KR20050084969A

KR20050084969A - 표면 처리

Info

Publication number: KR20050084969A
Application number: KR1020057008085A
Authority: KR
Inventors: 세르게이 아몬토브; 브루노 마이클; 셀리 스완슨; 헤이코 울프
Original assignee: 인터내셔널 비지네스 머신즈 코포레이션
Priority date: 2002-12-04
Filing date: 2003-12-04
Publication date: 2005-08-29
Also published as: KR100694930B1; CN1720096A; JP2006509201A; TWI277653B; TW200424315A; US20060286682A1; US20040110276A1; WO2004050919A2; EP1572352A2; WO2004050919A3; US7070922B2

Abstract

설명된 것은 바이오센서 표면과, 바이오센서 표면 기에 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 바이오분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법이다.

Description

표면 처리{SURFACE TREATMENT}

본 발명은 일반적으로 표면 처리에 관한 것이고, 보다 상세하게는 분자 화학흡착(chemisorption)에 의해 바이오센서 표면과 같은 표면을 처리하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.

바이오센서 어레이(biosensor arrays)의 제조는 전형적으로 표면 상에 바이오분자의 패턴화된 증착(deposition)을 포함한다. 감도(sensitivity), 재현성(reproducibility) 및 선택성(selectivity)은 바이오센서 질의 중요한 특징이다. 감도는 전형적으로 타켓 분자를 효과적으로 포획하기 위하여 화학흡착된 포획 분자의 조밀한 층을 통해 성취될 수 있다. 재현성은 전형적으로 고도로 재현가능한 고정 화학(anchoring chemistry) 및 우수한 질의 포획 분자 패터닝에 의존한다. 선택성은 전형적으로 타겟 분자의 높은 선택성 및 다른 분자의 낮은 비-선택적 흡착에 의존한다. 후자는 검출되어지는 신호의 30%까지 바이오센서의 유용성을 제한할 수 있다.

바이오접합(bioconjugation)은 개별적인 구성요소의 조합된 특성을 갖는 착물을 형성하기 위해 연결 분자(linking molecules)를 포함한다. 천연 및 합성 화합물, 및 이들의 활성은 요구된 특성을 갖는 물질을 설계하기 위해 화학적으로 조합될 수 있다. 예를 들면, 착 혼합물중에서 타겟 분자에 결합된 단백질은 추적할 수 있는 접합물을 형성하기 위해 검출될 수 있는 또 다른 분자와 가교될 수도 있다. 검출 성분은 국소화될 수 있거나, 다양한 공정을 통해 이어질 수 있거나 또는 측정을 위해 사용될 수 있는 착물을 형성하는 타겟 성분에 가시성을 제공한다.

바이오접합은 생명 과학의 많은 분야에 영향을 미친다. 특정의 활성을 갖는 신규한 접합물의 제조에 가교 반응의 적용은 세포 성분의 검출 및 질병의 치료를 위한 물질의 정밀한 양(minute quantities)의 에세이(assay)를 가능하게 한다. 하나의 분자를 또 다른 분자에 화학적으로 부착하는 능력은 성장 산업 서빙 리서치(growing industry serving research), 진단제 및 치료제 시장을 발생시킨다. 생물학적 에세이의 현저한 부분이 용액, 세포 또는 조직중의 특이적 분석물과 상호작용하기 위한 접합물을 사용하여 현재 수행되고 있다. 접합 분자, 시약 시스템 및 바이오접합 기술의 적용에 대한 개괄적인 내용은 문헌[G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, 1996]에서 제공된다.

