CN103913495A - 一种检测多巴胺的电极的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测多巴胺（DA）的电极的制备方法。该制备电极的方法包括如下步骤：将还原氧化石墨烯（rGO）悬浮液滴涂到丝网印刷电极（SPE）表面得到SPE/rGO，再通过循环伏安法将β-环糊精（β-CD）和葡萄糖氧化酶（GOx）混合液电沉积到SPE/rGO电极上，得到修饰电极SPE/rGO/β-CD/GOx。本发明提供的电极制备方法具有成本低廉，步骤简便的优点，且制备出的电极响应速度快，灵敏度高，选择性好。

Description

一种检测多巴胺的电极的制备方法
技术领域
本发明属于生化分析领域，涉及一种检测多巴胺的快速电极的制备方法。
背景技术
多巴胺(DA)是存在于中枢神经系统的一类重要的神经传递素, 它能调节脑内相关中枢神经系统的多种功能及精神活动，如感知、情感、行为和运动等。体内DA失调将会导致精神分裂症以及帕金森氏综合症等疾病。因此，对其含量测定在生理功能研究和临床应用方面都具有重要的意义。
近年来，不同类型检测DA的方法和应用成为研究热点。国内外常采用的检测DA的方法包括高效液相色谱法，紫外-可见分光光度法，荧光分光光度法，毛细管电泳法，电化学方法等。但现有的这些检测方法不同程度的存在分析速度慢，检测结果不稳定，操作工艺复杂，成本较高等问题。
事实上，由于抗坏血酸（AA）、多巴胺前躯体及代谢产物的存在，使得DA的检测成为一大难题。传统的检测方法无法排除这些物质的干扰，电化学方法作为一种新兴的检测手段，能够有效的排除AA、尿酸（UA）等物质的干扰，在一定的浓度范围内选择性的检测出DA。目前，科研工作者已经研究出一系列选择性检测DA的电化学方法。如石墨烯修饰玻碳电极，在保持AA浓度始终为1mM的情况下，能够检测出DA浓度的线性范围是4μM-100μM，检测限是2.64μM（Kim, Y.-R., S. Bong, et al. Electrochemical detection of dopamine in the presence of ascorbic acid using graphene modified electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 2010.25(10): 2366-2369.）；漆酶/多壁碳纳米管修饰玻碳电极，在生理水平的AA和3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）干扰下，该电极检测DA的线性范围是1-30μM，检测限是0.4μM(Xiang, L., Y. Lin, et al. Laccase-catalyzed oxidation and intramolecular cyclization of dopamine: A new method for selective determination of dopamine with laccase/carbon nanotube-based electrochemical biosensors. Electrochimica Acta. 2007.52(12): 4144-4152)；二茂铁/多壁碳纳米管修饰玻碳电极，在AA浓度高达10mM情况下，检测DA的线性范围是0.5μM-20μM，检测限是0.3μM(Cheng, H., H. Qiu, et al. Investigation of the electrochemical behavior of dopamine at electrodes modified with ferrocene-filled double-walled carbon nanotubes. Electrochimica Acta. 2012. 63: 83-88.)。这些电极均能在特定浓度的干扰物存在下，较灵敏的选择性检测出DA。但这些电化学检测DA方法使用的电极多为玻碳电极，玻碳电极价格相对昂贵且需要经过复杂的预处理活化步骤，使得电极的制备非常复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测DA的电极的制备方法。本发明用成本低廉的丝网印刷电极（SPE）为载体，修饰上还原氧化石墨烯(rGO)、β-环糊精(β-CD)和葡萄糖氧化酶(GOx)，得到修饰电极SPE/rGO/β-CD/GOx，实现了快速有效的检测DA的目的。该电极具有成本低、操作简便、快速、灵敏、选择性好等优点。
本发明提供一种检测多巴胺的电极的制备方法，该方法包括如下步骤：
（1）将rGO加入无水乙醇中，超声分散0.5～8h得到rGO悬浮液，所述rGO悬浮液浓度为100～2000mg /L；
（2）移取rGO悬浮液并滴涂至活化处理后的SPE上，滴涂量为10～30μL，制得SPE/rGO；
（3）将β-CD和GOx溶解于pH值为6.2～8.0的PBS缓冲液中，每1mL的PBS缓冲液中溶有0.005～0.025g的β-CD和活力为500～5000U的GOx；再使用SPE/rGO扫描该混合溶液，扫描的电位范围为-0.2～0.8V，得到SPE/rGO/β-CD/GOx电极。
步骤（1）所述rGO悬浮液浓度为1000mg/L。
步骤（2）所述rGO悬浮液的滴涂量为15μL。
步骤（3）将β-CD和GOx溶解于PBS缓冲液中，每1mL的PBS缓冲液中溶有0.0113g的β-CD和活力为2000U的GOx。
所述PBS缓冲液pH值为7.4。
步骤（3）所述SPE/rGO扫描混合溶液的过程中，SPE/rGO的工作电极作工作电极，SPE/rGO的参比电极作参比电极，SPE/rGO的对电极作对电极，扫描速率10～100mV/s，扫描圈数为5～20圈。
所述扫描速率为50mV/s，扫描圈数为10圈。
所述rGO是由氢碘酸还原法制得，其还原法步骤如下：
将100～400mgGO加入50～200ml无水乙醇中超声分散，直至GO在无水乙醇中彻底分散；然后加入50ml质量分数为55%～58%的氢碘酸，在水浴锅恒温85℃加热0.5～3h后，溶液离心分离并烘干。
所述rGO是由氢碘酸还原法制得，其还原法步骤如下：将260mgGO加入130ml无水乙醇中超声分散，直至GO在无水乙醇中彻底分散；然后加入50ml质量分数为55%～58%的氢碘酸，在水浴锅恒温85℃加热1h后，溶液离心分离并烘干。
活化处理后的SPE是由如下方法制得：在电化学工作站中，SPE的参比电极作参比电极，SPE的工作电极作工作电极，SPE的对电极作对电极，采用循环伏安法扫描酸溶液，循环伏安扫描酸液的电位范围为-1.5～1.5V，扫描速率为10～100mV/s，扫描圈数为1～20圈；所述酸溶液为硫酸、硝酸或盐酸，其浓度为0.1～1M。
所述酸溶液为硫酸，浓度为0.5M。
所述扫描速率为50mV/s，扫描圈数为10圈。
本发明中所使用的丝网印刷电极（SPE）：苏州长三角系统生物交叉科学研究院有限公司
氧化石墨烯(GO)：南京先锋纳米科技公司
β-环糊精(β-CD)：上海三浦化工有限公司
葡萄糖氧化酶(GOx)：sigma公司。
本发明的优点在于：(1) 制备成本低廉；（2）制备方法简单； (3)制备的电极响应速度快，灵敏度高，选择性好。
附图说明
图1为滴涂法制备SPE/rGO示意图。
图2为SPE/rGO/β-CD/GOx检测DA反应原理图。
图3为实施例1中SPE的10000倍SEM图。
图4为实施例1中SPE/rGO的10000倍SEM图。
图5为实施例1中SPE/rGO/β-CD/GOx的10000倍SEM图。
图6为实施例2中SPE/rGO/β-CD/GOx检测不同浓度DA的DPV图（插图为DPV峰流值与DA浓度的拟合曲线）。
图7为实施例3中SPE/rGO/β-CD/GOx在UA干扰下选择性检测不同浓度DA的DPV峰流值与DA浓度的拟合曲线。
图8为实施例4中SPE/rGO/β-CD/GOx在AA干扰下选择性检测不同浓度DA的DPV峰流值与DA浓度的拟合曲线。
图9为实施例6中SPE/rGO/β-CD/GOx检测不同浓度DA的DPV峰流值与DA浓度的拟合曲线。
