CN103743797A

CN103743797A - 一种利用石墨烯组装多层生物酶传感器提高检测性能的新方法

Info

Publication number: CN103743797A
Application number: CN201410000397.4A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2014-01-02
Filing date: 2014-01-02
Publication date: 2014-04-23

Abstract

本发明的目的是提出一种利用石墨烯组装多层生物酶传感器提高检测性能的新方法，以期利用一种带有大π环端基的试剂芘丁酸，通过与生物酶（以葡萄糖氧化酶为例）表面的氨基基团的酰胺化反应，对其进行改造，得到表面具有大π环端基的葡萄糖氧化酶。改造后的葡萄糖氧化酶利用石墨烯通过层层组装的方法固定在电极的表面，制备出层数可控、灵敏度高的生物酶传感器。通过π-π叠加作用将改性酶与石墨烯进行层层组装，从而解决了层数可控、结构有序、性能稳定的生物传感器组装问题，能大大提高此生物酶传感器的检测灵敏度和检测范围。

Description

一种利用石墨烯组装多层生物酶传感器提高检测性能的新方法

技术领域

该方法涉及一种新型生物酶生物传感器的制备方法，我们通过生物酶表面的氨基基团，把一种带有大π环端基的试剂芘丁酸连接在其表面使之被改造。改造后的生物酶（如葡萄糖氧化酶）利用石墨烯通过层层组装的方法固定在电极的表面，制备出层数可控、灵敏度高的生物酶传感器，属于电化学分析研究领域。

背景技术

生物酶传感器是一类特殊的化学传感器，它是以生物酶作为生物敏感基元，通过各种物理、化学型信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将反应程度用离散或连续的电信号表达出来，是一种对被测目标具有高度选择性的检测器。与传统测试分析方法相比，生物酶传感器的主要特点是：选择性好，能够直接对复杂样品进行测定，响应速度快，灵敏度高，体积小，可实现在线监测。由于其具有高度的特异性、灵敏性等特点，生物酶传感器广泛应用于环境监测、食品分析、生物医学、军事等领域。

现阶段，国内外有大量关于生物酶传感器的研究，但是生物酶传感器的实际应用还具有很多可以改进的方面，比如生物酶传感器的制备方法复杂、酶的活性受环境条件影响很大，因此其贮存和使用都会受到不同程度的限制。目前国内外组装生物酶传感器的方法很多,主要是将特定的生物酶或改性生物酶分子固定在高分子材料、纳米材料和有序的阵列结构单元等载体上，从而组装各式各样的生物酶传感器。

石墨烯是一种新型的排列得像蜂窝状的单层芳香碳原子片状纳米材料。因其具有原子级的厚度、优异的导电性能、巨大的比表面积(2630 m²/g)、出色的电化学和热力学稳定性，在超级计算机、超硬超轻材料、电池电极材料、柔性导电材料、催化剂载体材料、纳米电子器件、光子传感器、晶体管和医学等领域具有广阔的应用前景。石墨烯是目前已知导电性能最好的材料，10纳米以下的石墨烯的导电性仍然十分稳定。石墨烯是一种理想的生物酶载体材料。生物酶是由活细胞产生的具有催化作用的有机物，大部分为蛋白质，而蛋白质是由氨基酸组成的，因此每个生物酶分子上都会有若干氨基，其中有些分布在酶的表面, 可用于对生物酶的改性。

我们利用用石墨烯作为载体材料，用芘丁酸通过酯化反应在温和的反应条件下对酶进行改造，使酶表面具有大π环的基团，然后通过π-π叠加作用将生物酶和石墨烯组装成层数可控、灵敏度高的生物酶传感器。用石墨烯作为生物酶的层间媒介有利于增强酶与电极之间的电子传递，使所组装的生物传感器具有响应速度快，灵敏度高等特点。本方法将会极大地丰富生物传感器的制备方法，并能解决生物传感器存在的测量范围小、灵敏度低、响应慢和不稳定等关键技术问题，将会有力的推进先进生物酶传感器的研发。

发明内容：

本发明的目的是提出一种利用石墨烯组装多层生物酶传感器提高检测性能的新方法，以期利用一种带有大π环端基的试剂芘丁酸，通过与生物酶（以葡萄糖氧化酶为例）表面的氨基基团的酰胺化反应，对其进行改造，得到表面具有大π环端基的葡萄糖氧化酶。改造后的葡萄糖氧化酶利用石墨烯材料通过层层组装的方法固定在电极的表面，制备出层数可控、灵敏度高的生物酶传感器。通过π-π叠加作用将改性酶与石墨烯进行层层组装，从而解决了层数可控、结构有序、性能稳定的生物传感器组装问题，能大大提高此葡萄糖氧化酶电极的检测灵敏度和检测范围。

发明是通过下述方式实现的，包括下列步骤：

（1）利用石墨烯作为载体材料，用芘丁酸通过酯化反应在温和的反应条件下对生物酶（以葡萄糖氧化酶为例）进行改造，使酶表面具有大π环的基团，然后通过π-π叠加作用将生物酶和石墨烯组装成的方法组装成层数可控、灵敏度高的生物酶传感器。（附图1）

（2）不同层数葡萄糖氧化酶传感器检测性能测定：通过电化学工作站的循环伏安法，对其检测性能进行测定。分别制备1,2,3,4层的葡萄糖氧化酶传感器，配制50 mM/L 的葡萄糖溶液，将组装的不同层数的生物酶电极浸泡在溶液中，利用循环伏安法扫描，得到不同层数的生物酶传感器的检测能力。（附图2）

