CN108949738B - 一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法及其应用。该制备方法包括:将海藻酸钠、Fe3O4/CS磁性材料和1‑丁基‑3‑甲基咪唑六氟磷酸盐混合,得到混合溶液;将所述混合溶液与细胞悬液进行混合,得到混悬液;以CaCl2为交联剂,将所述混悬液进行固定化处理,得到磁性负载离子液体微球固定化细胞。本发明制得的固定化细胞因具有磁性而为其在分离和连续发酵提供了便利,磁性材料上负载的离子液体大大提升了固定化细胞的催化活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物固定化细胞技术领域,尤其涉及一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法及其应用。
背景技术
离子液体(Ionic liquids,ILs)是指由阴阳离子构成在室温下呈液体的有机熔盐。作为一种新型绿色介质,离子液体迫于国际社会对绿色清洁生产、环境保护、循环经济的强烈愿望以及离子液体自身的科学探索价值和巨大的应用潜力。
离子液体在生物催化应用的报道逐年增加,呈现出良好的发展势头,离子液体作为共溶剂与许多酶、基质结合的生物转化过程已成为一个重要的研究课题。
文献(李扬,曹红,李春,郑兰,张馨.不同阴离子组成的离子液体对产紫青霉生长、代谢及催化特性的影响[J].高等学校化学学报,2014,35(5):1057-1062.DOI:10.7503/cjcu20130859)以甘草酸(Glycyrrhizin,GL)生物转化为更高效、更安全的单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG)为目的,分别在几种含不同离子液体的介质中初步进行了Penicillium purpurogenum Li-3全细胞生物转化GL生成GAMG的研究。
结果表明,在1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系中,GAMG的产率比在纯缓冲液中高出了2倍多。由此可以看出,选择适当的离子液体作为催化介质可以提高Penicillium purpurogenum Li-3菌株全细胞催化效率。
研究还表明,以离子液体为催化介质,有利于维持细胞的完整性,改善细胞膜的通透性,加速传质作用,促进营养物质进入细胞内,提高营养物质利用率;离子液体进入细胞还可以作用于胞内酶的活性位点,提高酶的催化活性。
然而,离子液体作为生物催化介质价格昂贵、使用量大以及回收困难而导致使用成本高的问题一直是其应用于生物催化领域亟待解决的难题。
游离的微生物细胞在生物转化过程中存在着细胞重复利用率低、需菌量大、倒罐易染菌、对培养环境敏感等缺点。固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,以提高微生物细胞的浓度,使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。固定化细胞技术具有微生物密度高、反应速度快、耐毒害能力强、微生物流失少、产物分离容易、处理设备小型化等优点。
磁性纳米粒子是很好的生物材料,在有机相合成的磁性纳米粒子表面常被表面活性剂包覆,为提高磁性纳米粒子水溶性和生物相容性,其表面需要进一步的功能化,以便进一步偶联生物活性基团,适当的表面修饰或表面功能化可以改善磁性纳米粒子与其他材料的相容性,以赋予其特殊的功能。
纳米四氧化三铁(Fe3O4)具有超顺磁性,在磁场作用下能定向移动,通过给Fe3O4纳米粒子表面包覆不同的活性物质,制备出具有生物相容性的表面功能化的磁性复合材料,在许多领域得到了广泛的研究。壳聚糖(CS)是甲壳素脱乙酰化反应生成的一种线性聚合物,具有无毒副作用、良好的生物相容性及生物可降解性,其分子链上大量的氨基和羟基可以通过化学修饰而增添新的功能,接连上具有生物活性的物质在生物医学领域具有较好的研究前景。可将Fe3O4纳米粒子表面包覆CS进行磁性纳米粒子表面功能化,利用壳聚糖的生物性能和Fe3O4纳米粒子的靶向性,形成Fe3O4/CS纳米复合材料,不仅具有磁响应功能,还具有生物可降解性和与生物活性物质反应的特殊功能基团。许多研究已验证了Fe3O4/CS纳米复合材料具有优秀的生物相容性,应用于生物固定化技术可提高酶的热稳定性、保持酶活力,并能够更加有利于酶或细胞快速在线分离与连续化操作。
