CN105838703B - 一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用 - Google Patents

一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用。本发明采用反相悬浮交联法，通过戊二醛交联，与壳聚糖分子聚合制备了磁性Fe3O4/CTS微球，并优化了磁性Fe3O4/CTS微球固定化失活Candida.u CICC1769细胞的工艺参数，从而利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素，不仅获得了吸附效果好、成本低、绿色环保的优点，也可实现失活酵母细胞与目标产品的高效快速分离，同时避免了活体微生物对产品和人体产生的诸多不利影响。

Description

一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉 素的方法及其应用
技术领域
本发明属于食品安全技术领域，具体而言，涉及一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用。
背景技术
PAT(patulin，PAT)，又名棒曲霉素，是一种半缩醛内酯，分子式为C7H6O4，化学名称为4-羟基-4-氢-呋喃-[3,2碳]-吡喃-2(6氢)酮。PAT具有急性毒性，包括对动物的肺、脑水肿、肝脏、脾脏、肾的损害和免疫系统的毒害作用；也具有慢性毒性，表现在对动物的细胞毒性，基因毒性和免疫毒性。对巯基有强亲和力，可与含巯基的蛋白和多肽反应，破坏DNA单链和双链，从而抑制DNA和RNA的合成，也可抑制多种酶活性，特别是一些生化指标中的酶，如碱性磷酸酶、二磷酸果糖酶和己糖激酶等。此外，PAT对成年哺乳动物和胚胎期动物的肾脏也有毒害作用。直接接触皮肤，可引起DNA损伤，从而造成细胞周期阻滞和内部介导细胞凋亡，积累大量具有皮肤毒性的聚胺产物。
PAT是水果中常见的真菌毒素，在霉烂的杏、李、桃、梨、香蕉、菠萝、青梅、蜜瓜、蕃茄、樱桃、辣椒、葡萄、柿子、黄瓜、胡萝卜、蕃茄酱、苹果汁、苹果酱、葡萄汁、苹果制品、谷物、糕点及豆科植物、陈的火腿、干香肠等食品中均有发现。目前，世界上已经有很多国家制定了水果及其制品中PAT的最高限量标准。1995年，联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会(JECFA)将PAT的每天容许摄入量定为0.4μg/kg bw。在欧洲，由欧洲卫生与消费者保护委员会发起的一项科学研究表明，PAT每日允许摄入量要远远低于JECFA设定的水平。我国规定在苹果和山楂制品中限量值为50μg/kg。目前，国内外对柑橘属中PAT的限量标准属于空白，亟待针对不同柑橘种类、不同食用方式等进行相关PAT限量标准的研究和完善。
为了降低食品中PAT的含量，人们尝试了很多控制方法，比较传统的方法主要可归纳为物理法和化学法。物理方法如加强原料的挑选和清洗、物理吸附和澄清等，但是这种方法耗时又费力，而且据报道PAT可以从腐烂部位渗透至未腐烂部位，在完整的水果部位仍然可以检测到PAT。另外，清洗会使PAT进入清洗用水中造成清洗容器、工具及环境的二次污染。再者，在果汁加工过程中使用活性炭进行吸附，但活性炭也严重影响了果汁的颜色并且大大降低了总酚含量。化学方法主要为使用添加剂或化学杀菌剂等手段降低PAT的含量，但是这些添加剂只能抑制PAT产生菌的生长和产毒，不能够直接去除食品中已经含有的PAT。
生物吸附是利用微生物细胞上的化学键与展青霉素结合，产生吸附或者降解的作用，该类方法吸附效果好、成本低、绿色环保、不会产生二次污染、不会破坏食品的营养价值。国内外关于微生物对展青霉素的去除作用的研究主要集中在具有展青霉素去除作用微生物的筛选和影响展青霉素去除效果因素的研究。现有研究表明，展青霉素在一些活体微生物发酵过程中几乎可以全部消失，然而活体微生物对果汁类产品和人体健康必然产生一定的影响，因此其使用受到了限制。另外，由于微生物细胞个体微小，在吸附展青霉素之后，从果汁类产品中进行完全分离和去除时存在较大困难，进一步限制了游离活体生物吸附法在果汁生产中的实际应用。
发明内容
