CN101240075B

CN101240075B - 壳聚糖磁性微球的制备方法及磁性微球固定化酵母的方法

Info

Publication number: CN101240075B
Application number: CN2008100640765A
Authority: CN
Inventors: 冯玉杰; 王健; 田言
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2008-03-07
Filing date: 2008-03-07
Publication date: 2011-04-20
Anticipated expiration: 2028-03-07
Also published as: CN101240075A

Abstract

壳聚糖磁性微球的制备方法及磁性微球固定化酵母的方法，它涉及一种磁性微球的制备方法及磁性微球固定化酵母的方法。本发明采用悬浮乳液聚合法制备壳聚糖磁性微球。本发明通过溶胀-吸附法将酵母细胞固定到磁性微球上。本发明壳聚糖磁性微球兼具磁性粒子和高分子材料的双重特性。固定化酵母细胞不随发酵液排出系统，避免了消耗，保持了发酵罐中酵母细胞浓度，提升了酒精发酵速度，缩短了发酵时间，减少了资源消耗量，并同时降低了废水的排放量和废水处理的难度。

Description

壳聚糖磁性微球的制备方法及磁性微球固定化酵母的方法

技术领域

本发明涉及一种磁性微球的制备方法及磁性微球固定化酵母的方法。

背景技术

传统的酒精发酵工艺，采用玉米粉碎、液化、糖化、发酵连续进行的工艺，此过程中使用的是游离酵母细胞，发酵完成后，酵母细胞随发酵液排出系统，不但造成资源浪费，还增加了废水排放量和废水处理难度。

发明内容

本发明的目的是为了解决传统酒精发酵工艺中使用游离酵母细胞，酵母细胞随发酵液排出系统而消耗，造成发酵罐中酵母细胞浓度不够大，酒精发酵速度慢，发酵时间长，不但造成资源浪费，还增加了废水排放量和废水处理难度的问题，而提供的壳聚糖磁性微球的制备方法及磁性微球固定化酵母的方法。

壳聚糖磁性微球按以下步骤制备：一、按重量百分比将2％～5％的壳聚糖、2％～3％的磁性纳米Fe₃O₄颗粒和余量的乙酸溶液搅拌均匀，制成壳聚糖溶液；二、在搅拌速度为3000r/min的室温条件下步骤一制备的壳聚糖溶液以珠状加入到有机分散介质中，壳聚糖溶液完全加入后继续搅拌10min，然后再加入壳聚糖溶液体积4％～10％的交联剂，在3000r/min的搅拌速度下反应2～4h；三、用磁铁收集磁性微球初品，然后依次用石油醚和丙酮连续清洗，再放入40℃的条件下干燥2天，即得到壳聚糖磁性微球；其中步骤一中乙酸溶液的质量浓度为5％；步骤二中有机分散介质按体积份数比由25～40份的液体石蜡、30～45份的石油醚和1.2～2份的乳化剂组成。

磁性微球固定化酵母按以下步骤制备：一、酿酒活性干酵母复水活化；二、酿酒酵母扩大培养，然后将菌体离心、洗涤，制成酵母细胞悬浮液；三、将上述制备的壳聚糖磁性微球放入4℃的酿酒酵母培养液中溶胀48～96h；四、取出溶胀的壳聚糖磁性微球放入酵母细胞悬浮液中，并在30～35℃、100～150r/min的条件下反应12～48h，然后再用质量浓度为0.9％NaCl溶液洗涤，磁分离，即得到磁性微球固定化酵母；步骤四中酵母细胞悬浮液与壳聚糖磁球的质量比为2～6∶1。

本发明壳聚糖磁性微球是在磁性纳米Fe₃O₄颗粒表面包裹高分子材料壳聚糖，本发明壳聚糖磁性微球兼具磁性粒子和高分子材料的双重特性，一方面具有超顺磁性，在外加磁场的作用下能快速、简单地分离，并可在磁场作用下定位；另一方面具有与生物活性物质反应的特殊功能团，可以结合各种生物活性物质(包括活性酵母)。壳聚糖本身就具有很好的吸附性、成模性和通透性、成纤性、吸湿性和保湿性，并且具有优良的生物亲和性，其分子链上丰富的羟基和氨基使其易于进行化学修饰，从而赋予其多种功能。壳聚糖是天然存在的唯一的碱性多糖，壳聚糖上的游离氨基可与醛发生缩合反应生成西佛碱，可由双官能团的醛或酸酐等进行交联，得到网状结构的不溶产物(交联的目的是使产物不溶解)，甚至溶胀也很小，性质稳定。