在上述前期工作的基础上,若将Fe3O4/CS和离子液体应用到细胞固定化技术中,不仅能进一步促进细胞的催化活性,还能大大减少了离子液体的使用量,并且有利于离子液体的循环使用,对于离子液体使用成本高、使用量大和难于回收利用的问题便迎刃而解。
发明内容
本发明提供了一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法及其应用,制得的固定化细胞因具有磁性而为其在分离和连续发酵提供了便利,磁性材料上负载的离子液体大大提升了固定化细胞的催化活性。
具体技术方案如下:
一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法,包括:
(1)将海藻酸钠(简称SA)、Fe3O4/CS磁性材料(简称Fe3O4/CS)和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(简称[BMIM]PF6)混合,得到混合溶液;
(2)将所述混合溶液与细胞悬液进行混合,得到混悬液;
(3)以CaCl2为交联剂,将所述混悬液进行固定化处理,得到磁性负载离子液体微球固定化细胞。
本发明利用滴加海藻酸钠(SA)到氯化钙溶液中的方法,由Ca2+向SA液滴内扩散形成实心的凝胶微球,[BMIM]PF6被包埋在凝胶微球中,菌体细胞和Fe3O4/CS则被固载在凝胶微球内部,三者均匀分散,相互接触。本发明所述的磁性微球是指包埋Fe3O4/CS磁性材料但不负载[BMIM]PF6的微球,也称为磁性不负载[BMIM]PF6微球。
不加入[BMIM]PF6的磁性微球表面凹凸不平整,当微球结构中加入[BMIM]PF6后,微球整体表面部分凸起增多,随着[BMIM]PF6加入的越多,这种凸起结构也随之增加,[BMIM]PF6在固定化微球表面形成大量孔隙,提高了微球的传质性能,更有利于底物的传入和产物排出,并且[BMIM]PF6的催化作用提高了固定化细胞的生物活性。
Fe3O4/CS磁性材料采用共沉淀法进行制备,具体制备方法如下:将壳聚糖缓冲液与含Fe2+和Fe3+的盐溶液混合后,在氮气保护下,慢慢滴入NaOH溶液中,滴完后55℃反应1小时,磁性分离、清洗、烘干,得到Fe3O4/CS磁性材料。
作为优选,所述混合溶液中,海藻酸钠、Fe3O4/CS磁性材料和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的重量比为1:0.3~1:2~10;更优选,重量比为1:0.6:6;在该重量比下,固定化细胞的机械强度和催化活性表现为最佳。
作为优选,海藻酸钠浓度为10~30g.L-1,Fe3O4/CS浓度为3~20g.L-1,[BMIM]PF6的浓度为41~205g.L-1;进一步优选,SA的浓度为20g.L-1,Fe3O4/CS浓度为13g.L-1,[BMIM]PF6的浓度为123g.L-1。
本发明中,如未作特殊说明,所述[BMIM]PF6的纯度均大于99%。
作为优选,所述的细胞为产紫青霉。更优选,所述的细胞为产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum Li-3)。
产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)的保藏号为CGMCC No.446。
作为优选,所述Penicillium purpurogenum Li-3的细胞悬液的浓度为4~6g.L-1;并以2.5~3.5mL菌悬液/100mL混悬液的比例,将菌悬液与混合溶液混合。采用对数生长期的Penicillium purpurogenum Li-3制备菌悬液,以保证细胞的活力。
步骤(3)中,所述混悬液逐滴滴入氯化钙溶液中,实现对混悬液的固定化处理。
作为优选,所述混悬液液滴的体积为45~50μL/滴。若混悬液液滴过大,则液滴在重力的作用下,容易造成拖尾现象,使得微球形状不规则、体积过大,在振摇状态下培养时会受到更大剪切力,导致微球破碎或部分开裂,造成菌体泄露;若混悬液液滴过小,则微球中菌体含量过少,降低催化效率。
本发明还提供了所述磁性负载离子液体微球固定化细胞在生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸中的应用。
所述应用包括:将所述磁性负载离子液体微球固定化细胞置于含有甘草酸的基础产酶培养基中培养。
作为优选,所述磁性负载离子液体微球固定化细胞的添加量为1~4g/25mL基础产酶培养基。适宜的添加量不仅可以促进反应进行,同时还可有效地缩短催化反应周期,更有利于酶的表达。低于该添加量范围,则GAMG的产率太低;高于该范围,则GAMG的产率开始下降。