鉴于现有技术存在的不足，本发明的目的在于通过大量试验筛选出显著吸附展青霉素的失活微生物，从而提供一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用，可实现失活酵母细胞快速分离与聚集，同时避免了活体微生物对产品和人体产生的诸多不利影响。
为了实现本发明的目的，发明人利用多年的科研实践经验，并结合大量试验研究，优选出灭活后能在柑橘汁中高效去除展青霉素的微生物菌株，从而实现了本发明的目的。具体地，本发明的技术方案概况如下：
一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)失活酵母菌粉的制备：将产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769接种液体培养基中培养，离心得到的菌泥用蒸馏水洗涤，以高压蒸汽灭菌法灭活，然后在-22～-18℃下的预冷8-16h，之后再将预冷的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，设置温度为-56～-52℃，真空度4-6mtorr，时间20-30h，冷冻干燥完成之后，得到失活酵母菌粉，备用；
(2)Fe3O4磁性纳米粒子的制备：按摩尔比(1.6-2.0)：1称取氯化铁和氯化亚铁，溶解在蒸馏水中，通入氮气除氧后备用；在装有搅拌器、冷凝管、N2保护的容器中，加入盐酸和PEG-2000，控制温度33-36℃，搅拌并N2保护条件下，快速加入氨水，滴加至pH为9-9.5，搅拌10-30min后于水浴恒温70℃熟化20-40min，降温至室温，用无水乙醇反复洗涤，分离，干燥，得到Fe3O4磁性纳米粒子，备用；
(3)磁性Fe3O4/CTS微球的制备：称取Fe3O4磁性纳米粒子于容器中，加入溶解有壳聚糖的体积分数为5％的乙酸溶液，Fe3O4磁性纳米粒子与壳聚糖的质量比为1：1，再加入液体石蜡、span-80，超声分散后，加入戊二醛溶液，机械搅拌反应2-4h，反应完成后用石油醚充分洗涤，并用丙酮洗涤脱水，于真空干燥箱中干燥，研磨成流动粉末，得到磁性Fe3O4/CTS微球，备用；
(4)固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞的磁性微球的制备：取磁性Fe3O4/CTS微球在超纯水中溶胀10-15h后，加入步骤(1)制备的失活酵母菌粉，调pH＝6，25-35℃下固定化反应1.5-3h，得到固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞；
(5)将固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞的磁性微球加入柑橘汁中，置于10-20℃下震荡或搅拌处理10～20h，处理结束后进行磁性分离，得去除展青霉素的柑橘汁。
优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(1)的技术参数为：预冷温度-20℃，预冷时间12h，冷冻温度-54℃，真空度5mtorr，干燥时间26h。
优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(3)中Fe3O4磁性纳米粒子与液体石蜡的质量比为1：(150-300)。
优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(3)中Fe3O4磁性纳米粒子与span-80的质量比为1：(2-4)。
优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(3)中Fe3O4磁性纳米粒子与戊二醛的质量比为1：(3-5)。
优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其中步骤(4)中磁性Fe3O4/CTS微球与失活酵母菌粉的质量比为(7-9)：1。
优选地，如上所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其其中步骤(5)中固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞的磁性微球用量与柑橘汁中展青霉素的质量比为1000～5000:1。