생물학적 환경에서 사용하기 위한 표면은 세포 배양에서 효소결합 면역흡수 에세이(ELISA)를 위한 기질, 콘텍트렌즈, 이식 보철물(implanted prostheses), 카테터(catheters) 및 단백질 저장 용기와 같은 분자 및 세포 생물학을 위한 수단중에서 발견된다. 이런 많은 표면은 자발적인 흡착을 통해 단백질층으로 빠르게 코팅된다. 일부는 이로운 효과를 갖는다. 나머지는 유해하게 된다. 단백질 흡착을 방해하기 위해 생물학적으로 "불활성" 물질을 동정하는 것은 매우 흥미롭다. 이런 내성을 도입하기 위한 통상적인 표면 처리 방법은 표면을 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)로 코팅하는 것을 포함한다. 예를 들면, 문헌[J.M. Harris ed. Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York, 1992]를 참조한다. PEG에 대한 보다 상세한 것은 문헌[Gombotz, W.R. et al., J. Biomed. Matter. Res. 15, 1547-1562(1991)]에서 제공된다. 또 다른 접근은 소 혈청 알부민의 예비-흡착(pre-adsorption)을 포함한다. 그러나, 이런 접근은 시간의 경과에 따른 단백질의 변성 또는 단백질이 다른 분자로 교환되는 것이 문제가 된다. 따라서, 이런 접근은 질량(mass) 또는 일차 아민에 의한 단백질의 존재를 검출하기 위한 바이오센서에 적용하는데 적합하지 않다. 짧은 사슬 PEG 올리고머(n=2-7)의 자가 조립된 단층은 또한 단백질의 흡착을 방해하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 문헌[Mrksich, M. and Whitesides, G.M., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 55-78(1996)]을 참조한다. 그러나. 흡착하려는 단백질은 PEG를 압착하고 탈용매화할 수 있다. 이런 효과는 모두 에너지적으로 이롭지 않다. 예를 들면, 문헌[Jeon, S.I. and Andrade, J.D. "Protein surface interactions in the presence of polyethylene oxide: effect of protein size", J. Coll. Interface Sci. 142, 159-166(1991); 및 Jeon, S.I., Lee, J.H., Adrade, J.D. and de Gennes, P.G., "Protein surface interactions in the presence of polyethyleneoxide: simplified theory", J.Coll. Interface Sci. 142, 149-158(1991)]을 참조한다.

바이오센서 표면은 전형적으로 보로실리케이트 유리로부터 형성된다. 바이오 센서 표면에 항체 또는 DNA 올리고머와 같은 포획 분자를 부착하기 위한 다양한 통상적인 스킴이 지금부터 설명될 것이다.

도 1A를 참조하면, 하나의 통상적인 스킴으로, 직접 화학흡착 또는 물리흡착은 표면(20)에 포획 분자(10)를 결합한다. 표면(20)은 비교적 짧은 링커 분자(30)로 기능화된다. 예를 들면, 표면(20)은 아민-기능화될 수도 있다. 상기 링커(30)는 표면(20) 상에 포획 분자(10)을 고정화한다. 표면(20) 상에 또한 존재하는 원치 않는 분자는 전형적으로 바이오센서의 선택성을 최적화하기 위해 엄중한 세척(stringent washing)에 의해 제거될 수 있다. 그러나, 세척은 물리흡착된 분자를 제거할 수 있다. 화학흡착된 분자는 세척에 대해 보다 더 저항적이다. 도 1B를 참조하면, 이 스킴은 많은 링커(30)을 노출된 상태로 둔다. 이것은 다른 분자(40)의 많은 비특이적 화학흡착 또는 물리흡착을 야기한다. 이것은 바이오센서의 선택성을 감소시킨다. 비특이적 상호작용에 의해 결합된 분자에 대한 특이적 상호작용에 의해 결합된 분자의 비는 감소된다. 비록 포획 분자(10)의 선택성이 용액중에서 높을 지라도, 많은 검출 방법은 다른 분자(40)의 존재에 의해 복잡하게 된다. 추가적으로 포획 분자(10)의 직접 물리흡착 또는 화학흡착은 분자 이동성을 제한한다. 포획 분자(10)가 완전한 기능성을 갖는 경우는 별로 없다. 따라서, 포획 분자(10)의 감도는 감소된다. 결합 효능은 일반적으로 포획 분자(10)가 결합에세이를 위한 경우 감소된다. 친화성 상수(affinity constant) 및 결합 운동학(binding kinetic)은 화학흡착의 방향에 따라서 변화한다. 이것은 표면(20)에 결합되는 항원과 같은 타겟 분자(70)를 감소시킨다. 또한, 다른 표면 사이에 보다 높은 결합 변화성이 있다. 사용된 검출 스킴이 타겟 분자(70)와 다른 분자(40)를 구별할 수 없다면, 바이오센서의 효과적인 특이성은 현저하게 감소된다. 이것은 라벨 없는 및 라벨화된 검출 스킴 모두에 공통이다. 비특이적 결합동안 협력적인 효과가 실제적으로 비가역적이기 때문에 엄중한 세척이 이 문제를 바로 잡지는 못한다.