进一步优选,所述磁性负载离子液体微球固定化细胞的添加量为1.5~3.5g/25mL基础产酶培养基。最优选地,固定化细胞的添加量为2g/25mL基础产酶培养基。在添加量为1.5~2.5g/25mL基础产酶培养基时,GAMG产率的变化已不明显,在添加量为2g时GAMG产率达到最大,此时磁响应时间适中,并不会影响微球的磁性分离。
作为优选,所述培养为:在32℃、150r/min下培养48~192h;更优选为在32℃、150r/min下培养120~192h。在该培养条件下,GAMG产率度过对数增长期,进入稳定期,并在培养192h时达到最大。
本发明的磁性负载离子液体固定化细胞在有效回收并重复利用9次后,相对活性还可达到59.2%,同时其球形度仍保持良好,仍可继续使用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明在固定化细胞制备过程中添加表明功能化的磁性纳米材料Fe3O4/CS和对产紫青霉细胞具有催化效果的离子液体[BMIM]PF6,使磁性微球表面凸起增多,提高了固定化细胞的传质性能,同时进一步提高了固定化细胞的催化活性。
(2)本发明采用功能化磁性纳米材料Fe3O4/CS,一方面壳聚糖分子链上大量的伯氨基与海藻酸钠分子上的羧基发生反应,使得磁性材料牢固的被包埋,不会使磁性材料泄漏;另一方面Fe3O4/CS具有良好的生物相容性,不影响菌体的生长代谢,既可以作为生物活性物质的载体,又具有生物可降解性,并且Fe3O4/CS具有磁响应功能,有利于实现固定化酶或细胞快速在线分离和连续发酵。
(3)本发明方法的制备过程简单、条件温和,固定化细胞重复利用性良好,由此解决离子液体在生物催化中使用成本高、使用量大和难于回收利用的问题,为离子液体在全细胞和生物酶催化领域的应用提供了新的方法与思路。
附图说明
图1为实施例1中壳聚糖包裹四氧化三铁的纳米粒子Fe3O4/CS及磁性负载离子液体固定化Penicillium purpurogenum Li-3细胞的外观图;
其中,a为Fe3O4/CS均匀分散在水溶液中的图片;b为Fe3O4/CS全部被磁铁吸引在瓶底部的图片;c为游标卡尺测量磁性负载离子液体微球直径的图片;d为磁性负载离子液体微球在磁场作用下的贴靠瓶壁一侧的图片。
图2为实施例2中Fe3O4及Fe3O4/CS的扫描电镜SEM图;
其中,a为Fe3O4;b为Fe3O4/CS。
图3为实施例2中Fe3O4及Fe3O4/CS透射电镜TEM图;
其中,a为Fe3O4;b为Fe3O4/CS。
图4为实施例2中磁性负载不同浓度[BMIM]PF6的微球表面的扫描电镜SEM图;
其中,a为磁性微球;b为磁性负载41g·L-1[BMIM]PF6微球;c为磁性负载82g·L-1[BMIM]PF6微球;d为磁性负载123g·L-1[BMIM]PF6微球;e为磁性负载164g·L-1[BMIM]PF6微球;f为磁性负载205g·L-1[BMIM]PF6微球。
图5为实施例3中壳聚糖、Fe3O4、[BMIM]PF6、Fe3O4/CS及磁性负载离子液体微球的红外表征图;
其中,a为壳聚糖;b为Fe3O4/CS;c为Fe3O4;d为磁性负载[BMIM]PF6微球;e为[BMIM]PF6。
图6为实施例4中Fe3O4、Fe3O4/CS及磁性微球的XRD表征图;
其中,a为Fe3O4;b为Fe3O4/CS;c为磁性微球。
图7为实施例5中Fe3O4、Fe3O4/CS及磁性微球的VSM表征图;
其中,a为Fe3O4;b为Fe3O4/CS;c为磁性微球。
图8为实施例6中磁性负载不同浓度[BMIM]PF6固定化细胞对GAMG产率的影响;
图9为实施例7中不同Fe3O4/CS加入量磁性负载[BMIM]PF6固定化细胞对GAMG产率的影响;
图10为实施例7中不同Fe3O4/CS加入量对磁性负载[BMIM]PF6固定化细胞对磁响应时间的考察;
图11为实施例8中磁性未负载ILS、负载ILS固定化细胞与磁性负载ILS固定化细胞生物催化的时间动力学考察。
其中,磁性未负载ILS固定化细胞是指仅采用Fe3O4/CS却未负载[BMIM]PF6的固定化细胞;负载ILS固定化细胞是指负载123g.L-1[BMIM]PF6的固定化细胞;磁性负载ILS固定化细胞是指采用Fe3O4/CS且负载[BMIM]PF6的固定化细胞。
图12为实施例9中磁性负载123g.L-1[BMIM]PF6固定化细胞的加入量对GAMG产率的影响。