图 10为实施例8中SPE/rGO/β-CD/GOx检测不同浓度DA的DPV峰流值与DA浓度的拟合曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。 
实施例1、SPE/rGO/β-CD/GOx的制备
SPE的活化处理：在电化学工作站中，以SPE的参比电极作参比电极，SPE的对电极作对电极，SPE的工作电极作工作电极，在-1.5～1.5V电位下以50mV/s的扫速扫描0.5M硫酸溶液，扫描10圈。活化后的电极室温下放置干燥。
将260mgGO加入130ml无水乙醇中超声分散，直至GO在无水乙醇中彻底分散为止，得到黄褐色均质液体。在分散后的GO中，加入50ml质量分数为55%~58%的氢碘酸，在水浴锅恒温85℃加热1h。反应结束后，溶液离心分离并烘干得到rGO。
取100mg rGO在100ml无水乙醇中超声处理3h，直至rGO完全分散得到均匀的悬浮液。用移液枪取15μL rGO悬浮液滴涂SPE，电极室温下放置干燥。
称取0.0113g β-CD和活力为2000U的GOx溶于1mL PBS缓冲液（pH 7.4）中，并充分混合。得到的β-CD和GOx混合液作电解液，SPE/rGO的参比电极作参比电极，SPE/rGO的对电极作对电极，SPE/rGO的工作电极作工作电极，采用循环伏安法扫描10圈，扫描电位-0.2～0.8V，扫速50mV/s。
所得SPE、SPE/rGO与SPE/rGO/β-CD/GOx的扫描电镜图分别如图3、4和5所示。由图5可知，用以上方法，成功的将rGO, β-CD-GOx修饰到SPE电极表面。SPE/rGO/β-CD/GOx电极表面为多孔的球形态。
实施例2、SPE/rGO/β-CD/GOx电极DA检测的灵敏度，检测限和检测范围
分别配制5、10、15、20、30、40、50、60、65、70、80、100μM的DA溶液，并用实施例1制备所得的SPE/rGO/β-CD/GOx的参比电极作参比电极，SPE/rGO/β-CD/GOx的对电极作对电极，SPE/rGO/β-CD/GOx的工作电极作工作电极，采用差分脉冲伏安法（DPV）扫描这12个不同浓度的DA溶液，扫描电位范围为-0.2～0.6V。取各浓度下DA的峰流值与DA浓度作拟合曲线。
图6为SPE/rGO/β-CD/GOx电极用DPV法扫描不同浓度DA的峰电流值与DA浓度的拟合曲线（I(DA)=-0.0788C(DA)-7.8173）。由图分析得到，SPE/rGO/β-CD/GOx对检测DA的线性范围为5-100μM，灵敏度为0.0788μAμM -1，检测限为1.56μM。这些结果说明SPE/rGO/β-CD/GOx电极能够在较宽的线性范围内检测出DA，且对DA检测有较高的灵敏度，和较低的检出限。
实施例3、UA干扰下，SPE/rGO/β-CD/GOx对DA的选择性检测
分别配制DA浓度为5、10、20、30、40、50、55μM的DA和UA的混合液，其中UA浓度始终为DA浓度的10倍。按实施例2采用的DPV法，求出在UA干扰的情况下，SPE/rGO/β-CD/GOx电极对DA的检测限，灵敏度和线性范围。
图7为UA干扰浓度为DA浓度的10倍时，SPE/rGO/β-CD/GOx电极扫描不同浓度DA的DPV峰电流值与DA浓度的拟合曲线（I(DA)=-0.0596C(DA)-2.6134）。由图分析得到，UA干扰下，SPE/rGO/β-CD/GOx电极对DA的线性范围为5-55μM，灵敏度为0.0596μAμM -1，检测限为2.06μM。说明该电极对DA有较高的选择性，能在高浓度的UA干扰下，选择性的检测出DA。
实施例4、AA干扰下，SPE/rGO/β-CD/GOx对DA选择性检测
分别配制DA浓度为5、10、15、20、30、40、50μM的DA和AA的混合液，其中AA浓度始终为DA浓度的10倍。按实施例2采用的DPV法，求出在AA干扰的情况下，SPE/rGO/β-CD/GOx电极对DA的检测限，灵敏度和线性范围。