另外，由于上述磁性微球固定化失活酵母细胞利用其细胞上的化学键与展青霉素结合，产生吸附或/和交联的作用，从而可以高效去除柑橘汁中展青霉素，因此本发明还提供了上述失活酵母细胞菌株的新应用，即：失活酵母细胞在制备柑橘汁中展青霉素吸附剂中的应用，所述的失活酵母细胞选自失活的产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769。在本发明的所有试验例中，所述的柑橘汁为橙汁。
与现有技术相比，本发明采用反相悬浮交联法，通过戊二醛交联，与壳聚糖分子聚合制备了磁性Fe3O4/CTS微球，并优化了磁性Fe3O4/CTS微球固定化失活Candida.uCICC1769细胞的工艺参数，从而利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素，不仅获得了吸附效果好、成本低、绿色环保的优点，也可实现失活酵母细胞与目标产品的高效快速分离，同时避免了活体微生物对产品和人体产生的诸多不利影响。
附图说明
图1为利用HPLC检测展青霉素的标准曲线。
图2为8种菌株对酸化水中展青霉素去除能力的测定结果。
图3为优选的3种菌株对橙汁中展青霉素去除能力的测定结果。
图4为Candida.utilis CICC1769菌株的细胞形态显微图。
图5为Candida.utilis CICC1769的生长曲线图。
图6为固定化失活Candida.u CICC1769细胞的磁性Fe3O4/CTS微球的红外光谱。
具体实施方式
以下实施例进一步描述本发明方法的实施过程和有益效果，试验例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变也包含在本发明范围之内。需要说明的是，本发明所采用的菌株均购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)或中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
实施例1：8种菌株在模拟酸化水体系中对展青霉素去除能力的评价
1、主要试剂的配制
CM0005乳酸菌培养基：酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，KH2PO42.0g，吐温80 0.5mL，蒸馏水900mL，pH 7.0。121℃下，灭菌15min。C0006MRS培养基：酪蛋白胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.2±0.2。121℃下，灭菌15min。CM0181酵母菌培养基：酵母膏3.0g，麦芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。115℃下，灭菌25min。
CM0221胰胨-大豆胨琼脂：胰胨-大豆胨琼脂40.0g，蒸馏水1000mL。121℃下，灭菌15min。
CM0787强化梭菌琼脂培养基：牛肉膏10.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，葡萄糖5.0g，淀粉1.0g，氯化钠5.0g，乙酸钠3.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000mL，琼脂15g，121℃下，灭菌15min，pH 6.8±0.2(25℃)。
1mol/LNaOH溶液：称取4.0gNaOH固体，溶解后定容于100mL水中。
PAT标准溶液：准确称取标准品1mg置于10mL的容量瓶中，用乙酸乙酯稀释、定容，配置成100μg/mL的PAT乙酸乙酯标准储备液，置于-20℃保存。
取标准储备液(100μg/mL)1mL于100mL烧杯中用氮气吹干，用酸化水(乙酸酸化至pH 4.0)溶解洗涤转入到100mL锥形瓶用酸化水(pH 4.0)定容，即为1000μg/L的PAT酸化水试验溶液，置于-20℃保存，备用。
2、失活微生物菌体的制备
用接种环挑取一环菌悬液于200mL相应培养(于500mL三角瓶)中，酵母菌置于30℃，120r/,mim振荡培养24h。
根据标准生长曲线，使细胞数达到1×1010CFU/mL以上，。然后4000r/min在4℃下离心20min，离心得到的菌泥用蒸馏水洗涤2次。
