CN104990914A - 一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂及其制备方法。该试剂是由试剂A和试剂B组成；所述试剂A由0.3g/L~0.9g/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸、6g/L~24g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30、6ml/L~12ml/L的6-甲氧基喹啉、7.98g/L~12.33g/L的二甲基亚砜、0.01~0.1mol/L pH值为3.2~6.8磷酸盐缓冲液组成；所述试剂B为1%的过氧化氢溶液。本发明制备的试剂准确、方便、快速，以直接读数的定量方法、在全自动分析仪器上批量检测组织渗液中肿瘤组织细胞原血红素的含量，其稳定性好，准确度高，特异性强，检测灵敏度也可达到10μg/L。

Description

一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测试剂，具体地说是一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂及其制备方法。

背景技术

渗出是局部组织器官内的液体和细胞成分进入组织间质、体腔、粘膜表面和体表的过程。组织渗液中含有大量脱落细胞，还含有蛋白质、糖、甘油三脂、胆固醇和纤维蛋白原破坏放出的凝血活酶。

在抑癌基因p53发生突变的组织细胞中，失去了p53对糖代谢戊糖磷酸途径限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的抑制，葡萄糖通过戊糖磷酸途径代谢，产生大量还原型辅酶Ⅱ（NADPH）。NADPH作为谷胱甘肽还原酶的辅酶，使氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原成为还原型谷胱甘肽（GSH），细胞内GSH含量增高。谷胱甘肽过氧化物酶以还原型谷胱甘肽(GSH)作为供氢体来分解H₂O₂，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使细胞内GSH：GSSG的比率下降。GSH生成GSSG过程中形成细胞的低氧及还原性状态，激活氧感受器和缺氧信号传导通路，导致蛋白质的巯基由氧化型向还原型转变，促使缺氧特异性转录因子-低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor；HIF-1a）的磷酸化并与HIF-1b结合而形成一个完整的HIF-1转录复合体，与相应靶基因上的缺氧反应元件(HRE)结合，促进靶基因的表达。还通过第二信使-活性氧族(ROS)与激酶系统发生联系，激活激酶系统。上述变化产生一种亲脂性物质（Hydrophilic fatty molecules）进入肿瘤细胞血红素结合蛋白（HP蛋白）的疏水核内，改变蛋白质α链CD3His和β链CD3Ser、E10Lys的极性量值，使位居其疏水核中的原血红素脱落，成为肿瘤组织细胞原血红素，简称TCPH。这种肿瘤组织细胞原血红素是一种酶样物质，具有过氧化物酶样作用。经过特定的氧化-还原反应使细胞内的酶染色，观察细胞酶的显色情况即可测及肿瘤组织细胞原血红素。肿瘤性渗出组织渗液中的脱落肿瘤细胞可能含有肿瘤组织细胞原血红素（The protoheme of tumor cells，TCPH），而组织渗液中是否含有肿瘤组织细胞原血红素对组织渗液性质的鉴定具有重要意义。

经检索，目前尚无肿瘤组织细胞原血红素（TCPH）定量检测试剂。本发明试剂的检测目的物是肿瘤组织细胞原血红素（The protoheme of tumor cells，TCPH），这是一种新近发现的恶性肿瘤组织细胞产生的生物因子。目前，本发明试剂是唯一能实现对该生物因子的定量检测的试剂。近期已有《全自动肿瘤组织细胞原血红素检测分析仪》设计成功，苦无配套试剂。为此，特设计了一种可供上述自动化分析仪器使用的肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂。本发明制备的试剂准确、方便、快速，以读取吸光度的方法、在全自动分析仪器上定量检测组织渗液中肿瘤组织细胞原血红素（TCPH）的含量。

本发明还提供了上述肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂的制备方法。

本发明采用以下技术方案：

一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂，其特征在于，它是由试剂A和试剂B组成；所述试剂A由0.3g/L~0.9g/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸、6g/L~24g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30、6ml/L~12ml/L 的6-甲氧基喹啉、7.98g/L~12.33g/L的二甲基亚砜、0.01~0.1mol/L pH值为3.2~6.8磷酸盐缓冲液组成；所述试剂B为1%的过氧化氢溶液。

所述试剂A与试剂B的体积比为1:1。

作为本发明的一种优选，所述试剂A是由0.6g/L的 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸、12g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30、10g/L的二甲基亚砜、8 ml/L的6-甲氧基喹啉、0.1mol/L pH值为5.5的磷酸盐缓冲液组成。