本发明壳聚糖磁性微球生物亲和性好，粒径均匀，磁响应性强为2950～3100Gs。

本发明磁性微球固定化酵母可放入磁场稳定的流动床反应器中，能够减少持续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作；而且利用外部磁场可以控制本发明磁性微球固定化酵母的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酵母的催化效率。采用本发明磁性微球固定化酵母发酵酒精不仅可以形成良好的无氧发酵环境，还可以大幅降低酒精废水中悬浮物的含量。固定化酵母细胞不随发酵液排出系统，避免了消耗，保持了发酵罐中酵母细胞浓度，提升了酒精发酵速度，缩短了发酵时间，减少了资源消耗量，并同时降低了废水的排放量和废水处理的难度。

附图说明

图1是具体实施方式十三制备的壳聚糖磁性微球的扫描电镜图片，图2是具体实施方式二十二制备的磁性微球固定化酵母的显微镜观察图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式壳聚糖磁性微球按以下步骤制备：一、按重量百分比将2％～5％的壳聚糖、2％～3％的磁性纳米Fe₃O₄颗粒和余量的乙酸溶液搅拌均匀，制成壳聚糖溶液；二、在搅拌速度为3000r/min的室温条件下步骤一制备的壳聚糖溶液以珠状加入到有机分散介质中，壳聚糖溶液完全加入后继续搅拌10min，然后再加入壳聚糖溶液体积4％～10％的交联剂，在3000r/min的搅拌速度下反应2～4h；三、用磁铁收集磁性微球初品，然后依次用石油醚和丙酮连续清洗，再放入40℃的条件下干燥2天，即得到壳聚糖磁性微球；其中步骤一中乙酸溶液的质量浓度为5％；步骤二中有机分散介质按体积份数比由25～40份的液体石蜡、30～45份的石油醚和1.2～2份的乳化剂组成。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中有机分散介质的体积为加入的壳聚糖溶液体积的1～1.6倍。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中有机分散介质的体积为加入的壳聚糖溶液体积的1.2倍。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中有机分散介质的体积为加入的壳聚糖溶液体积的1.4倍。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中加入壳聚糖溶液体积6％的交联剂。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中加入壳聚糖溶液体积8％的交联剂。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一、五或六的不同点是：步骤二中的交联剂为戊二醛或甲醛。其它步骤及参数与实施方式一、五或六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：步骤二中的交联剂为戊二醛，并用NaOH调节反应环境pH值到9～10。其它步骤及参数与实施方式五相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中有机分散介质按体积份数比由30份的液体石蜡、40份的石油醚和1.8份的乳化剂组成。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中有机分散介质按体积份数比由35份的液体石蜡、35份的石油醚和1.5份的乳化剂组成。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一、九或十的不同点是：步骤二有机分散介质中的乳化剂为Tween-80或Span-40。其它步骤及参数与实施方式一、九或十相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中按重量百分比将3％的壳聚糖、2.5％的磁性纳米Fe₃O₄颗粒和94.5％乙酸溶液搅拌均匀。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式十三：本实施方式壳聚糖磁性微球按以下步骤制备：一、按重量百分比将2％的壳聚糖、2％的磁性纳米Fe₃O₄颗粒和余量的乙酸溶液搅拌均匀，制成壳聚糖溶液；二、在搅拌速度为3000r/min的室温条件下步骤一制备的壳聚糖溶液以珠状加入到有机分散介质中，壳聚糖溶液完全加入后继续搅拌10min，然后再加入壳聚糖溶液体积4％的戊二醛，并用NaOH调节反应环境pH值到9～10，在3000r/min的搅拌速度下反应3h；三、用磁铁收集磁性微球初品，然后依次用石油醚和丙酮连续清洗，再放入40℃的条件下干燥2天，即得到壳聚糖磁性微球；其中步骤一中乙酸溶液的质量浓度为5％；步骤二中有机分散介质按体积份数比由25份的液体石蜡、35份的石油醚和1.2份的乳化剂Tween-80组成。

本实施方式壳聚糖磁性微球表面有氨基和羧基，在水溶液分散性好，生物亲和性好，可以作为细胞、酶或者其他生物材料的良好载体应用于不同领域。本实施方式壳聚糖磁性微球粒径为10μm左右，大小比较均一，单分散性好；本实施方式壳聚糖磁性微球的磁饱和强度为2954Gs，磁响应性强。本实施方式壳聚糖磁性微球的扫描电镜图片如图1所示。

具体实施方式十四：本实施方式磁性微球固定化酵母按以下步骤制备：一、酿酒活性干酵母复水活化；二、酿酒酵母扩大培养，然后将菌体离心、洗涤，制成酵母细胞悬浮液；三、将具体实施方式一制备的壳聚糖磁性微球放入4℃的酿酒酵母培养液中溶胀48～96h；四、取出溶胀的壳聚糖磁性微球放入酵母细胞悬浮液中，并在30～35℃、100～150r/min的条件下反应12～48h，然后再用质量浓度为0.9％NaCl溶液洗涤，磁分离，即得到磁性微球固定化酵母；步骤四中酵母细胞悬浮液与壳聚糖磁球的质量比为2～6∶1。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十四的不同点是：步骤一中酿酒活性干酵母复水活化的温度为38～40℃。其它步骤及参数与实施方式十四相同。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十四的不同点是：步骤一中用清水或含糖量为4％～10％的水溶液复水活化；清水活化时间为14～20min，含糖水溶液活化时间为4±0.5h。其它步骤及参数与实施方式十四相同。