将洗涤后的菌泥采用高压蒸汽灭菌法在121℃下灭菌20min，然后在-20℃下的预冷12h，再将经过预冷处理的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，其中设置温度为-54℃，真空度5mtorr，时间26h。冷冻干燥完成之后，即得到失活菌粉。
3、PAT的HPLC检测方法
按照AOAC标准方法测定，展青霉素的检测条件为：
1)检测条件：色谱柱Unitary ODS C18反相柱(250mm×4.6mm×5μm)；流动相为乙腈：水＝1:9，超声波脱气30min；检测器为紫外检测器，检测波长276nm；柱温30℃；流速为1.0mL/min，进样量为20μL；样品在检测前需经0.22μm微孔膜过滤后收集至HPLC 2mL进样瓶中，供HPLC测定。展青霉素的出峰时间为8.1-10.1min。
2)标准曲线绘制：用酸化水(冰醋酸调节pH值为4.0)配置不同浓度梯度(1000、500、250、125、100、50、25μg/L)的PAT标准品，在高效液相色谱上进行定量检测，建立峰面积与PAT浓度之间的一元线性回归方程。
测定的标准曲线如图1，线性回归方程为y＝0.0148x-2.3862，相关系数为0.9998。在25-1000μg/L PAT浓度范围内，与对应的峰面积之间具有良好的线性关系。
3)去除率的计算：展青霉素去除率＝(对照展青霉素HPLC峰面积-吸附后展青霉素HPLC峰面积)/对照展青霉素HPLC峰面积×100％
试验过程中通过HPLC测定样品的峰面积代入图1建立的回归方程，即可计算出样品中PAT的浓度。
4、8种菌株对展青霉素去除能力的测定
发明人结合自身经验选择可能具有较强的吸附展青霉素能力的菌株：两歧双歧杆菌6071、短乳杆菌20023、鼠李糖杆菌6224、屎肠球菌21605、嗜酸乳杆菌6081、产朊假丝酵母1769、异常汉逊酵母93161和酿酒酵母93047(见表1)。
表1试验菌株
以2％的接种量取-80℃甘油贮存液中的8种菌在各自对应培养基中活化培养20h，再以2％接种量传代两次后，离心10min(5000r/min，4℃)收集菌体，再用蒸馏水洗涤并离心3次，121℃，15min灭菌后冷冻干燥。
分别在10mL含有1000μg/L PAT的酸化水体系中加入0.1g灭活菌粉，随后将其置于20℃恒温摇床中处理18h，摇床转速为120r/min。对照为没有添加吸附剂的PAT溶液，每个处理设三个重复。处理结束后使用高速冷冻离心机(13000r/min，10min，4℃)对PAT溶液进行离心，过滤，上清液用于检测PAT的含量。
采用HPLC方法测定上清液中的展青霉素残留量用以评估吸附效率，通过计算，找出其中吸附能力最强的菌株。
5、结果与分析
在酸化水体系中，采用HPLC法检测8种菌对展青霉素混合溶液中展青霉素的吸附减少量来确定菌株对展青霉素的去除能力，从而筛选出高效去除展青霉素的菌株。展青霉素检测标准曲线如图1所示，筛选试验结果如图2所示。从图2中可以看出，在所选择的8种菌株中，对展青霉素去除能力较强的有Candida.utilis CICC1769，Saccharomycescerevisiae CCTCC AY 93161和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047，其中最强的为菌株Candida.utilis CICC1769，在18h内，此菌株对展青霉素的去除效率达到了60％以上；Candida utilis CICC1769的去除能力与Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93161和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047相比，对展青霉素的去除能力具有显著性差异(P＜0.05)，而对展青霉素去除能力最低的菌株Lactobacillus acidophilus CICC6081，此株菌对展青霉素几乎没有去除能力，仅为1.56％。发明人选择对展青霉素去除率最高的Candida.utilis CICC1769，Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93161和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047作后续研究。
