CN105223262A - 基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法 - Google Patents
基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105223262A CN105223262A CN201510695672.3A CN201510695672A CN105223262A CN 105223262 A CN105223262 A CN 105223262A CN 201510695672 A CN201510695672 A CN 201510695672A CN 105223262 A CN105223262 A CN 105223262A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- tetracycline
- aptamer
- biology sensor
- sodium alginate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种基于核酸适配体检测四环素的生物传感器,包括:位于电解液内的三电极体系的丝网印刷电极,该丝网印刷电极具体包括:表面具有修饰四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物层和四环素核酸适配体层的工作电极、作为对电极的碳电极以及作为参比电极的Ag/AgCl电极;所述的电解液为以硫堇为电化学探针的醋酸盐缓冲液。本发明利用四氧化三铁/还原氧化石墨烯的电化学信号放大作用和核酸适配体对底物的特异性结合作用,可以灵敏、准确、特异性地检测四环素。本发明制备的核酸适配体的生物传感器具有价格低廉、制备方法简单、试剂用量少、重现性好和稳定性好等优点。同时该方法也可应用于其它抗生素的检测,是一种有发展潜力的电化学测定方法,适用于食品安全中四环素的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种食品安全领域的技术,具体是一种基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法。
背景技术
抗生素被广泛用于人类医疗以及动物养殖中,用于防病治病、提高饲料利用率和促进动物生长。四环素是一种常见的抗生素,具有良好的广谱抗菌性,被广泛应用于畜禽养殖。我国是世界上四环素类抗生素生产、销售大国,抗生素的使用不合理及滥用导致其在动物性食品和环境中的药物残留。目前,常见致病菌对四环素类耐药现象严重,对生态系统和人类健康构成严重威胁。因此,研究快速、简便、经济、可靠的四环素快速检测技术具有重要的现实意义。
传统的四环素测定方法主要有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法和液相色谱法。尽管这些方法灵敏度高,但传统的四环素检测方法存在的显著弊端是检测耗时长、常需要繁杂的前处理过程、较为昂贵的仪器设备以及专业的技术操作人员。因此,急需建立一种快速、准确且特异性高的四环素残留检测方法。
经过对现有技术的检索发现,中国专利文献号CN104931553A,公开(公告)日2015.09.23,公开了一种基于丝网印刷电极的四环素适配体传感器制备及检测方法,将离子液和四氧化三铁逐层修饰到丝网印刷电极表面常温下静置至干燥,然后四环素适配体固定到经上述纳米材料修饰的丝网印刷电极表面。但该技术电极的修饰过程需要三个步骤,操作步骤越繁琐,影响因素越多,并且耗时也更长。再者,该技术实施过程中使用离子液体,用于制备离子液体的吡啶类原料是挥发性有机物,且离子液体的再生过程是采用具有挥发性的传统有机溶剂进行萃取的过程。已有研究表明,离子液体具有潜在的毒性,对生物体以及生态环境存在潜在危害。
陈丹、姚冬生、谢春芳、刘大岭在《中国生物工程杂志》上公开了一种“四环素核酸适配体电化学生物传感器的研制”,其利用等温滴定量热法筛选到的四环素核酸适配体做识别分子制作生物传感器,用电化学方法研究了该生物传感器检测四环素的电化学行为。结果:等温滴定量热法筛选出一条对四环素有高亲和力的适配体,解离平衡常数Kd=51.8μmol/L。差分脉冲伏安分析,在5.0~5.0×103μg/L浓度范围内,峰电流值的变化ΔIp与四环素浓度的对数呈现良好的线性关系,相关系数R2=0.9876,检测限为1.0μg/L,反应时间为15min。该检测限明显低于目前国家限定的四环素残留量(6.0×102μg/L),也低于目前其他报道的四环素适配体传感器的检测限。但该技术采用的普通固体电极,每次使用前均需要打磨、活化、清洗等前处理步骤,费时费力,且预处理后电极的均一性难以保证。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足,提出一种基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明涉及一种基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器,该生物传感器的丝网印刷电极的工作电极上依次修饰有四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物层和四环素核酸适配体层。
本发明涉及上述生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)将四氧化三铁/还原氧化石墨烯超声分散在海藻酸钠水溶液中,得到均一的四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物;
所述的四氧化三铁/还原氧化石墨烯,即具有空心半球结构的四氧化三铁纳米颗粒均匀生长在还原氧化石墨烯片表面形成的一种纳米复合物,具体通过以下方式得到:
1.1)将氧化石墨烯、表面活性剂P123和/或F127,超声分散到溶剂中;
1.2)将可溶性铁盐和可溶性有机盐加入到上述溶液中,充分搅拌均匀后得到;
所述的溶剂为乙二醇、乙醇和水中的至少一种;
所述的可溶性铁盐为氯化铁、硝酸铁、硫酸铁中的一种或几种混合。
所述的可溶性有机盐为乙酸钠和/或乙酸钾。
2)将四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物修饰到丝网印刷电极的工作电极表面,室温下干燥成膜;
所述丝网印刷电极的工作电极的材质为碳;
3)将四环素核酸适配体涂布在修饰有四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物的工作电极表面,室温下干燥成膜后清洗即得。
所述的四环素核酸适配体,即76‐mer的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示,具体为:
5′‐CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG‐3′。
本发明涉及上述生物传感器的四环素检测方法,包括以下步骤:
1)将所得生物传感器在不同浓度待检测四环素溶液中孵育50min,清洗;
2)以四环素核酸适配体修饰电极作为工作电极,碳电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,组成三电极体系;
3)将三电极体系置于含有1.0mmol/L硫堇的0.1mol/L、pH6.0醋酸盐缓冲液中,采用差分脉冲伏安法检测生物传感器在四环素溶液中孵育前后电化学信号的变化,即实现四环素的检测。
所述的差分脉冲伏安法中,电位设置为–0.5V到–0.1V,脉冲宽度为0.05V,扫描速率为0.5s。
技术效果
与现有技术相比,本发明通过在丝网印刷电极上首先修饰四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物,四氧化三铁/还原氧化石墨烯具有良好的导电性、催化活性和较大的比表面积,能促进电极表面电子转移,且海藻酸钠具有较好的生物相容性与成膜性,能很好地吸附固定生物活性物质并保持其活性。在检测过程中,修饰到电极上的四环素核酸适配体在电极表面会发生自折叠。当检测体系中存在四环素时,修饰的四环素核酸适配体与四环素特异性结合,四环素插入到核酸适配体自折叠的高级结构区域,核酸适配体在电极界面的状态发生改变,空间位阻减少,降低氧化还原探针与电极界面的电阻,促进电子传递,随着四环素浓度的增加,界面电子传递也加快,从而实现对四环素的定量检测。
本发明利用修饰的四环素核酸适配体与四环素特异性结合,导致电极表面电化学信号的变化,从而实现对四环素的检测。将前述的四环素核酸适配体修饰电极作为工作电极,碳电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,组成三电极体系,在含有硫堇的醋酸盐缓冲液中,采用差分脉冲伏安法检测目标物质孵育前后电化学信号的变化,即可定量检测待测目标物。
本发明采用的四氧化三铁/还原氧化石墨烯具有较好的信号放大作用,制备的核酸适配体生物传感器灵敏度高、检测速度快、特异性高,并且操作简便、成本低廉,可以弥补现有四环素检测方法的缺陷与不足。
本发明的有益效果进一步包括:
1)本发明采用的四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物不仅生物相容性好,而且具有较好的信号放大作用,极大地提高检测四环素的性能;
2)本发明使用丝网印刷电极,其电极简便、小型化、易携带,且使用前无需任何预处理;
3)本发明制备方法简单、性能稳定、成本低、试剂用量少,适用于食品安全中四环素的快速检测;
4)以丝网印刷电极为固定载体制备基于核酸适配体的生物传感器,对四环素的检出限为0.6nmol/L。
附图说明
图1为核酸适配体传感器检测不同浓度目标物的差分脉冲伏安响应图;
图2为基于图1作的该核酸适配体传感器的工作曲线图,该图横坐标为目标物浓度的对数值,纵坐标为检测的目标物孵育前后峰电流变化值;
图3为不同抗生素加入该检测体系后的电化学信号变化量示意图,图中:四环素浓度为500nmol/L,美罗培南(meropenem)、7‐氨基头孢烷酸(7‐ACA)、安曲霉素(anthramycin)、氨苄青霉素(ampicillin)和庆大霉素(gentamycin)浓度均为5μmol/L,空白对照为超纯水。
具体实施方式
实施例1
本实施例包括以下步骤:
1)将3.75mg四氧化三铁/还原氧化石墨烯超声分散在10mL的2.0mg/mL海藻酸钠水溶液中,得到均一的四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物;
2)将3μL四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物修饰到工作电极表面,室温下干燥成膜;
3)将3μL浓度为5.0μmol/L的四环素核酸适配体[序列为5′‐CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG‐3′(76‐mer)]涂布在修饰有四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物的工作电极表面,室温下干燥成膜,清洗。
实施例2
将实施例1得到的核酸适配体传感器用于四环素的检测,步骤如下:
1)将所得电极在不同浓度待检测四环素(1nmol/L,5nmol/L,10nmol/L,50nmol/L,100nmol/L,500nmol/L,1μmol/L,5μmol/L)溶液中孵育50min,并清洗;