图8为AA干扰浓度为DA浓度的10倍时，SPE/rGO/β-CD/GOx电极扫描不同浓度DA的DPV峰电流值与DA浓度的拟合曲线（I(DA)=-0.1764C(DA)-5.8026）。由图分析得到，AA干扰下，SPE/rGO/β-CD/GOx电极对DA的线性范围为5-50μM，灵敏度为0.1764μAμM -1，检测限为1.67μM。说明该电极能在AA干扰下，灵敏的选择性检测出DA。
实施例5、SPE/rGO/β-CD/GOx的制备
在电化学工作站中，以SPE的参比电极作参比电极，SPE的对电极作对电极，SPE的工作电极作工作电极，在-1.5～1.5V电位下以10mV/s的扫速扫描0.1M硝酸溶液，扫描1圈。活化后的电极室温下放置干燥。
将100mgGO加入200ml无水乙醇中超声分散，直至GO在无水乙醇中彻底分散为止，得到黄褐色均质液体。在分散后的GO中，加入50ml质量分数为55%~58%的氢碘酸，在水浴锅恒温85℃加热0.5h。反应结束后，溶液离心分离并烘干得到rGO。
取10mg rGO在100ml无水乙醇中超声处理0.5h，直至rGO完全分散得到均匀的悬浮液。用移液枪取10μL rGO悬浮液滴涂SPE，电极室温下放置干燥。
称取0.005g β-CD和活力为500U的GOx溶于1mL PBS缓冲液（pH 6.2）中，并充分混合。得到的β-CD和GOx混合液作电解液，SPE/rGO的参比电极作参比电极，SPE/rGO的对电极作对电极，SPE/rGO的工作电极作工作电极，采用循环伏安法扫描5圈，扫描电位-0.2～0.8V，扫速10mV/s。
实施例6、SPE/rGO/β-CD/GOx电极DA检测的灵敏度，检测限和检测范围
分别配制5、10、15、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、100μM的DA溶液，并用实施例5制备所得的SPE/rGO/β-CD/GOx的参比电极作参比电极，SPE/rGO/β-CD/GOx的对电极作对电极，SPE/rGO/β-CD/GOx的工作电极作工作电极，采用DPV法扫描这14个不同浓度的DA溶液，电位范围为-0.2～0.6V。取各浓度下DA的峰流值与DA浓度作拟合曲线。
图9为SPE/rGO/β-CD/GOx电极用DPV法扫描不同浓度DA的峰电流值与DA浓度的拟合曲线（I(DA)=-0.0737C(DA)-7.835）。由图分析得到，SPE/rGO/β-CD/GOx对检测DA的线性范围为5-100μM，灵敏度为0.0737μAμM -1，检测限为1.67μM。
实施例7、SPE/rGO/β-CD/GOx的制备
在电化学工作站中，以SPE的参比电极作参比电极，SPE的对电极作对电极，SPE的工作电极作工作电极，在-1.5～1.5V电位下以100mV/s的扫速扫描1M盐酸溶液，扫描20圈。活化后的电极室温下放置干燥。
将400mgGO加入50ml无水乙醇中超声分散，直至GO在无水乙醇中彻底分散为止，得到黄褐色均质液体。在分散后的GO中，加入50ml纯度为55%~58%的氢碘酸，在水浴锅恒温85℃加热3h。反应结束后，溶液离心分离并烘干得到rGO。
取200mg rGO在100ml无水乙醇中超声处理8h，直至rGO完全分散得到均匀的悬浮液。用移液枪取30μL rGO悬浮液滴涂SPE，电极室温下放置干燥。
称取0.025g β-CD和活力为5000U的GOx溶于1mL PBS缓冲液（pH 8.0）中，并充分混合。得到的β-CD和GOx混合液作电解液，SPE/rGO的参比电极作参比电极，SPE/rGO的对电极作对电极，SPE/rGO的工作电极作工作电极，采用循环伏安法扫描20圈，扫描电位-0.2～0.8V，扫速100mV/s。
实施例8、SPE/rGO/β-CD/GOx电极DA检测的灵敏度，检测限和检测范围
分别配制5、10、15、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、100μM的DA溶液，并用实施例7制备所得的SPE/rGO/β-CD/GOx的参比电极作参比电极，SPE/rGO/β-CD/GOx的对电极作对电极，SPE/rGO/β-CD/GOx的工作电极作工作电极，采用DPV扫描这14个不同浓度的DA溶液，电位范围为-0.2～0.6V。取各浓度下DA的峰流值与DA浓度作拟合曲线。