图13为实施例10中甘草酸在磁性未负载[BMIM]PF6微球、磁性负载[BMIM]PF6微球和负载[BMIM]PF6微球中的传质曲线;
其中,a为磁性未负载[BMIM]PF6微球;b为磁性负载[BMIM]PF6微球;c为负载[BMIM]PF6微球。
图14为磁性负载[BMIM]PF6固定化细胞的重复利用次数与固定化细胞相对活性的关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述,以下列举的仅是本发明的具体实施例,但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法,具体步骤如下:
(1)采用共沉淀法制备壳聚糖(CS)包裹四氧化三铁(Fe3O4)的纳米粒子Fe3O4/CS:
配制乙酸钠溶液于烧杯中,加入壳聚糖、乙酸,超声溶解,得到溶液I;另取烧杯乙酸钠溶液,加入Fe2+和Fe3+摩尔比为1:2的FeSO4和FeCl3,超声溶解,得到溶液II;将溶液I和溶液II混合后,得到混合溶液III,将混合溶液III转移至恒压滴液漏斗中,再将滴液漏斗放在含有NaOH溶液的三颈烧瓶上,在氮气保护下,混合液慢慢滴入碱液,滴完后,55℃反应1小时,用大量的蒸馏水洗至中性,过滤,在真空干燥箱60℃干燥约三天,研磨成品,得到Fe3O4/CS纳米粒子。
(2)配制20g.L-1的SA溶液,灭菌后,加入13g.L-1Fe3O4/CS纳米粒子。
(3)向步骤(2)制得的溶液中加入纯度大于99%的[BMIM]PF6至[BMIM]PF6的浓度为123g·L-1,并将其磁力搅拌2h,混合均匀,获得混合溶液。
(4)移取100mL基础种子培养基加入锥形瓶中,灭菌,接种Penicilliumpurpurogenum Li-3,于32℃、150r/min下培养96h后,离心(20℃,8000r/min,10min),弃上清;取菌体,用0.9%生理盐水洗涤、离心,称菌体湿重,用0.9%生理盐水重悬,制成5g·L- 1Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液,4℃保存,备用。
(5)取1mL步骤(4)配制的Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液,在磁力搅拌下加入步骤(3)配制的含123g·L-1[BMIM]PF6的混合溶液,充分混匀,获得混悬液。
(6)配制20g·L-1氯化钙溶液,灭菌,待用。
(7)将步骤(5)搅拌好的混悬液经蠕动泵(蠕动泵所用硅胶管内径为0.8mm,滴速为250r/min(即蠕动泵电机转速),逐滴滴入20g·L-1的氯化钙溶液中,即得磁性负载离子液体固定化细胞,取出,用无菌生理盐水冲洗3次,然后置于生理盐水中4℃保存。
上述步骤中所用试剂均为分析纯试剂,实验用水为二次蒸馏水;步骤(4)中所用基础种子培养基的配方为:葡萄糖2.8g·L-1、NaNO3 3.0g·L-1、K2HPO4 0.8g·L-1、MgSO4·7H2O0.5g·L-1、KCl 0.5g·L-1、FeSO4 0.01g·L-1。
其中,磁性负载[BMIM]PF6微球的制备方法为:在上述磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法中,除了不加入菌体细胞,其它步骤相同制备磁性负载[BMIM]PF6微球。
如图1可见,a、b是Fe3O4/CS分散在水溶液中,呈黑色且均匀分散,在外加一块磁铁后,静置2min,试剂瓶中的Fe3O4/CS全部被磁铁吸引在瓶底部,由此断定样品中含有磁性很强的磁性物质;c为游标卡尺测量磁性负载离子液体微球直径D=3.84mm;d为磁性负载离子液体微球的磁性分离,在磁场作用下,微球能够附着在烧杯壁上,为此证实在线分离的可行性。
对比例1
一种磁性固定化细胞的制备方法,具体步骤如下:
(1)采用共沉淀法制备壳聚糖(CS)包裹四氧化三铁(Fe3O4)的纳米粒子Fe3O4/CS:
配制乙酸钠溶液于烧杯中,加入壳聚糖、乙酸,超声溶解,得到溶液I;另取烧杯乙酸钠溶液,加入Fe2+和Fe3+摩尔比为1:2的FeSO4和FeCl3,超声溶解,得到溶液II;将溶液I和溶液II混合后,得到混合溶液III,将混合溶液III转移至恒压滴液漏斗中,再将滴液漏斗放在含有NaOH溶液的三颈烧瓶上,在氮气保护下,混合液慢慢滴入碱液,滴完后,55℃反应1小时,用大量的蒸馏水洗至中性,过滤,在真空干燥箱60℃干燥约三天,研磨成品,得到Fe3O4/CS纳米粒子。
(2)配制20g.L-1的SA溶液,灭菌后,加入13g.L-1Fe3O4/CS纳米粒子,获得混合溶液。