上述肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂的制备方法，它包括以下步骤：

1）先将3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸溶解于10ml二甲基亚砜中；

2)配制磷酸盐缓冲液;

3)取890ml步骤2）所制的缓冲液，将步骤1）所得溶液与其混合均匀；

4）向步骤3）所得混合溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮K30，充分搅拌使之完全溶解；

5）向步骤4）所得混合溶液中加入6-甲氧基喹啉，并用步骤2）所制磷酸盐缓冲液定容至1000ml，混合均匀即配制成试剂A；

6）将试剂A与1%的过氧化氢溶液等体积混合后即得肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂。

本发明试剂的测试原理如下：肿瘤组织细胞原血红素是一种酶样物质，具有过氧化物酶样作用，具备水解过氧化物的能力。肿瘤细胞原血红素与过氧化物反应，摘取过氧化物的氧原子，并与氧原子结合形成氧化型肿瘤细胞原血红素；氧化型肿瘤细胞原血红素极不稳定，迅即又脱掉氧原子传递给供氢体四甲基联苯胺，使原本不含发色集团的供氢体 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺脱氢，生成含发色集团醌基的蓝色物质联苯胺蓝。样本内若不含有肿瘤组织细胞原血红素，则无联苯胺蓝生成，因之不显色；样本内若含有肿瘤组织细胞原血红素，则有联苯胺蓝生成，反应液逐渐呈现蓝色。显色的深浅与样本内含有的肿瘤组织细胞原血红素成正比。如此，测定反应液显色的吸光度即可测及样本内肿瘤组织细胞原血红素的含量。

 本发明试剂的使用方法如下：使用本发明制备的定量检测原血红素分析试剂，在全自动肿瘤组织细胞原血红素检测分析仪上进行测试。首先分析仪以试剂加样针自动在试剂仓内吸取200μL本发明制备的试剂加入比色管中，再以样本加样针自动在样本瓶内吸取200μL样本加入比色管中，37℃温育使试剂与样本充分反应。在反应144秒的时间点上，以光电比色法自动读取该样本与本发明制备的试剂反应后显色液的吸光度，以此吸光度值通过仪器设定的标准曲线读取相对应的肿瘤组织细胞原血红素的含量值。

本发明的有益效果是：本发明制备的试剂准确、方便、快速，以直接读数的定量方法、在全自动分析仪器上批量检测组织渗液中肿瘤组织细胞原血红素（TCPH）的含量，其稳定性好，该试剂在低温干燥环境下可以稳定保存2年；此外，它的准确度高，特异性强，检测灵敏度也可达到10μg/L。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步的详细说明。