2)以四环素核酸适配体修饰电极作为工作电极,碳电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,组成三电极体系,在含有1.0mmol/L硫堇的0.1mol/L、pH6.0醋酸盐缓冲液中,采用差分脉冲伏安法检测四环素孵育前后电化学信号的变化,电位设置为–0.5V到–0.1V,脉冲宽度为0.05V,扫描速率为0.5s;
3)以不同浓度四环素的差分脉冲伏安法响应曲线作图,并根据四环素浓度对数值与对应的峰电流变化值绘制标准曲线。
实施例3
将实施例1得到的核酸适配体传感器用于四环素和其它抗生素的检测,步骤如下:
1)将所得电极分别在不同待检测抗生素溶液中孵育50min,其中四环素浓度为500nmol/L,美罗培南(meropenem)、7‐氨基头孢烷酸(7‐ACA)、安曲霉素(anthramycin)、氨苄青霉素(ampicillin)和庆大霉素(gentamycin)浓度均为5μmol/L,空白对照为超纯水,孵育后清洗;
2)以四环素核酸适配体修饰电极作为工作电极,碳电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,组成三电极体系,在含有1.0mmol/L硫堇的0.1mol/L、pH6.0醋酸盐缓冲液中,采用差分脉冲伏安法检测核酸适配体传感器孵育前后电化学信号的变化,电位设置为–0.5V到–0.1V,脉冲宽度为0.05V,扫描速率为0.5s,检测不同待测物孵育前后电化学信号的变化;
3)以不同抗生素与对应的峰电流变化值作图。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整,本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限,在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
Claims (7)
1.一种基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器,其特征在于,该生物传感器的丝网印刷电极的工作电极上依次修饰四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物层和四环素核酸适配体层。
2.根据权利要求1所述的生物传感器,其特征是,所述的依次修饰,具体包括以下步骤:
1)将四氧化三铁/还原氧化石墨烯超声分散在海藻酸钠水溶液中,得到均一的四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物;
2)将四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物修饰到丝网印刷电极的工作电极表面,室温下干燥成膜;
3)将四环素核酸适配体涂布在修饰有四氧化三铁/还原氧化石墨烯‐海藻酸钠复合物的工作电极表面,室温下干燥成膜后清洗即得。
3.根据权利要求2所述的生物传感器,其特征是,所述的四环素核酸适配体,即76‐mer的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示,具体为:
5′‐CGTACGGAATTCGCTAGCCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTGGATCCGAGCTCCACGTG‐3′。
4.根据权利要求2所述的生物传感器,其特征是,所述的四氧化三铁/还原氧化石墨烯,即掺杂四氧化三铁的还原氧化石墨烯。
5.根据权利要求2或4所述的生物传感器,其特征是,所述的四氧化三铁/还原氧化石墨烯,通过以下方式得到:
1.1)将氧化石墨烯、表面活性剂P123和/或F127,超声分散到溶剂中;
1.2)将可溶性铁盐和可溶性有机盐加入到上述溶液中,充分搅拌均匀后得到;
所述的溶剂为乙二醇、乙醇和水中的至少一种;
所述的可溶性铁盐为氯化铁、硝酸铁、硫酸铁中的一种或几种混合;
所述的可溶性有机盐为乙酸钠和/或乙酸钾。
6.一种根据上述任一权利要求中所述的生物传感器的四环素检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将生物传感器在不同浓度待检测四环素溶液中孵育清洗;
2)以四环素核酸适配体修饰电极作为工作电极,碳电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,组成三电极体系;
3)将三电极体系置于含有1.0mmol/L硫堇的0.1mol/L、pH6.0醋酸盐缓冲液中,采用差分脉冲伏安法检测生物传感器在四环素溶液中孵育前后电化学信号的变化,即实现四环素的检测。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征是,所述的差分脉冲伏安法中,电位设置为–0.5V到–0.1V,脉冲宽度为0.05V,扫描速率为0.5s。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510695672.3A CN105223262A (zh) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | 基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510695672.3A CN105223262A (zh) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | 基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105223262A true CN105223262A (zh) | 2016-01-06 |
Family
ID=54992334