도 1C를 참조하면, 또 다른 통상적인 스킴으로, 포획 분자(10)는 스페이서 분자(50)을 통해 표면(20)에 화학흡착된다. 이전에 지적된 바와 같이, 포획 분자(10)의 화학흡착은 보다 엄중한 세척 공정을 허용하여, 비특이적으로 물리흡착된 분자를 감소시킨다. 스페이서(50)는 도 1A를 참조하여 이전에 설명된 링커(30) 보다 길다. 스페이서(50)는 표면(20)에 포획 분자(30)을 매어둔다. 그러나, 스페이서(50)는 또한 표면(20)에 비하여 포획 분자(10)의 제한된 이동을 허용한다. 이것은 포획 분자(10)의 활성을 증가시킨다. 따라서, 포획 분자(10)의 이동성 및 기능성이 향상된다. 스페이서(50)를 통해 화학흡착된 포획 분자(10)의 결합 효능은 따라서 증가된다. 그러나, 도 1D를 참조하면, 노출된 표면(20) 및 스페이서(50)는 다른 분자(40)의 비특이적 결합을 허용한다. 비특이적 결합은 도 1B 배열에서와 같은 동일한 양으로 개략적으로 일어날 수 있다.

도 1E를 참조하면, 도 1C 스킴의 변형으로, 포획 분자(20)는 생체적합성 분자(60)의 바다에서 스페이서(50)를 통해 표면(20)에 고정된다. 생체적합성 분자(60)는 다른 분자(40)의 비특이적 흡착에 방해가 된다. 이것은 표면(20)의 효과적인 특이성을 개선한다. 도 1F를 참조하면, 비특이적 결합은 표면(20)이 덜 노출되기 때문에 감소된다. 스페이서(50)와 포획 분자(10) 만이 다른 분자(40)의 비특이적 결합을 위한 자리를 제공한다. 엄중한 세척은 특이적으로 결합된 분자(10)보다 비특이적으로 결합된 분자(40)를 더 많이 제거하는 것에 의해 특이성을 더욱 개선시킬 수 있다.

비특이적 흡착에 대한 바이오센서의 감수율(susceptibility)은 또한 사용된 라벨링 및 검출 스킴에 의존한다. 예를 들면, 샌드위치 ELISA 에세이는 측정된 신호가 타겟 항원 분자(10)의 수 및 라벨링 항체가 표면(20)에 결합하는 특이성에만 의존하기 때문에 덜 민감하다. 이 접근은 이것이 이중의 선택적인 검출을 포함하기 때문에 느리다. 그러나, 라벨 없는 검출 스킴은 표면(20)에 비특이적으로 흡착하는 다른 분자(40)에 더 약하다. 이들 스킴은 질량 또는 굴절 인덱스(mass or refractive index)에 의해 표면(20)에 존재하는 단백질/DNA를 측정한다. 비특이적 흡착에 대한 제어가 샌드위치 ELISA 바이오센서에서 보다 더 요구된다. 비특이적 흡착 및 비특이적 신호 발생에 대한 제어는 또한 결합된 분자가 화학적 라벨링 기술에 의해 검출되는 경우 매우 중요하다. 이런 제어는 특히 화학적 라벨링이 화학흡착에 포함된 화학적 기들을 갖는 교차-반응성을 보여주는 경우에 바람직하다. 베리어(barrier)는 기들에의 접근을 방지하기 위해 추가될 수 있다. 그러나, 비특이적 흡착의 BSA 블록킹은 BSA가 신호를 생성하고, 바이오센서의 "효과적인" 선택성을 감소시키기 때문에 일반적으로 가능하지는 않다.

핵산 압타머(nucleic acid aptamer)는 이들이 삼차원 구조를 형성할 수 있기 때문에 바이오센서 제조를 위해 유용하다. 압타머는 또한 허용가능한 친화성과 특이성을 갖는 일정 범위의 타겟 분자를 결합할 수 있다. 또한, 압타머는 단백질 분자에 대하여 유사한 방식으로 기능할 수 있다. 예를 들면, 압타머는 리간드 결합에 기인하여 구조가 변화할 수 있다. 바이오센서 어레이에 유용한 많은 다른 수용체(receptors)가 있다. 그러나, 압타머는 특히 여러가지 이유 때문에 유용하다. 하나의 이유는 압타머가 항체보다 보다 용이하게 설계될 수 있다는 것이다. 선택되는 경우, 압타머는 결합 기능을 감소시킴 없이 30 내지 60 뉴클레오타이드 잔기 중심 시퀀스로 감소될 수 있다. 또 다른 이유는 형광 리포터(fluorescent reporter)와 같은 변형이 용이하게 화학적 합성에 의해 도입될 수 있다는 것이다. 또 다른 이유는 압타머 구조가 주로 와트슨-클릭(Watson-Crick) 염기 쌍의 기능이있다는 것이다. 이차적인 구조적 상호작용은 압타머를 항체보다 용이하게 수용체로 전환될 수 있게 한다.

