CN101349667A

CN101349667A - 一种生理活性物质的电化学检测装置及其专用电化学传感器和制备方法

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Publication number: CN101349667A
Application number: CNA2007101191275A
Authority: CN
Inventors: 毛兰群; 林雨青; 刘坤; 向玲; 苏磊
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2007-07-16
Filing date: 2007-07-16
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2027-07-16
Also published as: CN101349667B

Abstract

本发明公开了用于生理活性物质检测的电化学传感器及其制备方法与应用。本发明电化学传感器，包括基底电极，其中，在所述基底电极上还设有电化学催化剂层，和位于电化学催化剂层上的混合酶层；所述电化学催化剂层是由碳纳米材料和电化学催化剂的复合物构成的；所述混合酶包括催化待测生理活性物质氧化的脱氢酶，和消除干扰用的氧化酶。以该电化学传感器制备生理活性物质的电化学检测装置，能够实现对生理活性物质的在线连续检测，并且，检测的响应值不受氧气和pH变化的影响，在生命科学研究中(如脑神经生理学和临床医学)具有广泛的应用前景。

Description

一种生理活性物质的电化学检测装置及其专用电化学传感器和制备方法

技术领域

本发明涉及一种生理活性物质的电化学检测装置及其专用电化学传感器和制备方法。

背景技术

近些年来，化学物质在生理、病理过程中变化规律的研究已成为人们广泛关注的前沿问题，这主要是由于化学物质活体实时变化的信息可以直接反映生理和病理过程中的化学本质。例如，脑内葡萄糖和乳酸的变化可以直接反映脑内能量代谢过程；谷氨酸是中枢神经系统的兴奋性神经递质之一，其在脑内的存在水平及其变化规律与学习和记忆及神经可塑性等重要生理现象直接相关。因此，建立适用于生物体内化学物质的检测方法具有十分重要的生理和病理意义。活体微透析采样-在线电化学检测由于具有连续检测和时间分辨率高等优点，特别适合于生理活性物质的在线连续检测。目前，在线电化学检测方法基本上都是使用氧化酶来构筑选择性高的电化学传感器，但是，由于基于氧化酶的电化学传感器的响应对于氧气和pH具有很大的依赖性，体系中氧气和pH的变化会导致传感器响应的变化，从而影响检测结果的准确性和稳定性，因此，目前已报道的基于氧化酶的在线电化学体系很难适用于氧气和pH变化的生命体系的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生理活性物质检测的电化学传感器及其制备方法。

本发明所提供的用于生理活性物质检测的电化学传感器，包括基底电极，其中，在基底电极上还设有电化学催化剂层和位于电化学催化剂层上的混合酶层。电化学催化剂层是由碳纳米材料和电化学催化剂的复合物构成，混合酶包括催化待测生理活性物质氧化的脱氢酶和消除干扰用的氧化酶。

在电化学催化剂层中，每平方厘米基底电极上碳纳米材料和电化学催化剂的复合物含量为100～240μg，复合物中碳纳米材料与电化学催化剂的质量比为0.2～1；所述碳纳米材料选自碳纳米管、碳纳米纤维和碳纳米球中的一种或几种，每平方厘米基底电极上碳纳米材料的含量为30～70μg；本发明对纳米材料的尺寸无特别要求，一般来说，所述碳纳米材料的直径范围在1～500nm，优选1～10nm，平均长度在0.5～50μm，优选5～15μm。所述电化学催化剂选自亚甲基蓝、亚甲基绿、甲苯胺蓝和亮甲酚蓝中的一种或几种，每平方厘米基底电极上其含量为70～170μg。

在混合酶层中，消除干扰用的氧化酶选自抗坏血酸氧化酶、漆酶或者胆红素氧化酶中的一种，每平方厘米基底电极上氧化酶的含量为14～21U；每平方厘米基底电极上催化待测生理活性物质氧化的脱氢酶的含量为7～28U。根据目标检测物的不同，可选择相应的针对该检测物的脱氢酶。例如，对于葡萄糖，选用葡萄糖脱氢酶；对于乳酸，选用乳酸脱氢酶；对于谷氨酸，选用谷氨酸脱氢酶；对于乙醇，选用乙醇脱氢酶等等。基本上，每一个传感器上只固定一种脱氢酶，不可以将不同的脱氢酶整合到一个传感器上，达到一个传感器实现多个目标物的检测。

本发明用于生理活性物质检测的电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：

1)将纳米碳材料和电化学催化剂混合后进行超声处理，离心分离得到碳纳米材料和电化学催化剂的复合物，将所述复合物涂覆于基底电极上，干燥后形成电化学催化剂层；

2)将含有催化待测生理活性物质氧化的脱氢酶和消除干扰用的氧化酶的混合酶溶液涂覆于电化学催化剂层上，干燥，在电化学催化剂层上形成混合酶层，得到所述用于生理活性物质检测的电化学传感器。