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510695672.3A Pending CN105223262A (zh) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | 基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105223262A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106706528A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-05-24 | 西安交通大学 | 一种基于核酸适配体的四环素比色检测法 |
CN106841335A (zh) * | 2016-09-21 | 2017-06-13 | 青岛农业大学 | 一种抗生素自供能适配体传感器的制备方法 |
CN107976475A (zh) * | 2016-10-25 | 2018-05-01 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种于磁场诱导的固体接触传导层及固态离子选择性电极 |
CN114950498A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-08-30 | 江苏农林职业技术学院 | 一种可循环利用的高效光催化材料及其制备方法和应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102533216A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-04 | 合肥希创电子科技有限公司 | 一种空心半球结构四氧化三铁/还原氧化石墨烯复合吸波材料及制备方法 |
CN102749442A (zh) * | 2012-07-26 | 2012-10-24 | 济南大学 | 银杂化介孔四氧化三铁抗生素免疫传感器制备方法及应用 |
CN104931553A (zh) * | 2015-06-11 | 2015-09-23 | 山东理工大学 | 一种基于丝网印刷电极的四环素适配体传感器制备及检测方法 |
-
2015
- 2015-10-23 CN CN201510695672.3A patent/CN105223262A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102533216A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-07-04 | 合肥希创电子科技有限公司 | 一种空心半球结构四氧化三铁/还原氧化石墨烯复合吸波材料及制备方法 |
CN102749442A (zh) * | 2012-07-26 | 2012-10-24 | 济南大学 | 银杂化介孔四氧化三铁抗生素免疫传感器制备方法及应用 |
CN104931553A (zh) * | 2015-06-11 | 2015-09-23 | 山东理工大学 | 一种基于丝网印刷电极的四环素适配体传感器制备及检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
HAZHIR TEYMOURIAN ET AL.: "A High Performance Electrochemical Biosensing Platform for Glucose Detection and IgE Aptasensing Based on Fe3O4/Reduced Graphene Oxide Nanocomposite", 《ELECTROANALYSIS》 * |
JAVED H. NIAZI ETAL.: "Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 * |
肖福兵等: "基于石墨烯-海藻酸钠复合材料的辣根过氧化物酶传感器研究", 《化学传感器》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106841335A (zh) * | 2016-09-21 | 2017-06-13 | 青岛农业大学 | 一种抗生素自供能适配体传感器的制备方法 |
CN106841335B (zh) * | 2016-09-21 | 2019-04-30 | 青岛农业大学 | 一种抗生素自供能适配体传感器的制备方法 |
CN107976475A (zh) * | 2016-10-25 | 2018-05-01 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种于磁场诱导的固体接触传导层及固态离子选择性电极 |
CN106706528A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-05-24 | 西安交通大学 | 一种基于核酸适配体的四环素比色检测法 |
CN114950498A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-08-30 | 江苏农林职业技术学院 | 一种可循环利用的高效光催化材料及其制备方法和应用 |
CN114950498B (zh) * | 2022-05-16 | 2023-12-22 | 江苏农林职业技术学院 | 一种可循环利用的高效光催化材料及其制备方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | Enhanced catalytic and dopamine sensing properties of electrochemically reduced conducting polymer nanocomposite doped with pure graphene oxide | |
