CN109706140B - 一种嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，包括：二硫代二丙酸经活化剂活化羧基后与透明质酸发生反应制得中间体，中间体经活化剂活化羧基后与聚乳酸‑羟基乙酸发生反应制得嵌段聚合物，将嵌段聚合物溶于去离子水，制得嵌段聚合物胶束溶液；将脂肪酶粉溶于pH＝8.0的磷酸缓冲盐溶液中，搅拌离心，将上清液转移到容量瓶中，用pH＝8.0的缓冲溶液定容后，得到酶促合成氰氟草酯脂肪酶；将聚合物胶束溶液与酶促合成氰氟草酯脂肪酶混合，抽滤后加入去离子水溶解，并用pH＝8.0磷酸盐缓冲液洗至去除多余的脂肪酶，定容到1L的pH＝8.0磷酸盐缓冲液，冷冻干燥得到嵌段聚合物胶束固定化的脂肪酶。本发明工艺简单。
Description
技术领域
本发明属于聚合物领域，更具体涉及一种嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法。
背景技术
脂肪酶基本上存在于所有的生物体中，它在对脂类(如甘油三酸醋、脂肪、油等)的消化、运输和剪切中发挥着关键作用。脂肪酶能够催化酯类的水解反应、醇解反应、酯交换化反应以及水解的逆向合成等多种反应，具有稳定性高、底物特异性广泛、催化活性高且副反应少等特点，是一种重要的生物催化剂。因此，脂肪酶在能源领域，食品工业、洗涤剂、油脂工业、医药工业、农业等诸多领域都有重要的应用。
脂肪酶作为一种绿色生物催化剂，具有高催化活性、副反应少、低污染、操作稳定性高等一系列优点，然而，脂肪酶在实际工业应用中，自身也存在一些局限性:在高温、有机溶剂、强酸或强碱等条件下不够稳定，易变性失活，对环境的耐受性差；易被降解，反应过程中易发生团聚现象，与底物难以充分接触。游离脂肪酶价格比较高，而且一般只能催化一次反应，无法从反应体系中回收和重复利用，使得产品的生产成本大大提高，限制其在工业实践中的广泛应用。
而酶的固定化技术极大的扩展了酶的应用范围。固定化酶是通过适当的方法将酶固定在一定的空间内，在保持其自身特性的同时能够实现回收和重复利用。固定化酶的出现解决了游离酶实际应用中的诸多局限。因此，开发新型脂肪酶和研究脂肪酶的固定化技术是十分迫切的。酶的固定化可以使酶容易从反应混合物中分离回收，以便用于下一步反应。此外，酶的固定化还可以提高其热稳定性和化学稳定性和抵抗外界极端变化条件，所以开发新的脂肪酶固定化体系成为目前关注的中心。
氰氟草酯(Cyhalofop-butyl)，化学名称为(R)-2-[4-(4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]丙酸丁酯，是由美国陶氏益农公司(Dow AgroSciences Company)于1987年首先开发并于1992年正式上市的一种对水稻具有高度安全性的除草剂，对水稻田的芽后除草，尤其是对稗草、小糠草、千金子等具有良好的效果。目前，国内报道的氰氟草酯的合成方法主要为化学合成法，有两条主要的合成路线：(1)以(S)-乳酸甲酯为起始原料,与对甲苯磺酰氯反应制备(S)-对甲苯磺酰乳酸甲酯,再与对苯二酚反应制备(R)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸乙酯,然后再与3，4-二氟苯腈反应制备(R)-2-[4-(4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]丙酸乙酯，经水解、酯化合成氰氟草酯。该合成方法被报道于2007年第11卷第1期的《农药研究与应用》，名称为“氰氟草酯的合成”。该合成方法中涉及酸或碱催化以及高温反应，容易引起消旋化，导致光学纯度下降，总收率仅为49％；(2)对苯二酚与3,4-二氟苯腈进行醚化反应得到3-氟-4-(4-羟基苯氧基)苯腈,然后与(S)-对甲苯磺酰乳酸酯反应生成氰氟草酯。该合成方法被报道于2010年第49卷第5期的《农药》，名称为“除草剂氰氟草酯的合成”。该合成方法因为受到原材料纯度和反应条件的影响，(R)-异构体的产率为70％-90％。总之，通过化学合成法合成氰氟草酯，选择性差，总收率偏低，且环境处理成本较高，不符合当前绿色化工的发展趋势。
中国专利CN103255125A公开了一种嵌段聚合物固定化酶的制备方法，该合成方法中制备聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜，提取工艺复杂且成本高，难以广泛应用于工业化生产。透明质酸和聚乳酸-羟基乙酸原料易得，生产工艺简单。因此，开展嵌段聚合物胶束对于酶尤其是脂肪酶的固定化技术，并将其用于氰氟草酯原药合成但不仅限于该产品的工业化生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备过程简单的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法。