其中，在上述制备过程中，步骤1)涂覆用复合物溶液的浓度为0.5-5mg/ml，每平方厘米基底电极上复合物溶液的用量为0.02ml-0.5ml。这样，可以使得在每平方厘米基底电极上复合物含量为100～240μg，并且，碳纳米材料和电化学催化剂的含量分别为30～70μg和70～170μg。

为了使混合酶能更好的固定于该电化学传感器上，混合酶溶液还加有交联剂，交联试剂为戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐或双偶氮苯，优选为戊二醛。消除干扰用的氧化酶选自抗坏血酸氧化酶、漆酶或者胆红素氧化酶中的一种。在上述制备过程中，步骤2)涂覆混合酶溶液时，每平方厘米基底电极使用如下用量的溶液：1000U/mL的氧化酶溶液14～21μL，1000U/mL的脱氢酶7～28μL，1g/100ml戊二醛溶液0.5～3μL。这样，可以使得每平方厘米基底电极上氧化酶的含量为14～21U；每平方厘米基底电极上脱氢酶的含量为7～28U。

应用本发明的电化学传感器，还可以制备出一种用来测定生理活性物质的在线电化学检测装置。该生理活性物质的电化学检测装置包括：电化学流动池、本发明用于生理活性物质检测的电化学传感器、生物样品供给管路、辅酶溶液供给管路和三通阀；所述电化学传感器设置于所述电化学流动池内，所述生物样品供给管路和所述辅酶溶液供给管路均通过所述三通阀与所述电化学流动池连接。

为了能够实现对生物样品的在线连续检测，生物样品供给管路还连接有微透析采样装置，该微透析采样装置可用来在线连续获得生物样品。

碳纳米材料由于具有独特的物理和化学性质，在很多科学研究和工业领域引起人们的广泛兴趣。碳纳米材料本身及其通过共价或者非共价功能化而得到的纳米复合物在电分析化学研究中具有十分重要价值。亚甲基蓝、亚甲基绿、(碱性)甲苯胺蓝、亮甲酚蓝等则是被广泛使用的一类水溶性的电化学催化剂，可以很好地催化辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)的电化学氧化。

本发明首先是通过利用碳纳米材料和亚甲基蓝、亚甲基绿、(碱性)甲苯胺蓝、亮甲酚蓝等电化学催化剂之间的相互作用，制备了一种对于辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)具有很好电化学催化性能的纳米复合物。通过将其固定电极表面，作为电化学传感器的换能器；然后，在电化学催化剂层上涂覆含有脱氢酶和消除干扰的氧化酶的混合酶层，得到检测目标物的电化学传感器。该电化学传感器具有检测限低、稳定性好、重现性好等优点，更为重要的是，由于电化学传感器使用脱氢酶作为生物催化剂，使电化学检测体系的响应对样品中氧气的变化不敏感。另外，辅酶是溶解在缓冲溶液中的，此缓冲溶液在三通阀处与生物样品混合，缓冲了生物样品溶液的pH变化，使得进入电化学传感器的样品溶液pH能保持恒定值(与缓冲液pH相当)，不受生理状态下pH变化的影响。以该电化学传感器制备生理活性物质的电化学检测装置，能够实现对生理活性物质的在线连续检测，并且，检测的响应值不受氧气和pH变化的影响，在生命科学研究中(如脑神经生理学和临床医学)具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为检测生理活性物质的电化学装置的结构示意图；

图2为不同的电化学催化剂：亚甲基绿(图2A)、亚甲基蓝(图2B)、亮甲酚蓝(图2C)催化氧化辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的响应图；

图3为本发明生理活性物质的电化学检测装置对脑透析液中葡萄糖和乳酸的响应图。

具体实施方式

实施例1、电化学传感器的制备

2mg碳纳米管(购自深圳市纳米港有限公司，直径＜2nm，长度在0.5～50μm)和5mg亚甲基绿分散在5ml蒸馏水中，25℃下超声(超声功率为50W，频率为50Hz)两个小时，将所得到的悬浊液5000rpm离心1分钟，得到的固体再用5ml蒸馏水分散，再次5000rpm离心1分钟得到碳纳米管和亚甲基绿的复合物。取此复合物1mg分散在1ml双蒸水中，配成1mg/mL的悬浊液，取7μL悬浊液滴涂在0.14平方厘米的电极上，25℃干燥，形成电化学催化剂层。将含有葡萄糖脱氢酶3U(1000U/mL，3μL)、抗坏血酸氧化酶2U(1000U/mL，2μL)和交联试剂(戊二醛)10μg(1g/100ml水溶液，1μL)的6μL混合液滴涂在电化学催化剂层之上，在25℃下干燥，形成混合酶层，得到检测葡萄糖的电化学传感器。