实施例2：3种游离失活优选菌株对橙汁中展青霉素去除能力的评价
以2％的接种量取-80℃甘油贮存液中的3种优选菌在各自对应培养基中活化培养20h，再以2％接种量传代两次后，离心10min(5000r/min，4℃)收集菌体，再用蒸馏水洗涤并离心3次，121℃，15min灭菌后冷冻干燥。分别在10mL含有1000μg/L PAT的橙汁体系中加入0.2g灭活菌粉，随后将其置于10℃恒温摇床中处理10h，摇床转速为120r/min。处理结束后使用高速冷冻离心机(13000r/min，10min，4℃)对吸附体系溶液进行离心分离，采用HPLC方法测定上清液中的展青霉素残留量用以评估吸附效率。
在橙汁体系中，采用HPLC法检测Candida.utilis CICC1769，Saccharomycescerevisiae CCTCC AY 93161和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047 3种菌对橙汁中展青霉素的去除能力。通过展青霉素的吸附减少量来评价菌株对展青霉素的去除能力，从而筛选出高效去除橙汁展青霉素的菌株。在10℃下，吸附去除10h后，试验结果如图3所示。从图3中可以看出，在所选择的3种菌株中，对展青霉素去除能力较强的是Candida.utilis CICC1769，展青霉素去陈率可达93.4％，其次为Saccharomycescerevisiae CCTCC AY 93161和Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY 93047。发明人选择对展青霉素去除率最高的Candida.utilis CICC1769作后续研究。
实施例3：Candida.utilis CICC1769形态特征分析
将最优吸附菌株Candida.utilis CICC1769接入相应液体培养基中连续活化3代后，在固体培养基中划线分离，静置于30℃恒温培养箱中培养36-48h后，观察菌落形态，同时挑取单菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌落形态和个体形态，结果如图4所示：
Candida.utilis CICC1769菌落形态：于30℃培养48h，在CM0181酵母菌固体培养基上生长良好，菌落乳白色，平滑，有光泽，边缘整齐。菌落个体如图4所示，细胞形态为腊肠形，菌体单一、成对或聚集成链存在，宽度约4μm，长度约10μm，两端圆滑，革兰氏阳性，无鞭毛和芽孢。
实施例4：Candida.utilis CICC1769生长特性分析
取-80℃保存的最优吸附菌株Candida.utilis CICC1769，将其在相应固体培养基上划线培养。在30℃培养48h后，从生长良好单菌落上挑取单菌落接种到液体培养基中静置24h，培养温度30℃。然后按2％接种量将此活化后的试验菌株培养液接种到液体培养基中于温度为30℃的恒温培养箱中静置培养24h，每隔2h取5mL培养液使用紫外分光光度计测600nm下的OD值并进行平板计数，根据结果绘制菌株生长曲线，结果如图5所示。
从图5中可以看出：Candida.utilis CICC1769在CM0181培养基中生长速度快，在8h左右进入对数期，20h左右进入稳定期。肉眼观察菌株Candida.utilis CICC1769在试管中的生长情况，可以发现，约3h后，试管中的液体CM0181培养基开始变浑浊，5h后开始又沉底沉积在试管底部，约12h后开始形成大量乳白色絮状的沉淀，这些沉淀大部分蓄积在试管底部也有一部分附着在试管壁上，摇动试管未发现气泡产生。
实施例5：磁性Fe3O4/CTS微球固定化Candida.utilis CICC1769细胞的制备
(1)磁性Fe3O4纳米粒子的制备
将10.82g的氯化铁和4.38g的氯化亚铁(摩尔比1.8:1)溶解在100mL蒸馏水中，通入氮气除氧后备用。在装有搅拌器、冷凝管、N2保护的500mL三口烧瓶中，加入2mL、12mol/L的盐酸溶液和0.8g的分散剂PEG-2000，35℃，800r/min条件下，快速加入28％的氨水，滴加至pH为9-9.5，搅拌15min后于水浴恒温70℃熟化30min。降温至室温，用无水乙醇反复洗涤，磁铁分离，干燥。利用纳米粒度及Zeta电位分析仪、X–ray衍射仪和傅立叶变换红外光谱仪等对产物性能进行表征，成功制备了大小均匀、晶体结构完整的Fe3O4颗粒，粒径大约76nm。