根据本发明的一个方面，提供了一种嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，包括：
配制嵌段聚合物胶束：所述二硫代二丙酸经活化剂活化羧基后与所述透明质酸发生反应制得中间体，所述中间体经活化剂活化羧基后与聚乳酸-羟基乙酸发生反应制得嵌段聚合物，将嵌段聚合物溶于去离子水，制得嵌段聚合物胶束溶液；
配制脂肪酶酶液：将一定量的脂肪酶粉溶于pH＝8.0的磷酸缓冲盐溶液中，5℃下搅拌均匀后，以转速为12000r/min高速离心3min，将上清液转移到容量瓶中，用pH＝8.0的缓冲溶液定容后，得到酶促合成氰氟草酯脂肪酶；
脂肪酶的固定化：将聚合物胶束溶液与酶促合成氰氟草酯脂肪酶混合，抽滤后加入去离子水溶解，并用pH＝8.0磷酸盐缓冲液洗至去除多余的脂肪酶，定容到1L的pH＝8.0磷酸盐缓冲液，冷冻干燥得到嵌段聚合物胶束固定化的脂肪酶。
在一些实施方式中，所述透明质酸与二硫代二丙酸的质量比1:2-4，所述活化剂与二硫代二丙酸的摩尔比0.8-1.2:1。
在一些实施方式中，制备所述中间体的反应温度为30-45℃，反应时间为10-16h。
在一些实施方式中，所述配制嵌段聚合物胶束的反应溶剂选自水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、氯仿和丙酮中的一种或几种。
在一些实施方式中，所述活化剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。
在一些实施方式中，所述聚合物胶束的结构式为：
在一些实施方式中，所述的脂肪酶是从动物、植物或微生物中提取的一种。
在一些实施方式中，所述酶促合成氰氟草酯脂肪酶的活性为512U/g，加酶量为10mg/g。
在一些实施方式中，所述脂肪酶的固定化时间为24h，固定化温度为28℃，固定化pH为8.0。
根据本发明的另一个方面，提供了一种氰氟草酯的合成方法，以底物1、底物2为原料，以权利要求1-9任一项所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶为酶催化剂，经酶促酯交换合成氰氟草酯，所述底物1为(R)-2-[4-(4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]丙酸乙酯，所述底物2选自正丁醇、乙酸正丁酯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正丁酯、硬脂酸正丁酯、肉桂酸正丁酯中的一种，反应方程式如下：
其有益效果为：本发明的嵌段聚合物胶束的制备及其酶固定化工艺简单；本发明制备的嵌段聚合物胶束从投射电镜中可以看出其具有高比表面积和高空隙率，有利于提高固定化酶的载酶量和提高固定化酶的催化效率；本发明的嵌段聚合物胶束为酶的固定化载体，易于从反应体系中回收，可以重复使用，极大地提高酶的利用率和降低生产成本；本发明的嵌段聚合物胶束具有良好的生物相容性，可以为其表面固定化酶蛋白提供良好的微环境；在固定化酶催化合成氰氟草酯的过程中，本发明的酶的使用寿命和效率大大提高，本发明固定化酶重复使用10次后，制备的氰氟草酯的光学纯达到99％以上。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
1、中间体透明质酸一二硫代二丙酸(HA-ss-)的合成
将1.578g二硫代二丙酸、1.437g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.861g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于20ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，40℃活化30min待用。称取0.6g透明质酸(HA)分散于20mL蒸馏水中，加入微量氢氧化钠(Na0H)调其pH为7-8，搅拌条件下将其缓慢滴入二硫代二丙酸溶液中，40℃搅拌反应12h后，用蒸馏水透析1d(MWCO＝1000)，透析液过滤，滤液冷冻干燥，即得HA-ss-，产率为95％。