实施例2、电化学传感器的制备

2mg碳纳米纤维(购自深圳市纳米港有限公司，直径200nm，长度在100～200μm)和5mg亚甲基蓝分散在5ml蒸馏水中，25℃下超声(超声功率为40W，频率为60Hz)两个小时，所得到的悬浊液6000rpm离心1分钟，得到的固体再用5ml蒸馏水分散，再次6000rpm离心1分钟得到碳纳米纤维和亚甲基绿的复合物。取此复合物1mg分散在1ml双蒸水中，配成1mg/mL的悬浊液，取10μL悬浊液滴涂在0.14平方厘米的电极上，25℃干燥，形成电化学催化剂层。将含有乳酸脱氢酶4U(1000U/mL，4μL)、胆红素氧化酶2U(1000U/mL，2μL)和交联试剂(双偶氮苯)8μg(1g/100ml水溶液，0.8μL)的6.8μL混合液滴涂在电化学催化剂层之上，在25℃下干燥，形成混合酶层，得到检测乳酸的电化学传感器。

实施例3：电化学传感器的制备

2mg碳纳米球(中国科学院化学研究所合成，直径0.5μm，参考文献：Macromolecular Chemistry and Physics 207(18)：1633-1639)和5mg甲苯胺蓝分散在5ml蒸馏水中，25℃下超声(超声功率为10W，频率为50Hz)两个小时，所得到的悬浊液3000rpm离心1分钟，得到的固体再用5ml蒸馏水分散，再次5000rpm下离心1分钟得到碳纳米球和亚甲基绿的复合物。取此复合物1mg分散在1ml双蒸水中，配成1mg/ml的悬浊液，取1μL悬浊液滴涂在0.14平方厘米的电极上，25℃干燥后，形成电化学催化剂层。将含有谷氨酸脱氢酶2U(1000U/mL，2μL)、漆酶3U(1000U/mL，3μL)和交联试剂(戊二醛)20μg(1g/100ml水溶液，2μL)的7μL混合液滴涂在电化学催化剂层之上，在25℃下干燥，形成混合酶层，得到检测谷氨酸的电化学传感器。

实施例4、生理活性物质的电化学检测装置

如图1，生理活性物质的电化学检测装置包括：电化学流动池2，电化学传感器1，生物样品供给管路4和辅酶溶液供给管路5；电化学传感器1整合在电化学流动池2内；生物样品供给管路4和辅酶溶液供给管路5通过三通阀3通入电化学流动池2中，三通阀3的两个入口一个连接生物样品供给管路4，一个连接辅酶溶液供给管路5；在用于在线检测分析时，生物样品供给管路4可以与微透析采样装置6连接，这样，当需要检测活体内的生理活性物质时，可以通过微透析采样装置6获得生理活性物质样品，再通过生物样品供给管路4输送到电化学流动池2中进行检测，从而实现在线连续检测；辅酶溶液供给管路5用于向电化学流动池2输送辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)，为检测过程提供酶催化过程所必需的辅酶溶液。生理活性物质样品和辅酶溶液在三通阀3处混合，通过其出口通入到电化学流动池2中，在电化学传感器1处产生响应。其中，辅酶溶液是以缓冲液配制的，具有缓冲能力，当该辅酶溶液与生理活性物质样品在三通阀3混合时，能缓冲生物样品溶液的pH变化，使进入电化学传感器的溶液能保持恒定值，不受生理状态下pH变化的影响。另外，本发明中使用脱氢酶构筑生物传感器，脱氢酶本身的性质决定了其催化底物的反应和整个在线电化学体系不会受到生物样品中氧气变化的影响。

在进行具体检测时，在电化学传感器1处连接电化学工作站和数据采集装置，为检测过程提供恒定电位并采集检测过程所产生的数据响应值。该电化学工作站和数据采集装置可采用目前各种常用的设备。

图2A、图2B和图2C分别为电化学催化剂亚甲基绿、亚甲基蓝和亮甲酚蓝催化氧化辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的图，三幅图中虚线都代表在没有辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下，电化学催化剂和纳米材料的复合物自身的电化学行为；实线代表在辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下，电化学催化剂和纳米材料的复合物对辅酶的电化学催化行为。从中可以看出，此三种催化剂对辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸都有明显的催化效果，由此可以构筑基于脱氢酶生物传感器。