（3）葡萄铜氧化酶传感器检测灵敏度及检测范围的测定：通过电化学工作站的循环伏安法，对其检测性能进行测定。制备3层的葡萄糖氧化酶传感器，配制浓度分别为1, 10, 20, 30, 50, 80, 100 mM/L的葡萄糖溶液，利用组装的传感器分别测试不同浓度的葡萄糖溶液的循环伏安曲线，并分析其灵敏度和线性检测范围。（附图3）

附图说明：

图1是用芘丁酸改性生物酶和石墨烯通过自组装的方法制备生物传感器的示意图；

图2是不同层数（A，B，C，D分别是1, 2, 3, 4层）的氧化酶的改性电极在相同葡萄糖浓度溶液中的循环伏安曲线图；

图3（a）三层葡萄糖氧化酶改性的传感器分别测试不同浓度葡萄糖溶液（A-G分别为1, 10, 20, 30, 50, 80, 100 mM/L）的循环伏安曲线图；

图3（b）是三层葡萄糖氧化酶改性的传感器分别测试不同浓度葡萄糖溶液的循环伏安峰电流对葡萄糖溶液的线性拟合图。

具体实施方式：

实施例1. （1）用芘丁酸对生物酶（以葡萄糖氧化酶为例）进行改造，使其表面带有大π环端基：取葡萄糖氧化酶5 mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）10 mg，N-羟基丁二酰亚胺（NHS）2 mg溶于9.5 mL pH=7.4的磷酸缓冲溶液中。取2 mg 芘丁酸溶于1 mL N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)中。将 0.5 mL芘丁酸溶液缓慢的滴加到上葡萄糖氧化酶溶液中，室温下搅拌10 小时，反应结束后，通过在磷酸缓冲溶液中透析去除未反应的小分子，得到芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶。

（2）石墨烯的制备：石墨粉的氧化：将2 g 石墨粉，1 g过硫酸钾， 1 g 五氧化二磷加入到 3 ml 浓硫酸中， 6小时后得到深蓝色液体。用蒸馏水稀释，过滤，洗涤，并干燥。取预氧化的石墨2 g，加入 0 ℃的浓硫酸 46 mL，并逐渐加入 6 g 高锰酸钾，此过程中体系温度需在 20 ℃ 以下。得到的混合溶液在35 ℃下搅拌2 小时，最后加入92 mL 蒸馏水， 15 min 后加入280 mL 蒸馏水和 5 mL 30% 的双氧水结束反应。混合液用500 mL 10%的盐酸洗涤，然后干燥得到氧化石墨烯。氧化石墨烯 0.1 g 溶解到200 mL蒸馏水中，调节pH=9，加入1 mL水合肼，95℃ 还原2小时得到石墨烯溶液，然后洗涤，并重新确定石墨烯溶液的浓度。

（3）葡萄糖氧化酶传感器的组装：直接将玻碳电极浸泡到0.1 mg/ mL的石墨烯溶液中，用石墨烯纳米材料去修饰玻碳电极的表面。然后将石墨烯修饰的玻碳电极浸泡到芘丁酸改名的葡萄糖氧化酶溶液中，通过芘端基与石墨烯之间的π-π叠加作用，将芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶固定到石墨烯修饰的电极表面。然后经过这种逐步层层组装的方式来获得不同层数、不同活性与灵敏度的葡萄糖氧化酶传感器。并对葡萄糖溶液进行测试，分析传感器的性能。

Claims

1.一种利用石墨烯组装多层生物酶传感器提高检测性能的新方法，其主要特征在于：

（1）用芘丁酸对生物酶进行改造（以葡萄糖氧化酶为例），使其表面带有大π环端基：取葡萄糖氧化酶5mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）10 mg，N-羟基丁二酰亚胺（NHS）2 mg溶于9.5 mL pH=7.4的磷酸缓冲溶液中；取2 mg 芘丁酸溶于1 mL N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)中；将 0.5 mL芘丁酸溶液缓慢的滴加到上葡萄糖氧化酶溶液中，室温下搅拌10 小时，反应结束后，在磷酸缓冲溶液中用截留分子量8千的透析袋透析去除未反应的小分子，得到芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶；

（2）葡萄糖氧化酶传感器的组装：直接将玻碳电极浸泡到0.1 mg/ mL的常规的石墨烯分散液中，用石墨烯去修饰玻碳电极的表面；然后将石墨烯修饰的玻碳电极浸泡到芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶溶液中，通过芘端基与石墨烯之间的π-π叠加作用，将芘丁酸改性的葡萄糖氧化酶固定到石墨烯修饰的电极表面；然后重复上述步骤，经过这种逐步层层组装的方式来获得不同葡萄糖氧化酶和石墨烯层数、灵敏度可控的葡萄糖氧化酶传感器。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中用芘丁酸改性葡萄糖氧化酶使其表面带有大π环端基；然后通过π-π叠加作用将改性酶连接到石墨烯表面，从而解决了葡萄糖氧化酶和石墨烯难以稳定组装的难题。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中经过这种逐步层层组装的方式来获得不同层数、灵敏度可控的葡萄糖氧化酶传感器。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：一般生物酶的表面大都会有数个氨基，通过这些氨基用1所述的方法进行改造，使其表面带有大π环基团，然后用石墨烯组装其它层数和灵敏度可控的生物酶传感器。