(3)移取100mL基础种子培养基加入锥形瓶中,灭菌,接种Penicilliumpurpurogenum Li-3,于32℃、150r/min下培养96h后,离心(20℃,8000r/min,10min),弃上清;取菌体,用0.9%生理盐水洗涤、离心,称菌体湿重,用0.9%生理盐水重悬,制成5g·L- 1Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液,4℃保存,备用。
(4)取1mL步骤(4)配制的Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液,在磁力搅拌下加入步骤(2)配制的混合溶液,充分混匀,获得混悬液。
(5)配制20g·L-1氯化钙溶液,灭菌,待用。
(6)将步骤(4)搅拌好的混悬液经蠕动泵(蠕动泵所用硅胶管内径为0.8mm,滴速为250r/min(即蠕动泵电机转速),逐滴滴入20g·L-1的氯化钙溶液中,即得磁性固定化细胞,取出,用无菌生理盐水冲洗3次,然后置于生理盐水中4℃保存。
上述步骤中所用试剂均为分析纯试剂,实验用水为二次蒸馏水;步骤(3)中所用基础种子培养基的配方为:葡萄糖2.8g·L-1、NaNO3 3.0g·L-1、K2HPO4 0.8g·L-1、MgSO4·7H2O0.5g·L-1、KCl 0.5g·L-1、FeSO4 0.01g·L-1。
对比例2
一种负载离子液体的固定化细胞的制备方法,具体如下:
(1)配制20g.L-1的SA溶液,灭菌。
(2)向步骤(1)制得的溶液中加入纯度大于99%的[BMIM]PF6至[BMIM]PF6的浓度为123g·L-1,并将其磁力搅拌2h,混合均匀,获得混合溶液。
(3)移取100mL基础种子培养基加入锥形瓶中,灭菌,接种Penicilliumpurpurogenum Li-3,于32℃、150r/min下培养96h后,离心(20℃,8000r/min,10min),弃上清;取菌体,用0.9%生理盐水洗涤、离心,称菌体湿重,用0.9%生理盐水重悬,制成5g·L- 1Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液,4℃保存,备用。
(4)取1mL步骤(3)配制的Penicillium purpurogenum Li-3菌悬液,在磁力搅拌下加入步骤(2)配制的含123g·L-1[BMIM]PF6的混合溶液,充分混匀,获得混悬液。
(5)配制20g·L-1氯化钙溶液,灭菌,待用。
(6)将步骤(4)搅拌好的混悬液经蠕动泵(蠕动泵所用硅胶管内径为0.8mm,滴速为250r/min(即蠕动泵电机转速),逐滴滴入20g·L-1的氯化钙溶液中,即得负载离子液体固定化细胞,取出,用无菌生理盐水冲洗3次,然后置于生理盐水中4℃保存。
上述步骤中所用试剂均为分析纯试剂,实验用水为二次蒸馏水;步骤(3)中所用基础种子培养基的配方为:葡萄糖2.8g·L-1、NaNO3 3.0g·L-1、K2HPO4 0.8g·L-1、MgSO4·7H2O0.5g·L-1、KCl 0.5g·L-1、FeSO4 0.01g·L-1。
实施例2
Fe3O4、Fe3O4/CS及磁性负载[BMIM]PF6微球(未固定菌体细胞的微球,制备方法见实施例1)电镜分析:采用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)分析观察Fe3O4及Fe3O4/CS形貌。
由图2a可以看出,Fe3O4纳米粒子均匀分散,处于离散无序状态的球形小颗粒,颗粒尺寸均匀,平均粒径约为20nm左右,分散性较好;由图2b可以看出,制备的Fe3O4/CS纳米粒子,分散性稍差,颗粒尺寸约为30nm,造成Fe3O4/CS纳米粒子分散性稍差的原因可能是纳米粒子比表面积大,表面能高,纳米粒子之间的静磁相互作用造成团聚。
由图3a、b也可看到部分团聚,在包裹壳聚糖之后,Fe3O4/CS纳米粒子尺寸变大,由此说明成功制备出Fe3O4/CS纳米粒子。
从图4中的SEM照片可以观察到磁性负载[BMIM]PF6微球的微观形貌,磁性微球(如图4a)的表面凹凸不平整,当微球结构中加入[BMIM]PF6后,微球整体表面部分凸起增多,随着[BMIM]PF6加入的越多,这种凸起结构也随之增加,这是由于加入[BMIM]PF6,离子液体与微球载体接触后,填充在微球的孔隙中,使得磁性负载ILs微球表面整体平整,略有凸起。
实施例3
