CN1720096A - 表面处理 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了用于在生物传感器表面上制备生物分子单层的方法，包括以下步骤：使生物传感器表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与生物传感器表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；以及然后将该单层与生物分子反应。

Description

表面处理
发明背景
技术领域
本发明一般性地涉及表面处理，并具体涉及通过分子化学吸附(molecular chemisorption)处理表面，例如生物传感器(biosensor)表面的方法和装置。
相关技术
生物传感器阵列的制备通常涉及将生物分子图案化沉积(patterneddeposition)到表面上。灵敏性、再现性和选择性是生物传感器品质的重要方面。灵敏性通常是通过有效捕获目标分子的化学吸附的捕获分子的致密层获得的。再现性通常取决于可高度再现的锚定化学(anchoring chemistry)和捕获分子的良好品质图案。选择性通常取决于目标分子的高度选择性和其它分子的低的非选择性吸附。由于后者占待检测信号的30％，因而限制生物传感器的效用。
生物偶联(Bioconjugation)涉及连接体分子以形成具有各单一组分的组合性质的复合物(complex)。天然和合成化合物以及它们的活化物(activities)可以化学结合，以设计具有所需性能的物质。例如，与复合混合物中的目标分子结合的蛋白质可以与能够被检测的另一分子交联，形成可追踪的偶联物。该检测成分提供了目标成分的可见性，以制备可以在通过各种方法后定位的复合物，或用于测量的复合物。
生物偶联影响了生命科学的众多领域。应用交联反应产生具有特殊活性的新型偶联物使得能够化验用于检测细胞成分和治疗疾病的微量物质。将一个分子与另一个分子化学连接的能力产生了服务于研究、诊断和治疗市场的成长工业。生物检定的一个重要部分现在是通过使用与溶液中、细胞中或组织中的特定分析物相互作用的偶联物进行的。偶联物分子、反应物系统和生物偶联物技术的应用概述于G.T.Hermanson的″BioconiugateTechniques″，Academic Press，San Diego，1996。
用于生物环境中的表面见于分子和细胞生物学技术中，例如在细胞培养、隐形眼镜、植入的假体、导管和用于储存蛋白质的容器中酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Inmmunosorbent Assay，ELISA)用的底物(substrates)。许多这样的表面经过自发吸附而快速涂覆有蛋白质层。某些具有有利的效果。其它是不利的。对于鉴别用于抵抗蛋白质吸附的生物″惰性″材料存在更多的兴趣。用于引入这种抵抗性的常规表面处理法涉及用聚(乙二醇)(PEG)涂覆表面。例如，参见J.M.Harris编辑的Poly(ethylene glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，Plenum，New York，1992。PEG的进一步详细信息，参见Gombotz，W.R.等人的J.Biomed.Matter.Res.15，1547-1562(1991)。可替换的方法涉及牛血清清蛋白的预吸附。然而，该方法存在蛋白质随时间变性或蛋白质与其它分子交换的问题。因此，该方法不适合应用于通过质谱(mass)或伯胺检测蛋白质存在的生物传感器。短链PEG低聚物(n＝2-7)的自组合单层也显示出抵抗蛋白质吸附。例如，参见Mrksich，M.和Whitesides，G.M.，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.25，55-78(1996)。然而，企图吸附的蛋白质会压缩PEG并使PEG去溶剂化。这些作用都是非常不利的。参见，例如Jeon，S.I.和Andrade，J.D.″Protein surfaceinteractions in the presence of polyethylene oxide：effect of Protein size″、J.Coll.Interface Sci.142，159-166(1991)；和Jeon，S.I.，Lee，J.H.，Adrade，J.D.和deGennes，P.G.，″Protein surface interactions in the presence of polyethyleneoxide：simplified theory″，J.Coll.Interface Sci.142，149-158(1991))。
生物传感器表面通常由硼硅酸盐玻璃形成。现在将描述将捕获分子，例如抗体或DNA低聚物结合到生物传感器表面的各种常规方案。
参考图1A，在一种常规方案中，直接化学吸附或物理吸附将捕获分子10结合到表面20上。表面20由相对短的连接体分子30官能化。例如，表面20可以胺官能化的。连接体30将捕获分子10固定在表面20上。一般可以通过严格洗涤除去也存在于表面20上的不需要的分子，以优化生物传感器的选择性。然而，洗涤可以除去物理吸附的分子。化学吸附的分子更耐洗。参考图1B，该方案留下了许多暴露的连接体30。这导致其它分子40的更多非特异性化学吸附或物理吸附。这降低了生物传感器的选择性。通过特定相互作用结合的分子与通过非特异性相互作用结合的分子的比例降低了。尽管捕获分子10的选择性可能在溶液中高，其它分子40的存在使许多检测方法复杂。此外，捕获分子10的直接物理吸附或化学吸附限制了分子活动性(mobility)。极少捕获分子10具有全部功能性。因此降低了捕获分子10的灵敏性。在捕获分子10用于结合检验(binding assay)时，通常降低了结合效率。亲合常数和结合动力学随化学吸附的取向而变化。这导致较少的目标分子70，例如结合到表面20的抗原。而且，在不同表面之间具有更高的结合可变性。如果使用的检测方案不能区分目标分子70和其它分子40，那么显著降低了生物传感器的有效特异性。这在无标记和标记检测方案中都是很普通。严格洗涤不总能解决该问题，这是因为在非特异性结合期间，合作效应事实上是不可逆的。
参考图1C，在另一常规方案中，捕获分子10通过间隔物分子(spacermolecule)50化学吸附到表面20。如前面所指出的，捕获分子10的化学吸附允许更严格的洗涤过程，如此减少了非特异物理吸附的分子。间隔物50比前面参考图1A所述的连接体30长。间隔物50将捕获分子10束缚到表面20上。然而，间隔物50还允许捕获分子10相对于表面20的受限移动。这允许捕获分子10增加活性。改善了捕获分子10的活动性并由此改善了其功能性。因此增加了通过间隔物50化学吸附的捕获分子10的结合效率。然而，参考图1D，暴露表面20和间隔物50允许其它分子40的非特异性结合。非特异性结合可以如图1B排列所示的大致相同的量出现。
参考图1E，在图1C方案的改进中，在生物相容分子60的海洋内，捕获分子20通过间隔物50锚定到表面20。生物相容分子60可抵抗其它分子40的非特异性吸附，这改善了表面20的有效特异性。参考图IF，因为表面20更少暴露，所以减少了非特异性结合。只有间隔物50和捕获分子10提供了其它分子40的非特异性结合位置。通过除去非特异结合分子40多于特异性结合分子10，严格洗涤能够进一步改善特异性。
生物传感器对非特异性吸附的敏感性还取决于使用的标记和检测方案。例如，夹心ELISA检验不敏感，这是因为测量的信号仅仅取决于目标抗原分子10的数目和标记抗体用来结合到表面20的特异性。该方法是惰性的，因为其涉及双重选择性检测。然而，无标记检测方案对非特异性吸附到表面20的其它分子40更敏感。这些方案通过质量或折射率测量存在于表面20上的蛋白质/DNA。在非特异性吸附上，比夹心ELISA生物传感器需要更多的控制。当通过化学标记技术检测结合分子时，对非特异性吸附和特异信号产生的控制也很重要。当化学标记显示出与化学吸附中涉及的化学基团的交叉反应性时，特别需要这种控制。可以加入障碍物(barrier)以防止接近这些基团。然而，非特异性吸附的BSA阻断(blocking)不总是可能的，因为BSA产生信号并降低生物传感器的“有效”选择性。
核酸适体(aptamers)可用于生物传感器制造，因为它们可以形成三维结构。适体也可以以可接收的亲合性和特异性结合一定范围的目标分子。同样，适体可以以与蛋白质分子相似的方式发挥作用。例如，适体能够由于配体-结合改变结构。有许多可用于生物传感器阵列的不同受体。然而，适体由于许多原因而特别有用。其原因之一是适体能够比抗体更容易地设计。在选择后，适体可以降低到30-60核苷酸残基核心序列，而不降低结合功能。另一原因是可以通过化学合成容易地导入修饰，例如荧光报道分子。另一原因是适体结构主要是沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对功能。二级结构相互作用允许适体比抗体更容易地转变为受体。
参考图2A，在制造前述参考图1F的生物传感器的常规方法中，以胺官能化的适体120形式的捕获分子交联到玻璃表面20上。该表面首先用APTS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)100官能化。然后通过以双官能琥珀酰亚胺交联剂(BS3)110形式的间隔物进行上述交联。
在捕获分子10的这种化学吸附后，剩下的交联间隔物50和胺表面20用单官能化的琥珀酰亚胺封闭以覆盖胺，和用乙醇胺封闭以饱和未反应的琥珀酰亚胺基团。任何残留的表面积可以用PEG处理。这些后-化学吸附步骤降低了非特异性蛋白质吸附。然而，如前面所指出的，在捕获分子10和间隔物50之间的空间仍然可以反应。这些空间接收非特异性蛋白质吸附。BS3间隔物对于许多蛋白质太短，并产生前面参考图1A所述的问题。此外，官能化、交联和封闭步骤都涉及将表面20在不同环境浴中暴露于不同的环境中。该方法是费力、费时并浪费原料的。
需要提供用于以改善的捕获分子的活性、可接近性、容量和特异性，进行捕获分子的化学吸附的方法。具体地，需要提供用于制造生物传感器的方法，该方法：不可逆地将捕获分子结合到生物传感器表面；对捕获分子提供充分的活动性和可接近性，以保留功能性；并使目标抗原或其它分子的非特异性吸附最小化。还需要提供用于制备生物传感器的方法，该方法的人工、耗时和材料浪费都较小。
发明概述
本发明提供在表面上产生生物分子单层的方法，包括以下步骤：将该表面与双异官能团试剂(heterobifunctional reagent)的溶液反应，其中该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物(homobifunctional polymer)形成共价键，以获得自组装单层；以及然后将该单层与生物分子反应。
本文中使用的术语生物分子指具有生物功能性的分子。例如，生物分子可以为胺官能化的。同样地，生物分子可以包括核酸适体衍生物。优选地，包括过量的双同官能团聚合物。优选在暴露于该表面前，混合双异官能团试剂与双同官能团聚合物。表面可以是玻璃、金属等。双异官能团试剂优选为氨基烷基三烷氧基硅烷。在本发明的优选实施方式中，双异官能团试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷。然而，双异官能团试剂可以为烷基硫醇。双异官能团试剂的第二官能团优选与双同官能团聚合物的一个官能团反应，以在它们之间形成共价键。在本发明的优选实施方式中，双同官能团聚合物的官能团是N-羟基琥珀酰亚胺基团。双同官能团聚合物可以为双同官能团聚乙二醇。生物分子可以与双同官能团聚合物的一个官能团反应，以在它们之间形成共价键。在生物分子和双同官能团聚合物之间形成的共价键优选为酰胺键。
本发明的另一方面提供了具有表面层的生物传感器，其是通过在表面上产生生物分子单层的方法形成的，该方法包括以下步骤：使该表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；和然后使该单层与捕获分子反应。
