CN104020200B - 一种测定三聚氰胺的电化学方法 - Google Patents
一种测定三聚氰胺的电化学方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种测定三聚氰胺的电化学方法，其特征是用富含胸腺嘧啶(T)的巯基DNA修饰金电极，以富含胸腺嘧啶的DNA和二茂铁修饰的金纳米粒子(Au-Fc-DNA2)为探针，在目标物三聚氰胺存在时，Au-Fc-DNA2与金电极表面的DNA作用，然后通过电化学检测得电化学信号，根据电化学信号实现三聚氰胺的测定。该方法具有高灵敏度，高选择性，低成本，操作简单等特点。
Description
技术领域
本发明属于电化学技术领域，以金纳米粒子为标记物和二茂铁作为信号分子对三聚氰胺含量进行检测。具体涉及一种测定三聚氰胺的电化学方法。
背景技术
食品工业上普遍采用的、被定为国家标准的是凯氏定氮法。原理是：蛋白质含有氮元素，用强酸处理样品，让蛋白质中的氮元素释放出来，测定氮的含量，就可以算出蛋白质的含量。所以凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量，而是通过测氮含量来推算蛋白质含量，显然，如果样品中还有其它含有氮的化合物，这个方法就不准确了。在通常情况下食物的主要成分中只有蛋白质含有氮，其它主要成分(如碳水化合物、脂肪)都不含氮，因此凯氏定氮法是一种很准确的测定蛋白质含量的方法。但是如果样品中有其它含氮物质，通过凯氏定氮法测得的蛋白质含量就会不准确。三聚氰胺(Melamine)是一种化工原料，由于其含氮量高(66.6％)且价格低廉，因此三聚氰胺经常被不法商家添加到食品中，从而提升食品检测中的蛋白质含量指标。但是三聚氰胺是一种有毒的物质，若人体长期摄入三聚氰胺则会造成生殖、泌尿系统的损害，使膀胱、肾部产生结石，并可进一步诱发膀胱癌。
目前发展的三聚氰胺检测方法包括：酶联免疫法(ChoiJH,KimYT,LeeJH.Rapidquantificationofmelamineinmilkusingcompetitive1,1'-oxalyldiimidazolechemiluminescentenzymeimmunoassay.Analyst,2010,135(9):2445)，液相色谱法(KarbiwnykCM,AndersenWC,TurnipseedSB.Determinationofcyanuricacidresiduesincatfish,trout,tilapia,salmonandshrimpbyliquidchromatography-tandemmassspectrometry.AnalyticaChimicaActa,2009,637(1-2):101)，气相色谱法(LiJ,QiHY,ShiYP.Determinationofmelamineresiduesinmilkproductsbyzirconiahollowfibersorptivemicroextractionandgaschromatography-massspectrometry.JournalofChromatographyA,2009,1216:1873)，质谱(HuangGM,OuyangZ,CooksRG.High-throughputtracemelamineanalysisincomplexmixtures.ChemicalCommunications,2009,(5):556)和表面增强拉曼光谱法(HuHB,WangZH,PanL.Ag-coatedFe3O4SiO2three-plycompositemicrospheres:synthesis,characterization,andapplicationindetectingmelaminewiththeirsurface-enhancedramanscattering.TheJournalofPhysicalChemistryC,2010,114(17):7738)。最近，电化学方法也被用来对三聚氰胺进行检测(XuQ,WeiHP,DuS,LiHB,JiZP,HuXY.Detectionofsubnanomolarmelaminebasedonelectrochemicalaccumulationcoupledwithenzymecolorimetricassay.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2013,61:1810；LiaoCW,ChenYR,ChangJL,ZenJM.Single-runelectrochemicaldeterminationofmelamineindairyproductsandpetfoods.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2011,59:9782；LiaoCW,ChenYR,ChangJL,ZenJM.ASensitiveelectrochemicalapproachformelaminedetectionusingadisposablescreenprintedcarbonelectrode.Electroanalysis,2011,23:573；ZhangMX,HuJB.IndiumtinoxideelectrodemodifiedbyaNH2 +ionimplantationtechniquefordeterminationofmelamine.Electroanalysis,2013,25:780；赵畅,余波,陈振兴,晋冠平.类分子印迹纳米多孔膜修饰电极制备三聚氰胺电化学传感器.食品科学,2012,33:214)。
但是，这些方法各有其缺点。本发明利用三聚氰胺与胸腺嘧啶之间的特异性结合，以富含胸腺嘧啶的DNA探针作为敏感元件，结合DNA和二茂铁(Fc)修饰的金纳米粒子放大技术，建立了一种对三聚氰胺进行高灵敏度特异性检测的电化学方法，方法具有简单，成本低，灵敏度高的特点。
发明内容
本发明提供一种特异性检测三聚氰胺含量的方法，利用二茂铁作为信号分子和三聚氰胺与胸腺嘧啶之间的特异性结合，以金纳米粒子，二茂铁和DNA结合物作为探针，用电化学检测法实现了对三聚氰胺含量的测定。
技术方案
一种测定三聚氰胺的电化学方法，以二茂铁作为信号分子，以金纳米粒子和DNA结合物作为探针，利用三聚氰胺与胸腺嘧啶之间的特异性结合，以电化学检测法测定三取氰胺含量。测定步骤如下：
(1)金纳米粒子的制备：制备、储存金纳米粒子溶液所用的玻璃容器用王水(浓盐酸和浓硝酸体积比例为1:3)泡洗30min，然后用二次蒸馏水冲洗干净，烘干备用；移取100mL0.01％HAuCl4溶液于烧杯中，在剧烈搅拌下，加热至沸后，快速加入3mL新配制的1％柠檬酸三钠溶液，连续煮沸，待溶液颜色由深蓝变为红色，即可得到红色的金纳米粒子(Au)溶液。当金纳米粒子溶液冷却至室温后稀释到100mL，摇匀，置于4℃冰箱中保存。
(2)金纳米粒子探针的制备
a将1mgFc-COOH(二茂铁羧酸简称二茂铁，Fc)加入到2mL0.1MNHS和0.1MEDC的磷酸缓冲溶液溶液中，将此混合溶液在室温下剧烈搅拌反应2h。
b取2mL的样品管，依次加入10μL，10-4M的巯基乙胺(Mercaptamine)，1mL金纳米粒子溶液，然后在室温下反应12h。
c将a和b所得溶液混合加入DNA2，室温下反应24h，即得金纳米粒子探针(Au-Fc-DNA2)。最后将洗涤后的Au-Fc-DNA2复合物分散在磷酸缓冲溶液中置于4℃冰箱中保存备用。
(3)金电极(Goldelectrode)的处理：首先将金电极在麂皮上分别用1.0μm，0.3μm，0.05μm氧化铝粉抛光，依次用蒸馏水，乙醇和蒸馏水分别超声5min，最后在0.1MH2SO4溶液中进行循环伏安扫描直至电流电压曲线稳定；在洁净的金电极表面滴加2μMDNA1，在25℃下组装120min。修饰了DNA1的金电极表面经充分洗净后，用高纯氮气吹干。然后将金电极浸入1mM巯基己醇中，25℃下封闭60min。充分洗净后，用高纯氮气吹干备用。
(4)三聚氰胺的测定：将10.0μL不同浓度的三聚氰胺标准溶液或样品溶液和10.0μLAu-Fc-DNA2复合物溶液滴加到修饰了DNA1的金电极表面，在室温下反应60min。然后，用磷酸缓冲溶液反复冲洗电极表面，除去未结合的三聚氰胺和Au-Fc-DNA2复合物。以上述所得电极为工作电极，利用差分脉冲伏安法(DPV)在磷酸缓冲溶液中以100mV/s的扫速进行扫描，电位扫描范围为-0.7～0.1V。根据电化学信号对三聚氰胺进行定量。
本发明所有试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
本发明所使用的磷酸缓冲溶液为10mMpH7.3，其配制方法：称取0.0408gKH2PO4，0.2507gNa2HPO4·12H2O，1.7532gNaCl，溶解于约80mL水中，用HCl调节pH值至7.3，加水定容至100mL，摇匀。
本发明的电化学工作站选用CHI750B型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。
本发明的离心机选用Microfuge22R台式离心机(Beckman公司，美国)。
本发明的pH测量选用PHS-3D型酸度计(上海雷磁仪器厂)。
本发明的显著效果
本发明研究了不同浓度的三聚氰胺与电化学信号之间的关系，得到了检测三聚氰胺的标准曲线，线性范围及线性方程。
当三聚氰胺的浓度在0.3ngmL-1-700ngmL-1之间时，随着三聚氰胺浓度的变化，DPV强度有明显变化。经计算得到检测三聚氰胺的线性方程为Ipa＝54.45C-302.8(Ipa为DPV峰电流强度，单位nA；C为三聚氰胺的浓度，单位ngmL-1；R2＝0.9993,n＝7)。检测限是0.1ngmL-1(3σ)。
该测定方法的精密度通过对浓度为3ngmL-1的三聚氰胺进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差分别为4.2％，表明本发明的测定方法有较好的重现性。
考察了食品中常含有的离子、氨基酸、维生素等成分对该方法测定三聚氰胺的选择性。实验结果表明，当三聚氰胺的浓度为30ngmL-1时，误差在5％的范围内1000倍的K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、NH4 +、Ba2+、Zn2+、Cl-、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、CO3 2-、C2O4 -、葡萄糖、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、维生素B2和维生素C；500倍的Fe2+、抗坏血酸、腺嘌呤、鸟嘌呤,尿酸、ATP、甲硫氨酸、半胱氨酸；100倍的Cd2+、Sn2+和Pb2+均不干扰该方法对三聚氰胺的响应。表明方法具有高的选择性，本方法具有应用到真实样品检测的可行性。