具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十四的不同点是：步骤一中用清水或含糖量为6％的水溶液复水活化；清水活化时间为16min，含糖水溶液活化时间为4h。其它步骤及参数与实施方式十四相同。

具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十四的不同点是：步骤一中用清水或含糖量为8％的水溶液复水活化；清水活化时间为18min，含糖水溶液活化时间为4。其它步骤及参数与实施方式十四相同。

具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式十四的不同点是：步骤二中酿酒酵母扩大培养至对数期。其它步骤及参数与实施方式十四相同。

本实施方式扩大培养时间一般为12～30h。

具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式十四的不同点是：步骤二中菌体用质量浓度为0.9％NaCl溶液洗涤。其它步骤及参数与实施方式十四相同。

具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式十四的不同点是：步骤四中酵母细胞悬浮液与壳聚糖磁球的质量比为4∶1。其它步骤及参数与实施方式十四相同。

具体实施方式二十二：本实施方式磁性微球固定化酵母按以下步骤制备：一、酿酒活性干酵母在38℃的清水中复水活化20min；二、酿酒酵母扩大培养，然后将菌体离心、洗涤，制成酵母细胞悬浮液；三、将具体实施方式一制备的壳聚糖磁性微球放入4℃的酿酒酵母培养液中溶胀48h；四、取出溶胀的壳聚糖磁性微球放入酵母细胞悬浮液中，并在34℃、110r/min的条件下反应34h，然后再用质量浓度为0.9％NaCl溶液洗涤，磁分离，即得到磁性微球固定化酵母；步骤四中酵母细胞悬浮液与壳聚糖磁球的质量比为4∶1。

本实施方式步骤二中在34℃、110r/min的条件下扩大培养14h，用血球计数板测得酵母数为5000万/mL，说明酵母已经达到对数期。本实施方式本实施方式磁性微球固定化酵母的显微镜观察图如图2所示。

本实施方式磁性微球固定化酵母的载体为壳聚糖磁性微球，通过溶胀-吸附法将酵母细胞固定到磁性微球上，成为磁性固定化酵母。本实施方式磁性微球固定化酵母偶联酵母量大，磁响应性强，生物亲和性好，可以回收重复使用。

Claims

1.磁性微球固定化酵母的方法，其特征在于磁性微球固定化酵母按以下步骤制备：一、酿酒活性干酵母复水活化；二、酿酒酵母扩大培养，然后将菌体离心、洗涤，制成酵母细胞悬浮液；三、将壳聚糖磁性微球放入4℃的酿酒酵母培养液中溶胀48～96h；四、取出溶胀的壳聚糖磁性微球放入酵母细胞悬浮液中，并在30～35℃、100～150r/min的条件下反应12～48h，然后再用质量浓度为0.9％NaCl溶液洗涤，磁分离，即得到磁性微球固定化酵母；步骤四中酵母细胞悬浮液与壳聚糖磁球的质量比为2～6∶1；步骤三中所述壳聚糖磁性微球以下步骤制备：a、按重量百分比将2％～5％的壳聚糖、2％～3％的磁性纳米Fe₃O₄颗粒和余量的乙酸溶液搅拌均匀，制成壳聚糖溶液；b、在搅拌速度为3000r/min的室温条件下步骤a制备的壳聚糖溶液以珠状加入到有机分散介质中，壳聚糖溶液完全加入后继续搅拌10min，然后再加入壳聚糖溶液体积4％～10％的交联剂，在3000r/min的搅拌速度下反应2～4h；c、用磁铁收集磁性微球初品，然后依次用石油醚和丙酮连续清洗，再放入40℃的条件下干燥2天，即得到壳聚糖磁性微球；步骤a中乙酸溶液的质量浓度为5％，步骤b中有机分散介质按体积份数比由25～40份的液体石蜡、30～45份的石油醚和1.2～2份的乳化剂组成。

2.根据权利要求1所述的磁性微球固定化酵母的方法，其特征在于步骤一中酿酒活性干酵母复水活化的温度为38～40℃。

3.根据权利要求1所述的磁性微球固定化酵母的方法，其特征在于步骤一中用清水或含糖量为4％～10％的水溶液复水活化；清水活化时间为14～20min，含糖水溶液活化时间为4±0.5h。

4.根据权利要求1所述的磁性微球固定化酵母的方法，其特征在于步骤二中酿酒酵母扩大培养至对数期。

5.根据权利要求1所述的磁性微球固定化酵母的方法，其特征在于步骤二中菌体用质量浓度为0.9％NaCl溶液洗涤。