红外(FT-IR)分析:采用红外光谱分析仪分别对壳聚糖、Fe3O4、Fe3O4/CS、[BMIM]PF6、磁性负载[BMIM]PF6微球(制备方法见实施例1)进行红外表征,结果如图5所示。
红外图谱a,在3402cm-1宽吸收峰是羟基-OH振动吸收峰,2925cm-1是-CH2-中-C-H的伸缩振动吸收峰;1625cm-1是-NH2弯曲振动吸收峰;1082cm-1是C-O-C的伸缩振动峰。
红外图谱c,Fe3O4的特征峰是585cm-1;红外图谱b表明在经过用共沉淀法制备出的Fe3O4/CS在585cm-1也有吸收峰,并且和CS红外图谱a对比,所制备的样品具有壳聚糖的特征吸收峰,由上面分析可见,Fe3O4颗粒表面成功包覆了壳聚糖分子。
红外图谱e,其中752cm-1是丁基的C-H吸收峰,838cm-1是PF6的吸收,1386cm-1是甲基的变形振动吸收峰,1466和1575cm-1是咪唑环骨架振动吸收峰,2878和2966cm-1是甲基C-H的伸缩振动吸收峰,3124和3171cm-1是咪唑环上C-H伸缩振动吸收峰。
从红外图谱d分析来看,壳聚糖的特征峰不明显,所制备的微球具有[BMIM]PF6结构完全吻合的特征峰,由此可确定成功制备出磁性负载[BMIM]PF6微球。
实施例4
X-粉末衍射(XRD)分析:分别对Fe3O4、Fe3O4/CS、磁性微球(制备方法见实施例1)进行XRD表征,结果如图6所示。
由a可见,其主要衍射峰分布在2θ=30.0°,35.5°,45.0°,55.0°,57.0°,63.6°,分别对应反尖晶石型面心立方相Fe3O4的(220),(311),(400),(422),(511),(440)晶面位置,将a与标准衍射粉末卡片PDF(卡号:74-0748)比较,没有其他杂质晶体峰的出现,表明样品为单一相的反尖晶石型Fe3O4。
对比a和b可见,b中特征峰的位置与Fe3O4颗粒基本一致,说明Fe3O4纳米粒子被壳聚糖包覆后,其晶型结构并未改变;c中Fe3O4的特征峰强度明显减弱,这是由于海藻酸钙是非晶物质,从而导致磁性微球的晶体结构减弱。
实施例5
采用样品振动磁强计VSM测量了Fe3O4、Fe3O4/CS、磁性微球(制备方法见实施例1)的室温(300K)磁滞回线。
由图7可见,这3种物质都不存在明显的滞后环,均为S型磁化曲线,几乎无磁滞现象,均表现出良好的超顺磁性。Fe3O4、Fe3O4/CS、磁性微球的饱和磁化强度分别为51.010,37.715,9.791emu/g,Fe3O4/CS表现为磁强度减弱,是由于在Fe3O4表面包覆壳聚糖,对其磁性造成一定的影响,而磁性微球是将Fe3O4/CS纳米粒子包埋在海藻酸钙网格中,其磁性更加减弱,但Fe3O4/CS和磁性微球仍具有良好的磁性能;从图1c和d可明显看出,在外加磁场下Fe3O4/CS和磁性微球均能够实现有效分离。
实施例6
无菌条件下,分别将采用41、82、123、164、205g·L-1不同[BMIM]PF6浓度制备获得的磁性负载离子液体微球固定化细胞(制备方法见实施例1)置于装有基础产酶培养基的锥形瓶中,于32℃、150r/min的恒温摇床振摇,隔一定时间取样1mL,采用高效液相色谱法检测,考察负载不同浓度[BMIM]PF6对固定化细胞生物催化能力的影响(图8)。
从图8可以看出,随着固定化细胞负载[BMIM]PF6浓度的增加,GAMG的产率不断的增加,当[BMIM]PF6的浓度为123g·L-1时,GAMG的产率最大;当[BMIM]PF6的浓度大于123g·L-1时,GAMG的产率则呈下降趋势,这是因为[BMIM]PF6本身对酶的柔性构象状态产生一定影响,从而使酶与GL上的糖苷键较易于形成酶底物中间络合物,更加利于GAMG形成;其次,随[BMIM]PF6浓度的增加,微球的孔隙增多,而较多的孔隙利于底物与产物的进入与传出,同时也利于细胞的生长,增加了GAMG的产率;而当[BMIM]PF6浓度过大时,微球内的粘度也会增大,多余的[BMIM]PF6会堵塞表面的孔隙,导致底物和产物及营养物质的传质受到严重阻碍,最终影响细胞的生长与生物催化反应的进行。
综上所述,本发明固定化细胞中负载[BMIM]PF6的较适浓度为41~205g·L-1,最佳浓度为123g·L-1。
实施例7
无菌条件下,分别将采用3.3、6.7、10.0、13.3、16.7g·L-1不同Fe3O4/CS加入量制备获得的磁性负载[BMIM]PF6微球固定化细胞(制备方法见实施例1)置于装有基础产酶培养基的锥形瓶中,于32℃、150r/min的恒温摇床振摇,隔一定时间取样1mL,采用高效液相色谱法检测。将一粒磁性负载[BMIM]PF6微球固定化细胞置于装满去离子水的10mL离心管中,在固定磁场作用下移动相同的距离,测量所需时间,以此表征固定化细胞磁性分离的效果。考察不同Fe3O4/CS加入量对固定化细胞生物催化能力及磁响应时间的影响(图9、图10)。