2、聚合物胶束(HA-ss-PLGA)的合成
1g HA-ss-粉末溶解在10mL无水二甲基亚砜(DMSO)中，80℃反应2h。溶液冷却到室温，加入1.25mol二环己基碳二亚胺(DCC)和1.25mol4-二甲氨基吡啶(DMAP)，搅拌48h。将分子量为5kDa的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于5mL二甲基亚砜(DMSO),在氮气氛围下加入上述溶液，反应48h。用DMSO透析1d，用蒸馏水透析3d(MWCO＝12000)。透析液过滤，沉淀用丙酮洗，即得HA-ss-PLGA。
3、嵌段聚合物胶束的合成
将聚合物胶束(HA-ss-PLGA)溶于5ml去离子水中，冰浴探头超声50次(400w，工作2s停2s)，制得lmg/mL的嵌段聚合物胶束溶液。
4、配制脂肪酶酶液
将脂肪酶酶粉，溶于pH＝8.0的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，5℃下搅拌均匀后，12000r/min高速离心3min，将上清液转移到容量瓶中，用pH＝8.0的缓冲溶液定容后，得到酶促合成氰氟草酯脂肪酶。
5、脂肪酶的固定化
将步骤4处理的固定化载体HA-ss-PLGA与步骤5中的酶促合成氰氟草酯脂肪酶的酶液混合，其中，酶促合成氰氟草酯脂肪酶的活性为512U/g，其加酶量为10mg/g，25℃，18Orpm作用12h，抽滤，加入去离子水溶解，并用定容到1L的pH＝8.0磷酸盐缓冲液洗三次，去除多余的脂肪酶溶液，冷冻干燥得到嵌段聚合物胶束固定化的脂肪酶。
5.1、固定化时间对固定化的影响
固定化时间过短，固定化不完全，导致固定化酶的活性过低，固定化时间过长，酶的活性会下降，间接导致固定化酶的活性下降。因此，嵌段聚合物胶束的固定化时间小于24h时，随着固定化时间的增加，固定化酶的活力有所增加。而酶与载体的固定化时间大于24h后酶活力开始下降，可能原因是固定化时间延长，导致酶活力的下降，反而不利于固定化酶活力的提高。综上所述，固定化载体嵌段聚合物胶束对脂肪酶的最佳固定化时间为24h。
5.2、固定化温度对固定化的影响
选择合适的固定化温度，对固定化酶的活力是至关重要的。低温条件下，有利于酶活力的保持，但分子交换的速度变慢，会使固定化时间延长；而提高温度，不利于酶活力的保持，但固定化时间会相对降低，提高固定化的效率。固定化温度在5℃到28℃之间时，随着温度的增加，固定化酶的活力增加，可能是温度上升，有利于酶的吸附；温度超过28℃，固定化酶的活力开始下降，可能是温度上升导致酶的活力有所下降，固定化载体嵌段聚合物胶束对脂肪酶的最佳固定化温度为28℃。
5.3、pH对固定化的影响
pH直接影响酶的活力，过高过低都不利于固定化酶活性的提高。脂肪酶在pH＝8.0的缓冲液中，活力最高。因此，固定化载体嵌段聚合物胶束对脂肪酶的最佳固定化pH为8.0。
由上所述，本发明提供一种脂肪酶的固定化方法中的最佳固定化条件:固定化时间为24h，固定化温度为28℃，固定化pH为8.0。
5.4、固定化脂肪酶和游离酶的热稳定性
研究固定化脂肪酶和游离脂肪酶在20℃、30℃、40℃、50℃、6O℃、70℃、80℃下作用3h，测定不同温度作用后的活力变化，以最高酶活数据为100％酶活力，结果表明:游离脂肪酶活性在80℃加热3h后剩余26.7％，固定化脂肪酶的酶活性保持在82.4％。嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的活性相对游离酶有了很大的提高，酶的热稳定性在固定化后增强，因为固定化载体为酶分子的保持提供了额外的保护骨架。
5.5、固定化脂肪酶的重复使用性及光学纯
以(R)-2-[4-(4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]丙酸乙酯为原料，经酶促酯交换合成氰氟草酯：在反应器中加入底物1、底物2和反应介质，按每克(R)-2-[4-(4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]丙酸乙酯加入脂肪酶，在20℃、常压条件下反应3h后，将产物分离提纯得到氰氟草酯。底物1为(R)-2-[4-(4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]丙酸乙酯；底物2选自正丁醇、乙酸正丁酯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正丁酯、硬脂酸正丁酯、肉桂酸正丁酯中的一种；底物1与底物2的摩尔比为1：(1-100)；反应介质选自有机溶剂、离子液体中的一种或两种混合，其用量是按每克(R)-2-[4-(4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]丙酸乙酯加入0.01L。反应方程式如下：