(2)磁性Fe3O4/CTS微球的制备
称取2g Fe3O4磁性纳米颗粒于烧杯中，加入溶解有2g壳聚糖的体积分数为5％乙酸溶液，(磁性颗粒与壳聚糖的质量比为1:1)，液体石蜡400mL，5mL的span-80，超声分散20min后，加入30mL质量分数25％的戊二醛溶液，机械搅拌反应4h。反应完成后用石油醚充分洗涤，并用丙酮洗涤脱水，于真空干燥箱中干燥，研磨成流动粉末。利用纳米粒度及Zeta电位分析仪、X–ray衍射仪和傅立叶变换红外光谱仪等对产物性能进行表征，成功制备了大小均匀的磁性Fe3O4/CTS微球，微球粒径约为165nm。
(3)溶胀磁性微球
取一定量磁性Fe3O4/CTS微球在超纯水中溶胀12h左右。用去离子水洗涤三次，倒出洗液后用于下一步固定化灭活的Candida.utilis CICC1769细胞。
(4)固定化失活Candida.utilis CICC1769细胞磁性微球的制备
将0.1g灭活的Candida.utilis CICC1769细胞菌粉(实施例1步骤2制备)移入溶胀好的磁性Fe3O4/CTS的锥形瓶，调pH＝6，30℃下固定化反应3h，然后用200mL去离子水在磁场下洗涤几次，以除去未反应的失活细胞，搅拌后置于磁铁上使磁性粒子沉淀，收集湿态固定化失活细胞后烘干备用。
实施例6：固定化Candida.utilis CICC1769细胞的磁性Fe3O4/CTS微球的红外光谱分析
对磁性纳米材与固定化Candida.utilis CICC1769细胞的磁性纳米Fe3O4/CTS微球做红外光谱扫描，结果如图6所示。
图6中，曲线b中560.62cm-1处是Fe-O的特征吸收峰，曲线c中保留了曲线b中的Fe-O峰，说明磁性的Fe3O4内核仍然存在，因此具备磁性分离的条件。
图6中，曲线b中在3428.9cm-1处的吸收峰是由O-H伸缩振动引起的，相对应于曲线c中的3423.80cm-1处的吸收峰。曲线b中2918.98cm-1处的吸收峰，是由-CH3的伸缩振动引起，此峰对应于曲线c中2924.08cm-1处的吸收峰。曲线b中1042.49cm-1处的吸收峰是由仲醇的C-O伸缩振动引起的，对应于曲线c中1065.44cm-1。这几处峰都是壳聚糖微球上所带官能团的特征吸收峰，这就说明了磁性Fe3O4/CTS微球分子的高分子外壳的存在。
图6中，曲线b和曲线c中在1631.44cm-1处均有明显吸收，这是由C＝N基团的伸缩振动引起的，再次验证了戊二醛确实作为交联剂与壳聚糖发生了反应，且生成的Schiff碱很稳定。
图6中，曲线b在1715.58cm-1处有一悬挂醛基的吸收峰。这可能是由于戊二醛的过量、壳聚糖分子链的空间位阻和微球内扩散的限制，导致氨基无法和戊二醛分子的另一个醛基交联，从而使得壳聚糖表面悬挂醛基可以和细胞的氨基相互作用。
图6中，对比曲线b，所不同的是，在曲线c中悬挂醛基的吸收峰消失，而Schiff碱C＝N键伸展特征吸收峰有所增强。这可能是由于磁性Fe3O4/CTS微球的壳聚糖上的悬挂醛基和Candida.utilis CICC1769细胞上的氨基结合形成Schiff碱，从而使Candida.utilisCICC1769细胞牢固的固定在壳聚糖微球上。
实施例7：Fe3O4/CTS微球固定化失活Candida.utilis CICC1769细胞对橙汁中展青霉素去除能力的评价(1)
将柑橘样品去皮，称取一定量果肉样品放入榨汁机中，榨汁后于4℃下沉淀过夜，取上清液经过纱布过滤备用。分别在10mL含有1000μg/L PAT的橙汁体系中加入1.0g固定化失活Candida.utilis CICC1769细胞的磁性微球(实施例5制备)，随后将其置于10℃恒温摇床中处理15h，摇床转速为120r/min，离心10min(13000×g，10min，4℃)，取上清液用HPLC检测上清中PAT残存浓度。每个样品做三个平行，同时设未加入菌体的同浓度PAT溶液作为阴性对照，计算PAT吸附率达到98.5％。
实施例8：Fe3O4/CTS微球固定化失活Candida.utilis CICC1769细胞对橙汁中展青霉素去除能力的评价(2)