由图9可知随着Fe3O4/CS加入量的增加,GAMG的产率先升高再降低,在Fe3O4/CS的加入比例为13.3g·L-1时GAMG产率达到最大值;这是因为Fe3O4/CS有良好的生物相容性,当加入量较小时对菌体的生物活性影响不大,随着Fe3O4/CS的加入量逐渐增加,这时凝胶珠的直径变大,较大的空间有利于菌体细胞的生长,因此GAMG的产率增加;当加入量大于13.3g·L-1时,Fe3O4/CS对细胞的影响越来越明显,导致菌体细胞的活性降低,同时固定化细胞的机械强度变大,也会阻碍底物和产物的进入和排出,所以Fe3O4/CS加入量继续增加,GAMG产率降低。图10表明,随着Fe3O4/CS加入量的增加,磁性负载[BMIM]PF6固定化细胞磁响应时间越来越小,当加入量为10~16.7g·L-1时,磁响应时间变化幅度并不大,综合考虑各因素,本发明中Fe3O4/CS较适浓度为3.3~16.7g·L-1,最优加入量为13.3g·L-1。
实施例8
无菌条件下,取2g没有负载离子液体的磁性固定化细胞(对比例1)、2g负载123g·L-1[BMIM]PF6的磁性固定化细胞(实施例1)以及2g仅负载离子液体的固定化细胞(对比例2)分别置于25mL基础产酶培养基中,于32℃、150rpm的恒温摇床中进行催化反应,每隔一定时间取样,采用高效液相色谱法检测,考察三种磁性固定化细胞催化GL生成GAMG的时间动力学(图11)。
从图11可以看出,三种固定化细胞生物催化的时间动力学均呈现“S”型规律,即GAMG的产率都是先逐渐增加,当达到一定时间后GAMG的产率趋于稳定。原因是随着GAMG的不断生成,产物抑制作用逐渐增强。
此外,通过比较不难看出,在反应初期三者都有一段延滞期,这是由于随着微球的介入,营养物质需要跨过海藻酸钙凝胶传递后才能进入细胞内,细胞需要一定时间来适应新环境,此时微球内的环境对细胞的生长有很大的影响,[BMIM]PF6和Fe3O4/CS作为添加物对细胞需要一个适应的过程,磁性负载[BMIM]PF6固定化细胞更加需要时间去适应这个新环境,适应时间自然而然变长,所以在细胞反应初期磁性负载[BMIM]PF6固定化细胞体系GAMG产率并不高;生长曲线72h-144h,这段时间GAMG的产率呈现快速增长,是由于细胞适应微球内的环境,生理状态稳定,生长代谢旺盛,所以GAMG产率快速增加。
当培养312h后,在含有离子液体体系中,离子液体具有改善细胞膜的通透性加速传质作用,促进营养物质进入细胞内,提高营养物质利用率,同时离子液体也能促进细胞合成更多所需的酶,与酶的活性位点结合,提高酶的催化活性,因此随后含离子液体细胞体系中GAMG产率高于不含离子液体细胞体系,与没有负载离子液体的磁性固定化细胞体系相比,磁性负载[BMIM]PF6固定化细胞的体系中GAMG的产率增加了8%。
实施例9
分别称取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5g的磁性负载[BMIM]PF6固定化细胞([BMIM]PF6负载浓度为123g·L-1),加入盛有25mL基础产酶培养基的锥形瓶中,再置于32℃、150r/min的恒温摇床中,培养72h后取样,采用高效液相色谱法检测,考察固定化细胞的加入量对GAMG产率的影响(图12)。
从图12可以看出,随着固定化细胞的加入量增加,GAMG的产率越来越大,这是由于固定化细胞加入量越多,则Penicillium purpurogenum Li-3表达酶的绝对总量就越多,生物催化效率就越高,GAMG的产率也就越高。当固定化细胞加入量为2.0g时,GAMG的产率达到最大;而当固定化细胞的加入量继续增加后,GAMG的产率则减小。这是因为,若固定化细胞的加入量过多,则溶氧及养分利用就越差,而且菌体所产生的代谢物也越多,进而导致微球内的菌体越易衰亡,因此减少了酶的表达。
由此,适宜的固定化细胞量不仅可以促进反应进行,同时还可有效地缩短催化反应周期,更有利于酶的表达。本发明中,每25mL基础产酶培养基中固定化细胞的最适加入量为2.0g。
实施例10
分别制备不含菌体的磁性未负载[BMIM]PF6微球、磁性负载[BMIM]PF6微球和负载[BMIM]PF6微球,然后进行GL的传质实验,绘制传质曲线图(图13a、b、c),并计算传质系数k(表1),考察磁性负载离子液体微球对GL的传质性能。