도 2A를 참조하면, 도 1F를 참조하여 이전에 설명된 바와 같이 바이오센서를 제조하기 위한 통상적인 방법으로, 아민-기능화된 압타머(120) 형태의 포획 분자가 유리 표면(20)에 가교된다. 상기 표면은 우선 APTS(3-아미노프로필 트리에톡시실란)(100)으로 기능화된다. 상기 가교는 이어서 이기능성 숙신이미드 가교제(BS3)(110) 형태로 스페이서에 의해 수행된다.

포획 분자(10)의 이런 화학흡착에 뒤이어서, 남아있는 가교 스페이서(50) 및 아민 표면(20)은 아민을 덮기 위해 단일 기능화된 숙신이미드로 블럭되고, 미반응된 숙신이미드기를 포화하기 위해 에탄올아민으로 블럭된다. 임의의 남아있는 표면 영역은 PEG로 처리될 수도 있다. 이들 후반-화학흡착 단계는 비특이적 단백질 흡착을 감소시킨다. 그러나, 이전에 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 포획 분자(10) 및 스페이서(50) 사이의 스페이스는 여전히 반응할 수 있다. 이들 스페이스는 비특이적 단백질 흡착을 받아들인다. BS3 스페이서는 많은 단백질에 대해 너무 짧고, 도 1A를 참조하여 이전에 설명된 바와 같은 문제가 제기된다. 게다가, 기능화, 가교화 및 블럭화 단계 각각은 다른 조(different bath)의 다른 환경에 표면(20)의 노출을 포함한다. 이들 공정은 힘들고, 시간이 많이 소비되고 및 원료를 낭비한다.

개선된 활성(activity), 접근성(accessibility), 용량(capacity) 및 포획 분자의 특이성(specificity)을 갖는 포획 분자의 화학흡착을 효과적으로 하기 위한 방법을 제공하는 것이 요구된다. 특히, 포획 분자를 바이오센서 표면에 비가역적으로 부착하고; 기능성을 유지하기 위해 포획 분자에 대한 충분한 이동성과 접근성을 제공하고; 및 타겟 항원 또는 다른 분자의 비특이적 흡착을 최소화하는 바이오센서 제조방법을 제공하는 것이 요구된다. 또한, 덜 힘들고, 덜 시간이 소비되며 덜 원료를 낭비하는 바이오센서 제조방법을 제공하는 것이 요구된다.

본 발명의 바람직한 구현예가 도면을 참조하여 실시예를 대신하여 설명될 것이다.

도 1A는 표면 상에 포획 분자의 직접 흡착을 보여주는 바이오센서 표면의 단면도이다.

도 1B는 도 1A에서 보여진 배열에 다른 분자의 비특이적 화학흡착을 보여주는 표면의 단면도이다.

도 1C는 스페이서 분자를 통해 포획 분자의 화학흡착을 보여주는 표면의 단면도이다.

도 1D는 도 1C에서 보여진 배열에 다른 분자의 비특이적 화학흡착을 보여주는 표면의 단면도이다.

도 1E는 생체적합성 분자의 바다중에서 스페이서 분자를 통해 표면에 고정된 포획 분자를 보여주는 표면의 단면도이다.

도 1F는 도 1E에서 보여진 배열에 다른 분자의 비특이적 화학흡착을 보여주는 표면의 단면도이다.

도 1G는 포획 분자가 조합된 앵커/스페이서를 통해 표면에 고정되는 본 발명의 바람직한 구현예의 단면도이다.

도 1H는 도 1G에서 보여진 배열에 다른 분자의 비특이적 화학흡착을 보여주는 단면도이다.

도 2A는 이기능성 숙신이미드 가교제(BS3)를 통해 APTS(3-아미노프로필 트리에톡시실란) 기능화된 유리 표면에 아민-기능화된 압타머의 부착을 보여주는 플로우 다이아그램이다.