将固定化脂肪酶按照脂肪酶测定条件(40℃，8min)测定酶活，用pH＝8的磷酸盐缓冲液洗两次，重新加入底物1与底物2，测定合成手性氰氟草酯所需固定酶的重复使用性和光学纯，重复该过程10次。计算每次剩余的固定化酶酶活和光学纯。结果表明，重复使用5次后，固定化载体嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶保留其活性的90％，光学纯保持在99％以上。在重复使用性过程中，固定化脂肪酶是紧密附着在载体上，从而保持活性。在重复使用10次后，嵌段聚合物胶束修饰的脂肪酶的活性保持在80.2％，氰氟草酯的光学纯保持在99％以上。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域普通技术人员来讲，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，其特征在于，包括：
配制嵌段聚合物胶束：二硫代二丙酸经活化剂活化羧基后与透明质酸发生反应制得中间体，所述中间体经活化剂活化羧基后与聚乳酸-羟基乙酸发生反应制得嵌段聚合物，将嵌段聚合物溶于去离子水，制得嵌段聚合物胶束溶液；
配制脂肪酶酶液：将一定量的脂肪酶粉溶于pH＝8.0的磷酸缓冲盐溶液中，5℃下搅拌均匀后，以转速为12000r/min高速离心3min，将上清液转移到容量瓶中，用pH＝8.0的缓冲溶液定容后，得到酶促合成氰氟草酯脂肪酶；
脂肪酶的固定化：将聚合物胶束溶液与酶促合成氰氟草酯脂肪酶混合，抽滤后加入去离子水溶解，并用pH＝8.0磷酸盐缓冲液洗至去除多余的脂肪酶，定容到1L的pH＝8.0磷酸盐缓冲液，冷冻干燥得到嵌段聚合物胶束固定化的脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述透明质酸与二硫代二丙酸的质量比1:2-4，所述活化剂与二硫代二丙酸的摩尔比0.8-1.2:1。
3.根据权利要求1所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，其特征在于，制备所述中间体的反应温度为30-45℃，反应时间为10-16h。
4.根据权利要求1所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述配制嵌段聚合物胶束的反应溶剂选自水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、氯仿和丙酮中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述活化剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述聚合物胶束的结构式为：
其中，n＝10-30，m＝200-210。
7.根据权利要求1所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述的脂肪酶是从动物、植物或微生物中提取的一种。
8.根据权利要求1所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述酶促合成氰氟草酯脂肪酶的活性为512U/g，加酶量为10mg/g。
9.根据权利要求1所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述脂肪酶的固定化时间为24h，固定化温度为28℃，固定化pH为8.0。
10.一种氰氟草酯的合成方法，其特征在于，以底物1、底物2为原料，以权利要求1-9任一项所述的嵌段聚合物胶束固定化脂肪酶为酶催化剂，经酶促酯交换合成氰氟草酯，所述底物1为(R)-2-[4-(4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]丙酸乙酯，所述底物2选自正丁醇、乙酸正丁酯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正丁酯、硬脂酸正丁酯、肉桂酸正丁酯中的一种，反应方程式如下：
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