图3为利用上述检测装置对SD大鼠脑透析液中葡萄糖(曲线A)和乳酸(曲线B)的在线响应图，其中，电化学传感器分别为实施例1所得到的检测葡萄糖的电化学传感器和实施例2所得到的检测乳酸的电化学传感器，所用的基底电极均为碳膜电极，两个传感器的工作电位都为0V vs.Ag/AgCl；脑透析液的流速为2μL/min；辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液浓度为1.4mmol/L(所用缓冲液成分为126mmol/L NaCl，27.5mmol/INaHCO₃，2.4mmol/L KCl，1.1mmol/L CaCl₂，0.85mmol/L MgCl₂，0.5mmol/L KH₂PO₄和0.5mmol/L Na₂SO₄，pH为7.4)，流速为3μL/min。

图3中，脑透析液代表采用微透析采样装置从动物脑内采集到的生物样品，基线代表空白液。微透析采样装置是以透析为原理，通过非平衡条件下灌注埋在动物组织中的微透析探针，组织中待测化合物沿浓度梯度逆向扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的。微透析采样装置可采用各种常用的设备，如瑞典CMA公司，美国BAS公司或者其他公司的微透析采样装置。

图3结果表明，当动物脑透析液进入该电化学检测装置后，电化学传感器会对样品内相应的物质产生电流响应，此电流响应可以通过标准曲线换算为具体的浓度数值，因此，该电化学检测装置可以反映出动物脑内的葡萄糖和乳酸的浓度。在大脑透析液中含有很多电活性物种，这些物质可能会在电极上产生干扰信号。本发明中传感器的选择性首先是通过对底物特异性氧化的脱氢酶来实现的。其次，文献(AnalyticalChemistry.2005，77，6234-6242)可以证明，在测定脑透析液的在线电化学体系中，传感器中使用碳纳米材料时，除了抗坏血酸，其他电活性物种不会存在干扰。最后，我们用的消除干扰的氧化酶都可以把抗坏血酸提前氧化而除去，不会干扰传感器对底物的响应。

Claims

1、一种用于生理活性物质检测的电化学传感器，包括基底电极，其特征在于：在所述基底电极上还设有电化学催化剂层，和位于电化学催化剂层上的混合酶层；所述电化学催化剂层是由碳纳米材料和电化学催化剂的复合物构成的；所述混合酶包括催化待测生理活性物质氧化的脱氢酶，和消除干扰用的氧化酶。

2、根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于：所述碳纳米材料选自碳纳米管、碳纳米纤维和碳纳米球中的一种或几种；所述电化学催化剂选自亚甲基蓝、亚甲基绿、甲苯胺蓝和亮甲酚蓝中的一种或几种。

3、根据权利要求2所述的电化学传感器，其特征在于：所述电化学催化剂层中，每平方厘米基底电极上碳纳米材料和电化学催化剂的复合物含量为100～240μg，所述复合物中碳纳米材料与电化学催化剂的质量比为0.2～1。

4、根据权利要求1-3任一所述的电化学传感器，其特征在于：所述消除干扰用的氧化酶选自抗坏血酸氧化酶、漆酶或者胆红素氧化酶中的一种，每平方厘米基底电极上所述氧化酶的含量为14～21U；每平方厘米基底电极上所述催化待测生理活性物质氧化的脱氢酶的含量为7～28U。

5、权利要求1所述用于生理活性物质检测的电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：

1)将纳米碳材料和电化学催化剂混合后进行超声处理，离心分离得到碳纳米材料和电化学催化剂的复合物，将所述复合物涂覆于基底电极上，干燥，形成电化学催化剂层；

6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述碳纳米材料选自碳纳米管、碳纳米纤维和碳纳米球中的一种或几种；所述电化学催化剂选自亚甲基蓝、亚甲基绿、甲苯胺蓝和亮甲酚蓝中的一种或几种；所述碳纳米材料与电化学催化剂的质量比为0.2～1∶1。

7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤1)涂覆用复合物溶液的浓度为0.5-5mg/ml，每平方厘米基底电极上复合物溶液的用量为0.02ml-0.5ml。

8、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述消除干扰用的氧化酶选自抗坏血酸氧化酶、漆酶或者胆红素氧化酶中的一种；所述混合酶溶液还加有交联剂；交联剂为戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐或双偶氮苯，优选为戊二醛。

9、根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤2)涂覆混合酶溶液时，每平方厘米基底电极使用含有如下用量的混合溶液：1000 U/mL的氧化酶溶液14～21μL，1000 U/mL的脱氢酶7～28 μL，1g/100ml戊二醛溶液0.5～3 μL。

10、一种生理活性物质的电化学检测装置，包括：电化学流动池、权利要求1所述用于生理活性物质检测的电化学传感器、生物样品供给管路、辅酶溶液供给管路和三通阀；所述电化学传感器设置于所述电化学流动池内，所述生物样品供给管路和所述辅酶溶液供给管路均通过所述三通阀与所述电化学流动池连接。

11、根据权利要求10所述的电化学检测装置，其特征在于：所述生物样品供给管路还连接有微透析采样装置。