本发明的另一方面提供生物传感器阵列，该阵列包括生物分子在底物上的图案化的沉积物(patterned deposit)，其中图案化的沉积物是通过在表面上产生生物分子单层的方法形成的，该方法包括以下步骤：使该表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；和然后使该单层与捕获分子反应。
本发明的另一方面提供生物芯片，该生物芯片具有通过在表面上产生生物分子单层的方法形成的表面层，该方法包括以下步骤：使该表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；和然后使该单层与生物分子反应。
本发明的另一方面提供生物芯片阵列，该阵列包括生物分子在底物上的图案化的沉积物，其中图案化的沉积物是通过在表面上产生生物分子单层的方法形成的，该方法包括以下步骤：使该表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；和然后使该单层与生物分子反应。
在本发明的优选实施方式中，提供用于将捕获分子结合到生物传感器表面的简单的两步化学方法。该方法使用在各端具有琥珀酰亚胺基团的双同官能团PEG交联剂，将捕获分子化学吸附到表面上，其密度合再现性比迄今为止可能获得的更高。该方法改善了生物检定的灵敏性和选择性。还提供了用于高产率、经济性地处理生物传感器表面的流程和装置。
在特别优选的本发明实施方式中，提供将间隔物分子结合到干净玻璃表面的方法。该方法涉及双异官能团试剂，例如3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)与双同官能团聚合物，例如双同官能团琥珀酰亚胺末端官能化的PEG聚合物之间的不对称反应。在无水溶剂中进行该反应。使用高浓度以有利于生物分子反应。本发明还提供用于将少量预反应试剂施加到玻璃表面以便节省昂贵的试剂的装置。
附图说明
现在将参考附图，通过实施例，描述本发明的优选实施方式，附图中：
图1A为显示表面上捕获分子的直接吸附的生物传感器表面剖视图；
图1B为显示其它分子对图1A所示排列的非特异性化学吸附的表面的剖视图；
图1C为显示捕获分子经过间隔物分子的化学吸附的表面剖视图；
图1D为显示其它分子对图1C所示的排列的非特异性化学吸附的表面剖视图；
图1E为显示在生物相容分子的海洋中，捕获分子经过间隔物分子锚定到表面上的表面剖视图；
图1F为显示其它分子对图1E所示排列的非特异性化学吸附的表面剖视图；
图1G为本发明优选实施方式的剖视图，其中捕获分子通过组合的锚定物/间隔物锚定到表面；
图1H为显示其它分子对图1G所示排列的非特异性化学吸附的剖视图；
图2A为显示将胺官能化的适体通过双官能琥珀酰亚胺交联剂(BS3)结合到APTS(3-氨丙基三乙氧基硅烷)官能化的玻璃表面的流程图；
图2B为显示将胺官能化的适体结合到玻璃表面的流程图，其中该表面用APTS(氨丙基三甲氧基硅烷)和双同官能团PEG N-羟基琥珀酰亚胺交联剂(NHS)在DMSO中的预处理溶液处理；
图2C显示在DMSO中将APTS(氨丙基三甲氧基硅烷)结合到双同官能团PEG N-羟基琥珀酰亚胺交联剂(NHS)的一端的反应；
图3为显示氨丙基三乙氧基硅烷与NHS PEG的反应的NMR谱图；
图4A为用于处理生物传感器表面的流体单元(fluid cell)的平面图；
图4B为流体单元的侧面图；
图4C为流体单元的另一平面图；
图5A为经处理表面的像片；
图5B为荧光与相应于图5A的表面的数据点之间的曲线；
图5C为另一经处理表面的像片；和
图5D为荧光与相应于图5B的表面的数据点之间的曲线。
优选实施方式详述
参考图1G，在本发明的优选实施方式中，提供生物传感器，其中捕获分子10经过起到生物相容性分子80作用的组合锚定物/间隔物，被锚定到玻璃生物传感器表面20上。
现在参考图1H，生物相容性分子80抵抗其它分子40的非特异性吸附，并还充当交联剂。这进一步减少了潜在的非特异性吸附位置。有利地，多余的生物相容性分子80提供捕获分子40的侧向间隔而不留下暴露的底表面20。施加的捕获分子10的浓度决定了表面活化作用的密度。在操作中，目标分子70经过捕获分子80结合到表面20。
一起参考图2B和2C，在本发明优选实施方式中，用APTS(氨丙基三甲氧基硅烷)200和双同官能团PEG N-羟基琥珀酰亚胺交联剂(NHS)210在二甲基亚砜(DMSO)中的预处理溶液处理玻璃表面20。NHS交联剂210具有两个NHS官能团，在每一端有一个官能团。在一端，第一NHS官能团结合到APTS 200。在另一端，第二NHS官能结合到胺官能化的适体220。在两种情况下，通过共价键结合。
图3显示NMR谱图，其解释了APTS 200与NHS PEG 210的反应。示出的分子是该反应的结果。
在本发明列举的特别优选的方法中，图3所指的反应首先是如下进行的：在42-48℃下，于DMSO溶液中，从APTS和以(a，w)NHS-PEG 2000 Rapp聚合物形式的双同官能团PEG，制备NHS-PEG-三乙氧基硅烷形式的双异官能团试剂。将DMSO中的300微升80mM的双同官能团NHS-PEG与DMSO中的200微升120mM的APTS、300微升DMSO中的6微升APTS混合。这产生了两种物质的浓度都为48mM的等摩尔混合物。将该混合物加热到46和50℃之间，并使反应进行30～60分钟。然后将所得物转移到在两个预处理玻璃表面之间的窄缝隙中，并保持60～120分钟。利用毛细作用促进混合物进入缝隙直至充满缝隙。理想地在高温下填充缝隙。否则，混合物的粘度太高。用1份浓硫酸(Fluka)和2份过氧化氢(Fluka puriss)的混合物处理表面几小时，然后用去离子水洗涤。硫酸和过氧化氢的混合物有时称作‘piranha溶液’，在混合过程中将其加热到沸点。
仍然参考图3，进行30分钟后，NMR显示90％以上的胺基团与PEG上的NHS基团反应，并且没有检测到游离的APTS，检测阈为10％。统计学地形成了未反应的NHS-PEG和双同官能团三乙氧基硅烷PEG的双同官能团副产物。然而，这些并不干扰化学吸附。这是因为NHS-PEG不能化学吸附到玻璃上。双同官能团三乙氧基硅烷PEG可能仅仅稀释了NHS-PEG的密度，并在随后的蛋白质吸附步骤中裂解为Si-(OH)3。
图4A～C显示了用于使用高浓度相对昂贵的连接体/间隔物生物相容性分子，例如前述的那些，处理玻璃表面20的流体单元。参考图4A和4B，表面20通过100-300微米厚的外周衬垫300隔开并密封。衬垫300可以由特富龙(Telfon)形成。参考图4C，然后通过毛细管力，从150微升体积的一侧用反应性混合物填充流体单元。特别地，通过毛细作用将该混合物吸入到表面20之间并由衬垫300限定的缝隙中。因此处理了表面20。
本文前面所述的技术优于常规技术，这是因为原位制备了双异官能团试剂。无需进一步纯化。这特别有利，因为通过常规技术纯化硅烷化的PEG，例如色谱法即使不是不可能也是非常难的。不含水的条件防止了APTS的聚合并有利于调节表面20的常规处理。试剂的原位制备提供了新鲜的反应性中间体，该中间体不会由于储存而降解或聚合。在50mM PEG和APTS的混合物中的高浓度改善了生物分子的反应速度。这允许制备该试剂而没有不需要的降解。NHS的浓度比APTS的高有助于驱动APTS与NHS基团的反应至完全。毛细管缝隙通过消除扩散限制增加了表面反应的速度。因为在混合物中基本上没有梯度，表面20的处理更均匀。表面20之间表面和体积比例越大，聚合反应降低得越多，越有利于三乙氧基硅烷与表面20的反应。这些反过来可能会降低检测方案的特异性，例如通过CBQCA或NHS-若丹明检测伯胺。在混合物中存在的低水平的APTS显著降低了检测伯胺的背景水平。
通过用滤纸除去溶液，然后用DMSO洗涤三次，停止在表面20之间试剂的反应。洗涤除去了未反应的双异官能团分子以及聚合产物和双同官能团副产物。然后拆开表面20，并用氮气吹干以除去痕量DMSO。然后将捕获分子10结合到新鲜的NHS-活化表面20上。可选择地，表面20可以在干燥氩气中储存几天。
如本文中前面描述的经处理的玻璃表面20可锚定具有氨基端基(5′或3′端)的寡核苷酸、蛋白质和其它NH2-官能化的分子。在特别优选的本发明实施方式中，通过用氨基官能化的化合物的水溶液填充施用到NHS-活化表面20的PDMS微观流体网状物，进行化学吸附。寡核苷酸在含有10％DMSO和15-20％PEG(MW＝1000)的水溶液中化学吸附到表面20。在化学反应期间，20mM寡核苷酸的浓度对表面20提供了由寡核苷酸特别均匀的覆盖，并且剩下的基本未受干燥的影响。