도 2B는 표면이 DMSO중의 APTS(아미노프로필트리메톡시실란) 및 호모이기능성 PEG N-히드록시 숙신이미드 가교제(NHS)의 예비처리된 용액으로 처리되는 경우 유리 기판에 아민-기능화된 압타머의 부착을 보여주는 플로우 다이아그램이다.

도 2C는 DMSO중에서 호모이기능성 PEG N-히드록시 숙신이미드 가교제(NHS)의 하나의 말단과 APTS(아미노프로필 트리에톡시실란)의 반응을 보여준다.

도 3은 아미노프로필 트리에톡시실란과 NHS PEG와의 반응을 보여주는 NMR 스펙트럼이다.

도 4A는 바이오센서 표면을 처리하기 위한 유동 셀의 평면도이다.

도 4B는 유동 셀의 측면도이다.

도 4C는 상기 셀의 또 다른 평면도이다.

도 5A는 처리된 표면의 포토그래픽 이미지이다.

도 5B는 도 5A의 표면에 대응하는 형광 대 데이터 포인트의 플롯이다.

도 5C는 또 다른 처리된 표면의 포토그래픽 이미지이다.

도 5D는 도 5B의 표면에 대응하는 형광 대 데이타 포인트의 플롯이다.

본 발명에 따르면, 표면과, 표면 기들과 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성(homobifunctional polymer) 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 바이오분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오분자"는 생물학적 기능성을 갖는 분자를 의미한다. 예를 들면, 바이오분자는 아민-기능화될 수도 있다. 동시에, 바이오분자는 핵산 압타머 유도체를 포함할 수도 있다. 바람직하게, 과량의 호모이기능성 폴리머가 포함된다. 상기 헤테로이기능성 시약은 표면에 노출되기 전에 우선적으로 호모이기능성 폴리머와 혼합된다. 표면은 유리, 금속 및 등등일 수 있다. 헤테로이기능성 시약은 아미노알킬 트리알콕시실란인 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 헤테로이기능성 시약은 3-아미노프로필 트리에톡시실란이다. 그러나, 헤테로이기능성 시약은 알킬티올일 수도 있다. 헤테로이기능성 시약의 제 2 기능성 기는 호모이기능성 폴리머의 하나의 기능성 기와 이들 사이에 공유결합을 형성하기 위해 바람직하게 반응한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 호모이기능성 폴리머의 기능성 기는 N-히드록시 숙신이미드기이다. 호모이기능성 폴리머는 호모이기능성 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 바이오분자는 호모이기능성 폴리머의 하나의 기능성 기와 이들 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수도 있다. 바이오분자와 호모이기능성 폴리머 사이에 형성된 공유 결합은 아민 결합인 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 표면과, 표면 기들과 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 포획 분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법에 의해 형성된 표면층을 갖는 바이오센서를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 기질 상에 바이오분자의 패턴화된 증착(patterned deposit)을 포함하고, 여기서, 패턴화된 증착은 표면과, 표면 기들과 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 포획 분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법에 의해 형성되는 것인 바이오센서 어레이를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 표면과 표면 기들과 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 포획 분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법에 의해 형성된 표면층을 갖는 바이오칩을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 기질 상에 바이오분자의 패턴화된 증착을 포함하고, 여기서, 패턴화된 증착은 표면과, 표면 기들과 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 포획 분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법에 의해 형성되는 것인 바이오칩 어레이를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 포획 분자를 바이오센서 표면에 부착하기 위한 간단한 2단계 화학적 공정을 제공한다. 상기 공정은 포획 분자를 표면 상에 지금까지 가능했던 것보다 높은 밀도와 재현성으로 화학흡착하기 위해 숙신이미드기를 각각의 말단에 갖는 호모이기능성 PEG 가교제를 제공한다. 상기 방법은 바이오에세이의 감도 및 선택성을 개선시킨다. 또한 제공되는 것은 바이오센서 표면을 경제적으로 높은 수율로 처리하는 프로토콜 및 장치이다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 스페이서 분자를 깨끗한 유리 표면에 부착하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 헤테로이기능성 시약, 예를 들면 3-아미노프로필 트리에톡시실란(APTS)과 호모이기능성 폴리머, 예를 들면 호모이기능성 숙신이미드 말단 기능화된 PEG 폴리머와의 비-대칭적 반응을 포함한다. 상기 반응은 물 없는 용매중에서 수행된다. 고 농도는 바람직한 이분자 반응에 사용된다. 본 발명은 또한 비용이 비싼 시약을 절약하기 위하여 유리 표면에 미처리된 시약의 소량을 적용하기 위한 장치로 확장한다.