图10为SPE/rGO/β-CD/GOx电极用DPV法扫描不同浓度DA的峰电流值与DA浓度的拟合曲线（I(DA)=-0.0753C(DA)-7.7006）。由图分析得到，SPE/rGO/β-CD/GOx对检测DA的线性范围为5-100μM，灵敏度为0.0753μAμM -1，检测限为1.63μM。

Claims (10)

1.一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）将rGO加入无水乙醇中，超声分散0.5～8h得到rGO悬浮液，所述rGO悬浮液浓度为100～2000mg /L；     
（2）移取rGO悬浮液并滴涂至活化处理后的SPE上，滴涂量为10～30μL，制得SPE/rGO；
（3）将β-CD和GOx溶解于pH值为6.2～8.0的PBS缓冲液中，每1mL的PBS缓冲液中溶有0.005～0.025g的β-CD和活力为500～5000U的GOx；再使用SPE/rGO扫描该混合溶液，扫描的电位范围为-0.2～0.8V，得到SPE/rGO/β-CD/GOx电极。
2.根据权利要求1所述一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述rGO悬浮液浓度为1000mg /L。
3.根据权利要求1所述一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于：步骤（3）将β-CD和GOx溶解于PBS缓冲液中，每1mL的PBS缓冲液中溶有0.0113g的β-CD和活力为2000U的GOx。
4.根据权利要求1所述一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述SPE/rGO扫描混合溶液的过程中，SPE/rGO的工作电极作工作电极，SPE/rGO的参比电极作参比电极，SPE/rGO的对电极作对电极，扫描速率10～100mV/s，扫描圈数为5～20圈。
5.根据权利要求4所述一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于：所述扫描速率为50mV/s，扫描圈数为10圈。
6.根据权利要求1所述一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于：所述rGO是由氢碘酸还原法制得，其还原法步骤如下：将100～400mgGO加入50～200ml无水乙醇中超声分散，直至GO在无水乙醇中彻底分散；然后加入50ml质量分数为55%～58%的氢碘酸，在水浴锅恒温85℃加热0.5～3h后，溶液离心分离并烘干。
7.根据权利要求1或6所述一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于：所述rGO是由氢碘酸还原法制得，其还原法步骤如下：将260mgGO加入130ml无水乙醇中超声分散，直至GO在无水乙醇中彻底分散；然后加入50ml质量分数为55%～58%的氢碘酸，在水浴锅恒温85℃加热1h后，溶液离心分离并烘干。
8.根据权利要求1所述一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于：SPE活化处理步骤如下：在电化学工作站中，SPE的参比电极作参比电极，SPE的工作电极作工作电极，SPE的对电极作对电极，采用循环伏安法扫描酸溶液，循环伏安扫描酸液的电位范围为-1.5～1.5V，扫描速率为10～100mV/s，扫描圈数为1～20圈；所述酸溶液为硫酸、硝酸或盐酸，其浓度为0.1～1M。
9.根据权利要求8所述一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于：所述酸溶液为硫酸，浓度为0.5M。
10.根据权利要求8所述一种检测多巴胺的电极的制备方法，其特征在于：所述扫描速率为50mV/s，扫描圈数为10圈。
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