加入至少300μl稀释后的洗涤液，最后在干净的吸水纸上拍干，每孔加入100μl单组份TMB显色液，振荡混匀，37℃避光温浴10min。
(5)每孔加入50μl终止液，振荡混匀。使用酶标仪在450nm波长处测量各孔吸光度值。用空白孔调零点。选择双波长450nm和630nm(参比波长)进行测量，需在终止反应后10min内进行测定。
数据处理：应用双对数log-log线性拟合方法处理数据。以各校准品浓度的对数为纵坐标(Y轴)，各校准品OD值(需减去S0的OD值)的对数为横坐标(X轴)作图，建立标准曲线，校准曲线相关系数r：≥0.9900，从标准曲线上可计算出样本的HCV-NS3浓度。
采集576例健康体检血清标本，确认无严重高脂血或污染，测定其HCVNS3浓度值，确定本发明试剂盒的参考区间：
通过对576例健康体检血清标本进行测定，确定当测定其HCVNS3浓度值小于10.73ng/mL时，为HCV-NS3抗原阴性；当测定其HCVNS3浓度值大于10.73ng/mL时，为HCV-NS3抗原阳性。
本发明试剂盒对HCVNS3浓度的检测范围为1-660ng/mL。
基因分型结果分析：通过对242份HCV-NS3抗原阳性样品的基因分型结果进行统计，1b型178份，占73.6％；2a型53份，占21.9％；3a型4份，占1.7％；3b型5份，占2.1％；6a型2份，占0.8％；说明本试剂可以覆盖在我国流行的HCV主要基因型。
实施例三
临床研究
3.1在对1245例临床乙型肝炎患者血清样本的检测中，应用本发明试剂盒测得HCV-NS3抗原阳性率为59％，与HCV-RNA阳性重合率为80％，与抗-HCV阳性重合率为64％。
3.2在对319名丙肝患者进行针对NS3的药物(Simprevir)疗效的对比研究中，应用本发明试剂盒监测患者治疗效果，结果发现；丙肝患者在接受针对NS3治疗时，在监测治疗效果方面，本发明试剂盒显示出较HCV-RNA检测方法更高的灵敏度。
本发明试剂盒的检测方法的局限性：
(1)本发明试剂盒适用于人血清样本的测定。
(2)血液样本未完全凝集，或样本受到污染均不能用于检测。
(3)应用新鲜样本进行检测，避免使用长期贮存或反复冻融的样本。
(4)本试剂仅用于定性检测人血清样品中总的HCVNS3抗原。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒，其特征在于：包括如下主要成分：抗HCV-NS3单克隆抗体包被板、HCV-NS3校准品、样品稀释液、浓缩的抗体酶结合物、浓缩的抗体酶结合物稀释液、浓缩洗涤液、单组份TMB显色液、终止液、封板膜。
2.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒，其特征在于：所述抗HCV-NS3单克隆抗体包被板为两种抗HCV-NS3单克隆抗体包被的酶标板。
3.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩的抗体酶结合物为第三种抗HCV-NS3单克隆抗体与辣根过氧化物的酶结合物。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)准备试剂盒和待测样本，将浓缩洗涤液和浓缩的抗体酶结合物分别进行稀释；
(2)加入准备好的待测样本、HCV-NS3校准品和样品稀释液，轻轻震荡均匀，封板，37℃振荡温浴40min；
(3)洗板6次，拍干，加入稀释后的浓缩的抗体酶结合物，封板，37℃振荡温浴30min；
(4)洗板6次，拍干，加入单组份TMB显色液，封板，37℃振荡温浴10min；
(5)加入终止液，10min内在酶标仪上测定OD值；
(6)处理数据。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的试剂盒在检测丙型肝炎病毒中的应用。
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