Lin et al. | Simultaneous determination for toxic ractopamine and salbutamol in pork sample using hybrid carbon nanotubes | |
Gokoglan et al. | Paper based glucose biosensor using graphene modified with a conducting polymer and gold nanoparticles | |
CN105223262A (zh) | 基于核酸适配体特异性检测四环素的生物传感器及其制备方法 | |
Marco et al. | Development and application of an electrochemical biosensor based on carbon paste and silica modified with niobium oxide, alumina and DNA (SiO2/Al2O3/Nb2O5/DNA) for amitriptyline determination | |
CN101832965B (zh) | 基于磁性碳纳米管和壳聚糖/二氧化硅凝胶的漆酶生物传感器及其制备方法和应用 | |
Chang et al. | Carboxymethyl cellulose assisted preparation of water-processable halloysite nanotubular composites with carboxyl-functionalized multi-carbon nanotubes for simultaneous voltammetric detection of uric acid, guanine and adenine in biological samples | |
CN102353712B (zh) | 一种用于检测尿酸的修饰电极的制备与测定方法 | |
CN103308574A (zh) | 一种碳纳米管-石墨烯复合膜修饰的电化学传感器及其制备方法和应用 | |
CN101793862B (zh) | 一种l-半胱氨酸/壳聚糖修饰的电化学传感器及其应用 | |
CN102680549B (zh) | 一种基于电化学hairpin DNA生物传感器的9-羟基芴测定方法 | |
Adane et al. | Highly sensitive and selective electrochemical sensor for the simultaneous determination of tinidazole and chloramphenicol in food samples (egg, honey and milk) | |
CN106568820B (zh) | 基于dna信号放大技术合成银纳米簇的电化学生物传感器的制备方法及其应用 | |
Aliabadi et al. | A novel electrochemical sensor for determination of morphine in a sub-microliter of human urine sample | |
CN102866188A (zh) | 一种硫化钼-石墨烯电化学传感器及其制备方法与应用 | |
Chen et al. | Nitrofuran determination in aquaculture water by using poly-alizarin red-modified electrode | |
Lian et al. | Determination of oxytetracycline with a gold electrode modified by chitosan-multiwalled carbon nanotube multilayer films and gold nanoparticles | |
CN102565174A (zh) | 离子液体聚苯胺修饰电极-电化学分析系统 | |
CN101281158B (zh) | 一种水滑石纳米片修饰的dna敏感电极及其制备方法 | |
Shi et al. | Ultra-sensitive aptasensor based on IL and Fe3O4 nanoparticles for tetracycline detection | |
Pan et al. | Developing a generally applicable electrochemical sensor for detecting macrolides in water with thiophene-based molecularly imprinted polymers | |
CN103901020A (zh) | 以电化学发光生物传感器检测dna甲基转移酶的方法及应用 | |
CN105067694A (zh) | 用于快速检测阪崎肠杆菌的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法 | |
CN100339703C (zh) | 用于检测黄曲霉毒素及杂色曲霉素的生物传感器电极及其制备方法 | |
CN102830147B (zh) | 一种修饰电极及其在检测微/痕量硝基芳香化合物中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160106 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |