CN116794287B - 一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器及其制备方法和应用,本发明属于肠癌诊断技术领域。本发明提供的一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器的制备方法,是将金片依次进行表面自主装单分子层修饰和适配体修饰得到。经验证本发明制备的粪便隐血传感器具有极其抗垢的表面可以直接对粪便进行检测,极高的灵敏度和检测范围可以直接做到定量的分析,且具有很高的准确率,保证了临床上直肠癌和结肠癌的早筛早检的安全,高效和准确。
Description
技术领域
本发明涉及肠癌诊断技术领域,尤其涉及一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器及其制备方法和应用。
背景技术
结直肠癌是全球高发癌症,其发病人数、死亡人数、标化发病率(standardizedincidence rate,SIR)、标化死亡率(standardizedmortalityrate,SMR)在各癌种中均处于高位(前5位)。绝大部分结直肠癌病例(约70%)为散发性,生活方式、饮食习惯(饮酒)、肠道炎症、肥胖等是其常见的影响因素。全球不同国家结直肠癌发病、死亡情况差异明显,在先进医疗技术和资源有限的情况下,普及早筛、早诊、早治等理念及加强结直肠癌筛查是提高经济落后国家或地区结直肠癌生存率的重要策略。
粪便隐血试验(FOBT)是一种简便易行、经济、无痛苦的筛查大肠癌的方法,可发现早期大肠癌及癌前病变,操作简单、成本低廉、有效、结果回报快、节省人力物力,适合大规模人群筛查,是国内外指南推荐的大肠癌筛查的首选方法。但是现有的化学法粪便隐血试验(gFOBT)和免疫法粪便隐血实验(IFOBT)的灵敏度相对较低,且容易出现假阳性和假阴性的情况。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种具有高抗垢性能的表面的高性能传感器专门用于粪便隐血实验,来进行大肠癌(直肠癌和结肠癌)的早期筛查。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器的制备方法,将金片依次进行表面自主装单分子层修饰和适配体修饰,得到高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器。
优选的,所述表面自主装单分子层修饰是将所述金片置于6-巯基-1-己醇和MOA乳化剂的混合溶液中进行浸泡修饰。
优选的,所述混合溶液中,6-巯基-1-己醇和MOA乳化剂的物质的量浓度比为4~6:1。
优选的,所述浸泡修饰的温度为20~25℃,时间为12~14h。
优选的,所述适配体修饰是将表面自主装单分子层修饰后的金片置于适配体溶液中进行修饰。
优选的,所述适配体溶液是在EDC和NHS的混合溶液中加入适配体配置得到;所述混合溶液中EDC和NHS的物质的量浓度比为1:1~1.2。
优选的,所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述适配体在EDC和NHS的混合溶液中的浓度为1~2OD。
优选的,所述适配体修饰的温度为20~25℃,时间为3~4h。
本发明还提供了一种按照所述的制备方法得到的高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器。
本发明还提供了一种所述的粪便隐血传感器在制备诊断大肠癌的检测产品中的应用。
本发明利用自主装单分子层技术和DNA适配体接枝技术,在金片上依次进行表面自主装单分子层修饰和适配体修饰,得到了一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器。
其原理是:表面自主装单分子层修饰中的MOA和MCH会因为金硫键的形成而牢牢附着在金膜表面,由于表面自主装单分子层修饰后的表面存在大量的-COOH,因此,在之后的适配体修饰中能够与适配体DNA上的-NH基团发生酰胺反应,所以适配体会被牢牢的抓在芯片表面。本发明使用的适配体为专门抓取HB(血红蛋白)的适配体,从而实现对粪便隐血中血红蛋白的抓取。此外,混入MCH的目的还是为了引入短链的-OH基团,短链可以填补长链间的空隙保证长链能够均一、竖直的生长,提高SAM改性的成功率和改性效果,另外-OH基团可以中和未被DNA接枝的-COOH基团保证界面的电中性。
经验证本发明制备的粪便隐血传感器具有极其抗垢的表面可以直接对粪便进行检测,极高的灵敏度和检测范围可以直接做到定量的分析,且具有很高的准确率,保证了临床上直肠癌和结肠癌的早筛早检的安全,高效和准确。
附图说明
图1为实施例1中制备粪便隐血传感器过程中表面自主装单分子层与适配体的修饰过程示意图。
图2为实施例2中不同样品溶液的SPR反应。
图3为实施例3中通入不同浓度的Hb溶液的SPR共振角变化。
图4为实施例3中SPR共振角和Hb浓度的线性关系(图中小图为大图前端的放大图,横纵坐标与大图一致)。
图5为实施例4中得到的SPR共振角变化图。
图6为实施例4中不同浓度的粪便潜血溶液对应的SPR共振角变化值。
图7为实施例4中对前6组数据进行线性拟合的结果。
图8为实施例4中的系统的准确性测试散点图。
图9为实施例5中不同方法进行粪便隐血实验的准确率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
粪便隐血传感器的制备(制备示意图如图1所示)。
首先将洗干净的金片放入配置好的MCH(6-巯基-1-己醇):MOA乳化剂物质的量浓度为5:1的溶液中在20-25℃的常温下浸泡13小时,在此过程中,MOA和MCH会因为金硫键的形成而牢牢附着在金片表面。然后取出金片清洗干净后再放入EDC:NHS物质的量浓度为1:1的溶解有适配体(序列为5′-GGC AGG AAG ACA AAC ACC AGG TGA GGG AGA CGA CGC GAGTGT TAG ATG GTA GCT GTT GGT CTG TGG TGC TGT-3′,如SEQ ID NO:1所示)的溶液中,其中适配体的浓度为1od(测定波长570nm,校正波长630nm)。在20-25℃的常温下修饰3h,取出清洗干净得到粪便隐血传感器。
实施例2
对实施例1制备的SPR芯片进行抗垢性能检测。
为了避免传感器本身在镀膜工艺和改性中产生的微小差异,我们将采用SPR的相对变化值来检测特异性吸附。
分别用下列样品对实施例1制备的传感器进行测试:
浓度为50nM的HB溶液;
浓度为500μM(33.5mg/ml)的BSA溶液(是Hb溶液浓度的10000倍);
浓度为500μM(33.5mg/ml)的HSA溶液(是Hb溶液浓度的10000倍);
25mg/ml的胰蛋白酶溶液;
稀释100倍的血清(血清南美胎牛血清)。
在通入上述样品之前,先用PBS溶液清洗15min,然后分别通入上述样品溶液,反应5min后,再通入PBS溶液进行清洗。测定SPR共振角的相对变化,结果如图2所示。
从图2中可以看出,在通入PBS溶液15min后,可以得到一条稳定的基线,样品溶液通入后(第15~20min),可以发现SPR共振角迅速发生响应,急速上升之后又缓慢下降最后达到平衡,这个过程大约花费5min,然后在第20min时再次通入PBS溶液清洗芯片表面,SPR共振角迅速下降。
对于上升的过程来说,由于其他溶液的浓度远远大于Hb的样品浓度,因此其他溶液的角度变化更大,但是再次通入PBS溶液清洗过后,由于其他非特异性吸附的分子并不能牢固的留在芯片表面,因此会被冲刷掉,SPR共振角也因此会下降到几乎与基线持平。而Hb由于特异性吸附的原因不会被PBS洗掉,会有相当一部分的Hb牢牢吸附在界面上,因此清洗后Hb的SPR平衡曲线是大于基线的。
从图2中还注意到,血清样品在清洗过后的SPR平衡曲线是略微大于基线的,这是由于血清在制备过程中并不能完全的将Hb分离干净,血清中仍然含有少量的Hb的原因,这些Hb也会发生特异性吸附,但是因为Hb的量很少,所以平衡曲线的变化也很轻微。这表明本发明提供的传感器具有极高的灵敏度。
从图2中还可以看到,对于浓度远大于Hb溶液浓度的其他样品溶液,Hb溶液的SPR响应远远超过其他样本溶液(15倍以上),因此我们可以认定本发明提供的传感器对于Hb的特异性良好,具有很强的抗垢能力,可以保证在复杂的环境中对Hb进行精准的吸附,保证Hb痕量分析的可行性。
实施例3
在实施例1制备的传感器中先通入PBS溶液待数据稳定后即可得到PBS的基线,这也是整个实验的基线。然后依次通入1nM,5nM,10nM,25nM,50nM,100nM,250nM浓度的Hb溶液来模拟不同浓度的粪便潜血样本,然后得到SPR共振角随时间的变化曲线。如图3所示。
从图3中可以看出,在每一次更换不同浓度的Hb溶液后,SPR共振角会急速的上升,然后达到一个峰值后缓慢的下降,最后趋于平衡,而最终趋于平衡时的SPR共振角会明显的大于通入Hb溶液之前的SPR共振角。这是由于Hb与适配体的结合是一个吸附-脱附动态平衡的过程。在Hb溶液刚刚通入SPR反应池的时候,由于SPR浓度的增加,会破坏原有的吸附-脱附平衡,导致脱附的速率的大于吸附速率,此时界面上主要发生的为吸附作用,另外本身通入的溶液浓度更大也会使SPR共振角增加,因此此时SPR共振角会急速上升。在这个过程中,吸附速度虽然大于脱附,但是吸附的速度逐渐减慢,脱附的速度也由于浓度的上升逐渐增加,因此在吸附的量达到最大值后,脱附成为发生的主要现象,此时SPR共振角缓慢下降。在这个过程中吸附和脱附的速度都逐渐变缓然后趋于相等,达到一个基于新的样本浓度的平衡,也就是我们所说的吸附-脱附平衡。
由于吸附脱附平衡与物质的浓度有关,因此不同的Hb浓度对应的平衡也不同,浓度越高,吸附的量越大,趋于平稳时的SPR共振角也会越大。我们再将趋于平稳时的SPR共振角和Hb的样本浓度绘图后进行拟合分析,如图4所示。发现Hb浓度和SPR共振角的线性非常好,R2达到了0.9998。证明SPR共振角可以通过界面的吸附现象直观线性的反应的待检测物的浓度。
实施例4
采用含有粪便潜血的真实样本(牙签蘸取一次,样本量大于5mg),使用15,ml0.01M PBS溶液进行稀释,然后使用孔径为0.45μm的针筒过滤器过滤,通入5min PBS待系统稳定后通入处理后的真实样本,五分钟后通入缓冲液进行冲洗,得到如图5所示的SPR共振角变化图。从图中我们可以看到,待SPR共振角稳定后通入待测溶液,SPR共振角立刻快速上升,然后逐渐趋于平缓,再通入缓冲溶液冲洗表面之后,SPR共振角剧烈下降然后保持平衡,最终平衡状态下的共振角高于最初平衡状态下的共振角。图中SPR共振角的猛烈上升由两个原因造成,一是样本中含有血红蛋白与表面的DNA适配体结合,另外本身样本环境复杂,存在许多其他物质吸附在表面。开始冲洗之后猛烈下降是因为粪便样本中除了Hb外的其他物质在表面属于非特异性吸附,会被缓冲液冲洗干净,因此冲洗后表面只存在与适配体牢固结合的Hb,因此最终状态的平衡共振角会高于起始状态,证明系统确实可以在粪便样本中检测痕量Hb。
将不含血红蛋白的粪便样本溶液进行稀释和过滤(处理同上),然后加入不同含量的血红蛋白模拟不同浓度的粪便潜血溶液,通入系统进行测量(操作同上),然后通入缓冲溶液冲洗,记录不同浓度粪便潜血溶液SPR共振角的偏移量,并绘制SPR共振角偏移量与粪便潜血浓度的关系图,如图6所示,从图中我们可以看到,在粪便潜血溶液浓度在1nm~100nm之间其线性度较好,而在100nm以上的高浓度溶液中共振角随着浓度的上升不再有明显的变化,这可能是因为适配体对于血红蛋白的结合已经达到饱和。
因此我们将前6组数据进行拟合,得到如图7所示的拟合曲线,R2为0.97767。说明在1~100nM的浓度范围内,SPR共振角的偏移量与粪便潜血浓度强相关,该系统可以对100nM以下浓度的粪便潜血溶液做定量分析。相对于在PBS缓冲液中配置的标准Hb溶液,线性区间上限的降低可能是由于粪便溶液的环境较为复杂。
从上面的粪便潜血标准溶液检测线中我们可以知道,如果对粪便潜血做定性分析,只需要确定SPR共振角的偏移量大于0.002°即可。因此我们取了共42组未知浓度的粪便潜血真实样本进行定性分析,来检测系统的准确性。得到的散点图如图8所示,从图8中我们可以看到,42组样本中只有一组未被检出,因此该系统准确率为97.6%。
实施例5
为了和市场在售的产品进行对比,我们选择了市面上三种主流的检测方法,分别是免疫金标法,邻联甲苯胺法和匹拉米洞法。其中免疫金标法我们购买了两种,分别是艾博便隐血(FOB)检测试剂(胶体金法)(GICT-1)和深蓝隐血免疫双联检测试剂盒(GICT-2),另外两种检测方法采购于尚宝生物的粪便隐血定性检测试剂盒Pyramidon和Tolidine。每个试剂盒各进行50组实验来计算产品的准确率,对应的准确率如图9所示,从图中我们可以看到,SPR方法取得的准确性远远高于其他方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器的制备方法,其特征在于,将金片依次进行表面自主装单分子层修饰和适配体修饰,得到高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器;
所述表面自主装单分子层修饰是将所述金片置于6-巯基-1-己醇和MOA乳化剂的混合溶液中进行浸泡修饰,所述6-巯基-1-己醇和MOA乳化剂的物质的量浓度比为4~6:1;所述浸泡修饰的温度为20~25℃,时间为12~14h;
所述适配体修饰是将表面自主装单分子层修饰后的金片置于适配体溶液中进行修饰,所述适配体溶液是在EDC和NHS的混合溶液中加入适配体配置得到;所述混合溶液中EDC和NHS的物质的量浓度比为1:1~1.2;所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述适配体在EDC和NHS的混合溶液中的浓度为1~2OD,所述适配体浓度的测定波长570nm,校正波长630nm;所述适配体修饰的温度为20~25℃,时间为3~4h。
2.一种按照权利要求1所述的制备方法得到的高抗垢性高准确率的粪便隐血传感器。
3.一种权利要求2所述的粪便隐血传感器在制备诊断大肠癌的检测产品中的应用。
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