将柑橘样品去皮，称取一定量果肉样品放入榨汁机中，榨汁后于4℃下沉淀过夜，取上清液经过纱布过滤备用。分别在10mL含有1000μg/L PAT的橙汁体系中加入0.5g固定化失活Candida.utilis CICC1769细胞的磁性微球(实施例5制备)，随后将其置于20℃恒温摇床中处理10h，摇床转速为120r/min，离心10min(13000×g，10min，4℃)，取上清液用HPLC检测上清中PAT残存浓度。每个样品做三个平行，同时设未加入菌体的同浓度PAT溶液作为阴性对照，计算PAT吸附率达到96.2％。

Claims (6)

1.一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）失活酵母菌粉的制备：将产朊假丝酵母 (Candida utilis) CICC1769接种液体培养基中培养，离心得到的菌泥用蒸馏水洗涤，以高压蒸汽灭菌法灭活，然后在-22～-18℃下的预冷8-16h，之后再将预冷的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，设置温度为-56～-52℃，真空度4-6mtorr，时间20-30h，冷冻干燥完成之后，得到失活酵母菌粉，备用；
（2）Fe3O4磁性纳米粒子的制备：按摩尔比（1.6-2.0）：1称取氯化铁和氯化亚铁，溶解在蒸馏水中，通入氮气除氧后备用；在装有搅拌器、冷凝管、N2保护的容器中，加入盐酸和PEG-2000，控制温度33-36 ℃，搅拌并N2保护条件下，快速加入氨水，滴加至pH为9-9.5，搅拌10-30 min后于水浴恒温70 ℃熟化20-40 min，降温至室温，用无水乙醇反复洗涤，分离，干燥，得到Fe3O4磁性纳米粒子，备用；
（3）磁性Fe3O4/CTS微球的制备：称取Fe3O4磁性纳米粒子于容器中，加入溶解有壳聚糖的体积分数为5%的乙酸溶液，Fe3O4磁性纳米粒子与壳聚糖的质量比为1：1，再加入液体石蜡、span-80，超声分散后，加入戊二醛溶液，机械搅拌反应2-4h，反应完成后用石油醚充分洗涤，并用丙酮洗涤脱水，于真空干燥箱中干燥，研磨成流动粉末，得到磁性Fe3O4/CTS微球，备用；
（4）固定化失活产朊假丝酵母(Candida utilis) CICC1769细胞的磁性微球的制备：取磁性Fe3O4/CTS微球在超纯水中溶胀10-15h后，加入步骤（1）制备的失活酵母菌粉，调pH=6，25-35 ℃下固定化反应1.5-3h，得到固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞；
（5）将固定化失活产朊假丝酵母(Candida utilis) CICC1769细胞的磁性微球加入柑橘汁中，置于10-20℃下震荡或搅拌处理10～20h，处理结束后进行磁性分离，得去除展青霉素的柑橘汁；
步骤（5）中固定化失活产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769细胞的用量与柑橘汁中展青霉素的质量比为1000～5000:1。
2.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（1）的技术参数为：预冷温度-20℃，预冷时间12h，冷冻温度-54℃，真空度5mtorr，干燥时间26h。
3.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（3）中Fe3O4磁性纳米粒子与液体石蜡的质量比为1：（150-300）。
4.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（3）中Fe3O4磁性纳米粒子与span-80的质量比为1：（2-4）。
5.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（3）中Fe3O4磁性纳米粒子与戊二醛的质量比为1：（3-5）。
6.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（4）中磁性Fe3O4/CTS微球与失活酵母菌粉的质量比为（7-9）：1。
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