图5A～5D示例了使用使本发明具体化的表面官能化可获得的改善的均一性。图5A显示图案化的TAMRA标记的18-聚的DNA低聚物分子的荧光图像，该分子通过NHS-PEG-APTS偶联物间隔物化学吸附到表面。浅色条纹显示化学吸附的低聚物分子。图5B为从图5A表面计算的荧光的曲线，显示点内(intraspot)标准偏差＜2％和点间(interspot)标准偏差＜4％。在该情况下，对在图像中分布的45个单独区域平均的荧光强度计数为9748+-350。变化率小于4％。对于一个区域，平均600象素。即使在洗涤和杂会循环过程中图案化的精度仍然保持稳定。
参考图5C和5D，通过其中的图像和图表证明。通过使适体沿垂直线路轨迹进行图案化的化学吸附，并通过使标记的16-聚的低聚物底剂沿间隔的水平轨迹进行图案化的杂化，产生浅色方块区域。9个区域平均的荧光图像计数为21539+-1085。变化率为5％。对于一个区域，平均784象素。
本文中仅仅通过实施例的方式描述了本发明的优选实施方式。对本领域技术人员很明显本发明可以有更多的实施方式。

Claims (19)

1.在表面上产生生物分子单层的方法，包括以下步骤：使该表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；以及然后将该单层与生物分子反应。
2.权利要求1的方法，其中生物分子是胺官能化的。
3.权利要求1的方法，其中生物分子包括核酸适体衍生物。
4.权利要求1的方法，还包括过量的双同官能团聚合物。
5.权利要求1的方法，其中在暴露于表面前，混合双异官能团试剂和双同官能团聚合物。
6.权利要求1的方法，其中表面是玻璃表面。
7.权利要求1的方法，其中表面是金属表面。
8.权利要求1的方法，其中双异官能团试剂是氨基烷基三烷氧基硅烷。
9.权利要求8的方法，其中双异官能团试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷。
10.权利要求1的方法，其中双异官能团试剂为烷基硫醇。
11.权利要求1的方法，其中双异官能团试剂的第二官能团与双同官能团聚合物的一个官能团反应，以在它们之间形成共价键。
12.权利要求11的方法，其中双同官能团聚合物的官能团为N-羟基琥珀酰亚胺基团。
13.权利要求1的方法，其中双同官能团聚合物为双同官能团聚乙二醇。
14.权利要求1的方法，其中生物分子与双同官能团聚合物的一个官能团反应以在它们之间形成共价键。
15.权利要求14的方法，其中在生物分子和双同官能团聚合物之间形成的共价键为酰胺键。
16.一种具有表面层的生物传感器，其是通过在表面上产生生物分子单层的方法形成的，该方法包括以下步骤：使该表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；以及然后使该单层与捕获分子反应。
17.一种生物传感器阵列，该阵列包括生物分子在底物上的图案化的沉积物，其中图案化的沉积物是通过在表面上产生生物分子单层的方法形成的，该方法包括以下步骤：使该表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；以及然后使该单层与捕获分子反应。
18.一种生物芯片，该生物芯片具有通过在表面上产生生物分子单层的方法形成的表面层，该方法包括以下步骤：使该表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；以及然后使该单层与生物分子反应。
19.一种生物芯片阵列，其包括生物分子在底物上的图案化的沉积物，其中图案化的沉积物是通过在表面上产生生物分子单层的方法形成的，该方法包括以下步骤：使该表面与双异官能团试剂的溶液反应，以获得自组装单层，该试剂具有第一官能团和第二官能团，该第一官能团能够与表面基团形成共价键，该第二官能团与双同官能团聚合物形成共价键；以及然后使该单层与生物分子反应。
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