附图说明
图1.三聚氰胺测定原理图。
图2.三聚氰胺标准曲线图。横坐标是三聚氰胺浓度，单位是ngmL-1，纵坐标Ipa为DPV峰电流强度。
具体实施方法
按照技术方案的步骤(1)至(4)得到三聚氰胺标准曲线见图2，其中氯金酸(HAuCl4·4H2O)和二水合柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·H2O)均购自国药集团化学试剂有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亚胺(EDC)、二茂铁羧酸购自Fluka公司；巯基己醇和巯基乙胺(2-aminoethanethiol)购自Sigma公司。
所用人工合成DNA序列从北京赛百盛生物工程有限公司购得。
优选的，所述DNA1序列为：5’-HS-CCGCTGCCGGTTTTGGTTCGG-3’。
优选的，所述DNA2序列为：5’-CCGTTCCTTTTCCGG-HS-3’。
根据发明的方法对牛奶样品中三聚氰胺含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为96.0–102.6％，测定结果见表1，本发明的方法在三聚氰胺检测中具有精密度高的特点。
表1牛奶样品中三聚氰胺的测定结果。
| 编号 | 含量a,b | 加入量 | 测得量 | 回收率(％) |
| 1 | NDc | 1.00 | 0.96 | 96.0 |
| 2 | ND | 5.00 | 5.11 | 102.2 |
| 3 | ND | 50.00 | 51.08 | 102.6 |
a7次测量结果
b单位：ngmL-1
cND：未检出。
Claims (6)
1.一种测定三聚氰胺的电化学方法，其特征在于用金纳米粒子为标记物，以二茂铁作为信号分子，实现三聚氰胺测定，测定步骤如下：
(1)金纳米粒子的制备：制备、储存金纳米粒子溶液所用的玻璃容器用王水泡洗30min，然后用二次蒸馏水冲洗干净，烘干备用；移取100mL0.01％HAuCl4溶液于烧杯中，在剧烈搅拌下，加热至沸后，快速加入3mL新配制的1％柠檬酸三钠溶液，连续煮沸，待溶液颜色由深蓝变为红色，即可得到红色的金纳米粒子AuNPs溶液，当金纳米粒子溶液冷却至室温后稀释到100mL，摇匀，置于4℃冰箱中保存；
(2)金纳米粒子探针的制备
a将1mgFc-COOH加入到2mL0.10mol/LNHS和0.10mol/LEDC的磷酸缓冲溶液溶液中，将此混合溶液在室温下剧烈搅拌反应2h；
b取2mL的样品管，依次加入10μL，10-4M的巯基乙胺，1mL金纳米粒子溶液，然后在室温下反应12h；
c将a和b所得溶液混合加入DNA2，室温下反应24h，即得金纳米粒子探针Au-Fc-DNA2；最后将洗涤后的Au-Fc-DNA2复合物分散在磷酸缓冲溶液中置于4℃冰箱中保存备用；
(3)金电极的处理：首先将金电极浸泡在Piranha溶液中15min然后在麂皮上分别用1.0μm，0.3μm，0.05μm氧化铝粉抛光，依次用蒸馏水，乙醇和蒸馏水分别超声5min，最后在0.1MH2SO4溶液中进行循环伏安扫描直至电流电压曲线稳定；在洁净的金电极表面滴加2μMDNA1，在25℃下组装120min，修饰了DNA1的金电极表面经充分洗净后，用高纯氮气吹干，然后将金电极浸入1mM巯基己醇中，25℃下封闭60min，充分洗净后，用高纯氮气吹干备用；
(4)三聚氰胺的测定：将10.0μL不同浓度的三聚氰胺标准溶液或样品溶液和10.0μLAu-Fc-DNA2复合物溶液滴加到修饰了DNA1的金电极表面，在室温下反应60min，然后，用磷酸缓冲溶液反复冲洗电极表面，除去未结合的三聚氰胺和Au-Fc-DNA2复合物，以上述所得电极为工作电极，利用差分脉冲伏安法DPV在磷酸缓冲溶液中以100mV/s的扫速进行扫描，电位扫描范围为-0.7～0.1V，根据电化学信号对三聚氰胺进行定量，根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线；
(5)样品分析，取牛奶样品中样品，按步骤(4)方法进行实验，根据电化学信号和步骤(4)所得标准曲线可以获取三聚氰胺含量；
其中，所述的DNA1序列部分为5’-HS-CCGCTGCCGGTTTTGGTTCGG-3’；
其中，所述的DNA2序列部分为5’-CCGTTCCTTTTCCGG-HS-3’。
2.根据权利要求1的三聚氰胺测定的方法，其特征在于所述化学试剂为分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配置。
3.根据权利要求1的三聚氰胺测定的方法，其特征在于所述磷酸缓冲液为10mMpH7.3的配制方法：称取0.0408gKH2PO4，0.2507gNa2HPO4·12H2O，1.7532gNaCl，溶解于约80mL水中，用HCl调节pH值至7.3，加水定容至100mL，摇匀。
4.根据权利要求1的三聚氰胺测定的方法，其特征在于所述电化测定选用CHI750B型电化学工作站，购自于上海辰华仪器有限公司。
5.根据权利要求1的三聚氰胺测定的方法，其特征在于所述离心机选用Microfuge22R台式离心机，购自于美国Beckman公司。
6.根据权利要求1的三聚氰胺测定的方法，其特征在于所述pH测量选用PHS-3D型酸度计，购自于上海雷磁仪器厂。
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