도 1G를 참조하면, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 포획 분자(10)가 생체적합성 분자(80)로 작용하는 조합된 앵커/스페이서를 통해 유리 바이오센서 표면(20)에 고정되는 바이오센서를 제공한다.

도 1H를 참조하면, 생체적합성 분자(80)은 다른 분자(40)의 비특이적 흡착에을 방해하고, 또한 가교제로서 작용을 한다. 이것은 잠재적인 비특이적 흡착 자리를 더 감소시킨다. 이롭게, 과잉의 생체적합성 분자(80)은 밑에 있는 표면(20)을 노출시킴 없이 포획 분자(40)의 측면 간격(lateral spacing)을 제공한다. 적용된 포획 분자(10)의 농도는 표면 활성의 밀도를 결정한다. 작동시, 타켓 분자(70)은 포획 분자(80)을 통해 표면(20)에 결합된다.

도 2B 및 2C를 조합하여 참조하면, 본 발명의 특히 바람직한 구현예로서, 유리 표면(20)은 디메틸 설폭사이드(DMSO)중의 APTS(아미노프로필 트리메톡시실란)(200) 및 호모이기능성 PEG N-히드록시 숙신이미드 가교제(NHS)(210)의 예비처리된 용액으로 처리된다. NHS 가교제(210)은 각각의 말단에서 두 개의 NHS 기능을 갖는다 하나의 말단에서, 제 1 NHS 기능은 APTS(200)에 결합한다. 다른 말단에서, 제 2 NHS 기능은 아민-기능화된 압타머(220)에 결합한다. 양 경우 모두에서, 결합은 공유 결합을 통한다.

도 3은 APTS(200)과 NHS PEG(210)의 반응을 보여주는 NMR 스펙트럼이다. 보여진 분자는 그 반응의 결과이다.

본 발명을 구현하는 특히 바람직한 공정에서, 도 3과 관련하여 참조된 반응은 42 내지 48℃에서 DMSO 용액 중에서 APTS로부터 NHS-PEG-트리에톡시실란 형태의 헤테로이기능성 시약과 (a, w) NHS-PEG 2000, Rapp 폴리머 형태의 호모이기능성 PEG의 제조로 출발한다. DMSO중의 80mM 호모이기능성 NHS-PEG 300 마이크로리터는 DMSO 중의 120mM APTS 200 마이크로리터, DMSO 300 마이크로리터중의 APTS 6마이크로리터와 혼합된다. 이것은 양 물질 모두 48mM의 농도를 갖는 등몰 혼합물을 생성한다. 상기 혼합물을 46 내지 50℃ 사이에서 가열하고, 30 내지 60분 동안 반응하게 한다. 이어서 결과물은 60 내지 120분 동안 두 개의 예비처리된 유리 표면 사이의 좁은 틈으로 이동된다. 모세관 작용이 틈으로의 혼합물의 진입을 촉진하기 위해 틈이 채워질 때까지 사용된다. 상승된 온도에서 틈을 채우는 것이 바람직하다. 그렇지 않다면, 혼합물의 점도가 너무 높아진다. 표면은 1부의 농축된 황(Fluka)산과 2부의 과산화 수소(Fluka puriss)의 혼합물에 의해 수신간 동안 예비처리되고, 이어서 탈이온수로 세척된다. 황산과 과산화수소의 혼합물, 때때로 '피라니아 용액(piranha solution)'이라 불리는 것은 혼합 동안 끊는점까지 가열된다.

여전히 도 3을 참조하면, 30분 후에 수행된 NMR은 90% 이상의 아민기가 PEG 상에서 NHS 기와 반응하고, 유리된 APTS가 10%의 검출 역치(threshold)로 검출될 수 없다는 것을 보여준다. 미반응된 NHS-PEG와 호모이기능성 트리에톡시실란 PEG의 호모이기능성 부산물은 통계적으로 형성한다. 그러나, 이들이 화학흡착을 방해하지는 않는다. 이것은 NHS-PEG가 유리에 화학흡착할 수 없기 때문이다. 호모이기능성 트리에톡시실란 PEG는 NHS-PEG의 밀도를 약하게만 할 수 있고, 후속의 단백질 흡착 단계에서 Si-(OH)³에 소실될 것이다.

도 4A 내지 4C는 이전에 본 명세서에서 설명된 바와 같이 유리 기판(20)을 고농도의 상대적으로 비싼 링커/스페이서 생체적합성 분자로 처리하기 위한 유동 셀을 보여준다. 도 4A 및 4B를 참조하면, 표면(20)은 100 내지 300 마이크로미터 두께의 주변 가스켓(300)에 의해 분리되고 밀폐된다. 상기 가스켓(300)은 테플론으로 형성될 수 있다. 도 4C를 참조하면, 유동 셀은 이어서 150 마이크로리터의 부피를 갖는 하나의 면으로부터 모세관 힘에 의해 반응성 혼합물로 채워진다. 특히, 혼합물은 표면(20)과 가스켓(300)에 의해 한정된 사이의 개입된 틈새로 모세관 작용에 의해 들어간다. 따라서, 표면(20)이 처리된다.

이전에 본 명세서에 설명된 기술은 헤테로이기능성 시약이 원위치에서 제조되기 때문에 통상적인 기술보다 우수하다. 추가적인 정제가 요구되지는 않는다. 이것은 크로마토그래피와 같은 통상적인 기술에 의한 실란화된 PEG의 정제가 불가능하지는 않지만 매우 어렵기 때문에 특히 이롭다. 비-수성 조건은 APTS의 중합을 방해하고, 표면(20)의 정규적인 처리를 촉진한다. 시약의 원위치 제조는 저장에 기인하여 분해되거나 중합되지 않는 신선한 반응성 중간체를 제공한다. 50mM PEG 및 APTS의 혼합물중에서 고농도는 이분자(bimolecular) 반응 속도를 개선시킨다. 이것은 원치않는 소실 없이 시약의 제조를 허용한다. APTS보다 더 높은 농도의 NHS는 APTS와 NHS 기의 반응을 완결시키는 것을 돕는다. 모세관 틈은 확산 제한을 제거하는 것으로 표면 반응의 속도를 증가시킨다. 혼합물중에 실질적으로 변화가 없기 때문에, 표면(20)의 처리는 보다 균질하게 된다. 표면(20) 사이에서 표면 대 부피 비가 더 커지면서, 더 많은 중합 반응이 감소하고, 표면(20)과 트리에톡시실란의 반응이 우세하게 된다. 그렇지 않다면 이들은 CBQCA 또는 NHS-로드아민(rhodamine)을 통한 일차 아민의 검출과 같은 검출 스킴의 특이성을 감소시킬 수 있다. 혼합물중에 존재하는 낮은 수준의 APTS는 일차 아민이 검출되어지는 배경 수준을 현저하게 감소시킨다.

표면(20) 사이에서의 시약의 반응은 여과지에 의한 용액의 제거, 후속적으로 세번의 DMSO로의 세척으로 멈추어진다. 세척은 미반응된 헤테로이기능성 분자를 중합 생성물과 호모이기능성 부산물과 함께 제거한다. 이어서, 표면(20)은 해체되고, 미량의 DMSO를 제거하기 위해 질소를 분출시켜 건조한다. 포획 분자(10)은 이어서 신선한 NHS-활성화된 표면(20)에 부착된다. 선택적으로, 표면(20)은 건조 아르곤중에서 수일 동안 저장될 수 있다.

이전에 본 명세서에서 설명된 바와 같이 처리된 유리 표면(20)은 터미날 아미노기(5' 또는 3' 말단)을 갖는 올리고뉴클레오티드, 단백질, 및 기타 NH2-기능화된 분자를 고정할 수 있다. 특히 바람직한 본 발명의 구현예에서, 화학흡착은 아미노-기능화된 화합물의 수용액으로 NHS-활성화된 표면(20)에 적용된 PDMS 마이크로유체(microfluidic) 네트워크를 채우는 것으로 수행된다. 올리고뉴클레오티드는 10% DMSO 및 15 내지 20% PEG(MW=1000)을 포함하는 수성 용액중에서 표면(20)에 화학흡착된다. 20mM 올리고뉴클레오티드의 농도는 화학 반응 동안 올리고뉴클레오티드에 의한 표면(20)의 특히 균질한 커버리지(coverage)를 제공하고 건조에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다.

도 5A 내지 5D는 본 발명을 구현하는 표면 기능화를 사용하여 성취될 수 있는 개선된 균질성을 예시한다. 도 5A는 NHS-PEG-APTS 접합 스페이서에 의한 표면에 화학흡착된 패턴화된 TAMRA 라벨화된 18-메르(mer) DNA 올리고머 분자의 형광 이미지를 보여준다. 보다 밝은 스트립은 화학흡착된 올리고머 분자를 보여준다. 도 5B는 인트라스폿 표준 편차가 2% 미만이고 인터스폿 표준 편차가 4% 미만임을 보여주는 도 5A의 표면으로부터의 형광 카운트 플롯이다. 이 경우의 이미지 상에 분포된 45개의 별도 영역상에서 평균된 형광 세기는 9748+-350 카운트이다. 분산(variability)은 4% 미만이다. 하나의 영역에서, 600 픽셀이 평균이였다. 패터닝의 정확성은 세척 및 혼성 사이클 동안에서 조차 안정하게 남아있는다.

도 5C 및 5D를 참조하면, 이것은 그안의 이미지와 그래프에 의해 보여진다. 보다 밝은 사각형 영역은 수직의 트랙에 나란한 압타머의 패턴화된 화학흡착에 의해 및 간격을 두고 떨어져 있는 수평의 트랙에 나란한 라벨화된 16-메르 올리고머 프라이머의 패턴화된 혼성화에 의해 만들어진다. 9 영역 이상에서 평균화된 형광 이미지는 21539+-1085 카운트이다. 분산은 5%이다. 하나의 영역에서, 784 픽셀이 평균이였다.

본 발명의 바람직한 구현예가 실시예를 대신하여 본 명세서에 설명되었다. 당업자들은 본 발명의 가능한 더 많은 구현예를 이해할 것이다.

Claims

표면과, 표면 기에 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성(homobifunctional polymer) 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 바이오분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 바이오분자는 아민 기능화된 것인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 바이오분자는 핵산 압타머 유도체를 포함하는 것인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 과량의 호모이기능성 폴리머를 더 포함하는 것인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 헤테로이기능성 시약은 표면에 노출되기 이전에 호모이기능성 폴리머와 혼합되는 것인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 표면은 유리 표면인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 표면은 금속 표면인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 헤테로이기능성 시약은 아미노알킬 트리알콕시실란인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 헤테로이기능성 시약은 3-아미노프로필 트리에톡시실란인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 헤테로이기능성 시약은 알킬티올인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 헤테로이기능성 시약의 제 2 기능성 기는 호모이기능성 폴리머의 하나의 기능성 기와 그 사이에서 공유 결합을 형성하기 위해 반응하는 것인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 11항에 있어서, 상기 호모이기능성 폴리머의 기능성 기는 N-히드록시 숙신이미드 기인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 호모이기능성 폴리머는 호모이기능성 폴리에틸렌 글리콜인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 바이오분자는 호모이기능성 폴리머의 하나의 기능성 기와 그 사이에서 공유결합을 형성하기 위해 반응하는 것인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 바이오분자 및 호모이기능성 폴리머 사이에 형성된 공유 결합은 아미드 결합인 표면 상에 바이오분자 단층의 제조방법.
표면과, 표면 기에 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 바이오분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법에 의해 형성된 표면층을 갖는 바이오센서.
기질상에 바이오분자의 패턴화된 증착을 포함하고, 여기서 패턴화된 증착은 표면과, 표면 기에 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 바이오분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법에 의해 형성되는 것인 바이오센서 어레이.
표면과, 표면 기에 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 바이오분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법에 의해 형성된 표면층을 갖는 바이오칩.
기질상에 바이오분자의 패턴화된 증착을 포함하고, 여기서 패턴화된 증착은 표면과, 표면 기에 공유결합을 형성할 수 있는 제 1 기능성 기와 호모이기능성 폴리머와 공유결합을 형성하는 제 2 기능성 기를 갖는 헤테로이기능성 시약의 용액을 반응시켜 자가조립된 단층을 얻는 단계; 및 이어서 단층을 바이오분자와 반응시키는 단계를 포함하는 표면 상에 바이오분자 단층을 제조하는 방법에 의해 형성되는 것인 바이오칩 어레이.