由图13a、b、c可知,传质实验初期,三种微球体系中GL浓度均下降得很快,这是由于最初时微球内外的GL浓度相差很大,则其对应的传质推动力也很大,因而GL的传质速率很快;随着时间的推移,微球内GL含量不断增加,则微球内外GL的浓度差逐渐变小,其对应的传质推动力也会越来越小,使GL扩散速率也随之下降,直至微球内外的GL浓度达到平衡,传质也就达到了平衡。
并且,对图13a和图13b进行比较,在相同时间下,磁性负载[BMIM]PF6微球外的GL浓度比磁性未负载[BMIM]PF6微球要低,表明磁性负载[BMIM]PF6微球的传质速率更快。
表1底物GL在微球中的扩散系数
从表1传质系数计算来看,k(负载[BMIM]PF6微球)>k(磁性负载[BMIM]PF6微球)>k(磁性未负载[BMIM]PF6微球),说明Fe3O4/CS加入阻碍了GL的传质扩散,Fe3O4/CS作为固体纳米颗粒,必然会减小固定化细胞的传质。GL在磁性负载离子液体微球内的传质略优于磁性未负载离子液体微球,这与负载ILs的微球表面上孔隙增多有关,与图13a、图13b的结果相一致,也对实施例6的结果进行了验证。
实施例11
有效回收并反复利用本发明的固定化细胞是降低成本的关键。
称取磁性负载123g.L-1[BMIM]PF6的固定化细胞2g,置于盛有25mL基础产酶培养基的锥形瓶中,于32℃、150r/min的恒温摇床中,进行重复批次的催化反应,每次催化反应72h;每批次催化结束前后采用高效液相色谱法取样检测反应液中GAMG浓度,计算固定化细胞相对活性。对磁性负载离子液体固定化Penicillium purpurogenum Li-3细胞的重复利用性进行考察(图14)。
由图14可知,随着固定化细胞重复利用次数的增加,固定化细胞相对活性逐渐降低,但其降低的幅度并不太大,这是因为菌体细胞被固定在微球中,微球对菌体细胞具有保护作用,当把初次培养至稳定后期的固定化细胞转接入新鲜的培养基后,微球内的Penicillium purpurogenum Li-3细胞会再次生长与产酶,进而产生代谢产物,同时前期的实验表明离子液体[BMIM]PF6对Penicillium purpurogenum Li-3细胞的生长也具有较明显的促进作用。固定化细胞经过连续使用9次后,固定化细胞相对活性还可达到59.2%,同时发现其球形度也仍保持良好,仍可继续使用。重复使用时,在外加磁场作用下,只需将原发酵液排出,添加新鲜的发酵液即可,不必单独分离菌体或[BMIM]PF6,便于对菌体细胞、[BMIM]PF6的收集和再利用。由此体现了该磁性负载离子液体微球在固定化微生物培养方面具有很大的发展潜力。
Claims (4)
1.一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法,其特征在于,包括:
(1)将海藻酸钠、Fe3O4/CS磁性材料和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐混合,得到混合溶液;
(2)将所述混合溶液与细胞悬液进行混合,得到混悬液;
(3)以CaCl2为交联剂,将所述混悬液进行固定化处理,得到磁性负载离子液体微球固定化细胞,
步骤(1)的混合溶液中,所述海藻酸钠、Fe3O4/CS磁性材料和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的质量比为1 : 0.6 : 6,
步骤(1)的混合溶液中,所述海藻酸钠的浓度为20g/L,所述Fe3O4/CS磁性材料的浓度为13 g/L,所述1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的浓度为123 g/L,
所述细胞为产紫青霉,
以100 mL的混悬液计,所述细胞悬液的体积为2.5~3.5 mL。
2.如权利要求1所述的制备方法制得的磁性负载离子液体微球固定化细胞。
3.如权利要求2所述的磁性负载离子液体微球固定化细胞在生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,将所述磁性负载离子液体微球固定化细胞置于含有甘草酸的基础产酶培养基中培养;以基础产酶培养基的体积为基准,所述磁性负载离子液体微球固定化细胞的添加量为1.5~3.5 g/25 mL;所述培养的条件为:在32℃、150r/min下培养48~192 h。
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