实施例1

肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂的制备

1）先将0.3g的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸溶解于10ml二甲基亚砜中；

2)配制pH为3.2浓度为0.05mol/L磷酸盐缓冲液；

3)取890ml步骤2）所制的缓冲液，将步骤1）所得溶液与其混合均匀；

4）向步骤3）所得混合溶液中加入6g聚乙烯吡咯烷酮K30，充分搅拌使之完全溶解；

5）向步骤4）所得混合溶液中加入6-甲氧基喹啉6ml，并用步骤2）所制磷酸盐缓冲液定容至1000ml，混合均匀即配制成试剂A；

6）将试剂A与1%的过氧化氢溶液等体积混合后即得肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂。

实施例2

肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂的制备

1）先将0.9g的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸溶解于10ml二甲基亚砜中；

2)配制pH为6.8浓度为0.01mol/L磷酸盐缓冲液；

3)取890ml步骤2）所制的缓冲液，将步骤1）所得溶液与其混合均匀；

4）向步骤3）所得混合溶液中加入24g聚乙烯吡咯烷酮K30，充分搅拌使之完全溶解；

5）向步骤4）所得混合溶液中加入6-甲氧基喹啉12ml，并用步骤2）所制磷酸盐缓冲液定容至1000ml，混合均匀即配制成试剂A；

6）将试剂A与1%的过氧化氢溶液等体积混合后即得肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂。

实施例3

肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂的制备

1）先将0.6g的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸溶解于10ml二甲基亚砜中；

2)配制pH为5.5浓度为0. 1mol/L磷酸盐缓冲液；

3)取890ml步骤2）所制的缓冲液，将步骤1）所得溶液与其混合均匀；

4）向步骤3）所得混合溶液中加入12g聚乙烯吡咯烷酮K30，充分搅拌使之完全溶解；

5）向步骤4）所得混合溶液中加入6-甲氧基喹啉8ml，并用步骤2）所制磷酸盐缓冲液定容至1000ml，混合均匀即配制成试剂A；

6）将试剂A与1%的过氧化氢溶液等体积混合后即得肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂。

实施例4

准确度实验

实验设备：全自动肿瘤组织细胞原血红素检测分析仪。

TCPH标准品：

1号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素10mg/L；

2号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素1mg/L；

3号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素100 μg /L；

4号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素10 μg /L；

5号标准品：含肿瘤组织细胞原血红素1 μg /L；

6号标准品：空白对照品。

实验方法：取每个标准品30份，使用实施例3制得的试剂进行肿瘤组织细胞原血红素分析检测，取其均数及标准差与标准含量进行对照并进行统计学处理。

实验结果：如表1所示。

表1 准确度实验结果

各组P值均大于0.05，差别无统计学意义。

通过以上数据可以看出，本专利提供的可供分析仪器使用的肿瘤组织细胞原血红素（TCPH）定量检测试剂准确度高，与全自动化检测仪器《全自动肿瘤组织细胞原血红素检测分析仪》配伍良好。本专利为定量分析组织渗液中可能含有的肿瘤组织细胞原血红素进行自动化分析提供了匹配检测试剂。

实施例5

灵敏度实验

实验方法：用加样器分别向试管中加入0、1、10、50、100μg /L 五种浓度单位标准品，每种标准品加10管，每管200μl，再加入本发明实施例3制得的试剂200μl，在反应144秒的时间点上，以光电比色法自动读取该样本与本发明制备的试剂反应后显色液的吸光度，观察分析结果。实验结果见表2。

表2 灵敏度实验结果

注：（-）吸光度：小于180；

   （+）吸光度：180~800；

   （++）吸光度：800~1900；

   （+++）吸光度：1900以上。

结论：从以上数据结果中可以看出，本发明制备的肿瘤细胞原血红素检测试剂灵敏度较好，最低检出值为10μg /L。

实施例6

特异性实验

实验方法：试管中分别加入人血白蛋白、免疫球蛋白、胆红素标准品和正常人宫颈细胞渗液样本各10份，每管200μl，再加入本发明实施例3制得的试剂200μl。在反应144秒的时间点上，以光电比色法自动读取该样本与本发明制备的试剂反应后显色液的吸光度。实验结果：如表3所示。

表3 特异性实验结果

   结论：未含有肿瘤组织细胞原血红素的样本吸光度均低于184，表明本检测试剂特异性良好。

实施例7

稳定性实验

实验方法：取本发明实施例3制得的试剂100ml，在37℃条件下放置30天、60天及100天后，重复准确度实验，实验方法及设备同实施例4。实验结果见表4。

表4  37℃放置不同时间试剂准确度实验结果

从以上实验数据结果可以看出，本发明制备的肿瘤组织细胞原血红素检测试剂稳定性好，在37℃加速实验条件下，其检测准确度仍保持非常稳定的水平。此外，本发明还分别对上述试剂进行特异性和灵敏度检测，其检测结果与新制试剂基本相差无几。低温干燥环境下该试剂可以稳定保存2年。因而，本发明试剂是一种稳定性极好的用于检测肿瘤组织细胞原血红素的检测试剂。

Claims (4)

1.一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂，其特征在于，它是由试剂A和试剂B组成；所述试剂A由0.3g/L~0.9g/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸、6g/L~24g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30、6ml/L~12ml/L 的6-甲氧基喹啉、7.98g/L~12.33g/L的二甲基亚砜、0.01~0.1mol/L pH值为3.2~6.8磷酸盐缓冲液组成；所述试剂B为1%的过氧化氢溶液。

2.根据权利要求1所述的肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂，其特征在于，所述试剂A与试剂B的体积比为1:1。

3.根据权利要求1所述的肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂，其特征在于，所述试剂A是由0.6g/L的 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸、12g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30、10g/L的二甲基亚砜、8 ml/L的6-甲氧基喹啉、0.1mol/L pH值为5.5的磷酸盐缓冲液组成。

4.一种权利要求1至3项中任一项所述的肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂的制备方法，它包括以下步骤：

1）先将3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸溶解于10ml二甲基亚砜中；

2)配制磷酸盐缓冲液;

3)取890ml步骤2）所制的缓冲液，将步骤1）所得溶液与其混合均匀；

4）向步骤3）所得混合溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮K30，充分搅拌使之完全溶解；

5）向步骤4）所得混合溶液中加入6-甲氧基喹啉，并用步骤2）所制磷酸盐缓冲液定容至1000ml，混合均匀即配制成试剂A；

6）将试剂A与1%的过氧化氢溶液等体积混合后即得肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂。