JP2015507199A - 分析物の検出および測定のための方法および装置 - Google Patents
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Abstract
Description
[0001] この出願は2012年1月31日に出願された米国仮出願シリアル番号61/593,054の利益を主張し、その全開示は参照により明確に本明細書に援用される。
[0002] 本発明は一切の政府支援なしでなされ、政府は本発明において権利を有しない。
[0003] 本出願はEFS−webを介して提出された配列リストを含み、それは参照によりそのまま本明細書に援用される。2013年1月31日に作成されたASCIIコピーは420_53354_SEQ_LIST_D2012−15.txtと名付けられており、大きさは3,888バイトである。
[0004] 本発明は、アプタマーで官能化された(functionalized)表面プラズモン共鳴(SPR)センサー、その同じものを作る方法および用いる方法に関する。
[0012] 特定の態様において、その標的実体は、大きな生体分子、小さな生体分子、有機分子、小分子、核酸、金属イオン、タンパク質、酵素、ペプチド、薬物、色素、癌細胞、ウイルス、ホルモン、または微生物の1以上である。特定の態様において、そのタンパク質は血液タンパク質である。
[0014] 特定の態様において、そのアプタマープローブにはその支持体およびそのアミン部分の間のSAMリンカーが含まれる。
[0016] 特定の態様において、そのセンサーはそのリンカーの特性に基づいてpM〜nMの検出が可能である調整可能な検出可能範囲を有する。
[0019] 特定の態様において、その方法は1分未満の応答時間を有する。特定の態様において、その方法はおよそ周囲温度において1分未満の応答時間を有する。
[0025] 別の観点において、本明細書において、糖尿病療法指導における適用のための糖化タンパク質の超高感度かつ選択的な検出および測定のための方法が提供される。1つの特定の態様において、その方法には表面プラズモン共鳴分光法の使用が含まれる。
[0029] さらに別の観点において、本明細書において、既存の大規模臨床計測手段と類似の性能を達成することができる、頑強、低費用、かつ携帯式の感知プラットフォームが提供される。加えて、その統合されたプラットフォームは、インスリン依存性糖尿病療法へのコンプライアンスを評価することができる診断装置において有用である。その統合されたプラットフォームは、医師の診療室において、または家庭環境においてのどちらでも用いることができる低費用な手持ち式の装置を可能にする。その統合されたプラットフォームは収集されたデータの即時分析も提供し、そうして介護者および/または患者がその患者の長期グルコース調節コンプライアンスを評価することを可能にする。
[0034] 特定の態様において、連結は二成分SAMおよび還元脱着プロセスによる。
[0037] 特定の態様において、そのSAM連結はチオールSAM固定法を用いることを含み、ここでチオール化合物はそのアプタマーと安定な結合を形成することができるカルボキシ部分を有する。
[0039] 特定の態様において、そのSAM連結はジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を用いて形成され、ここでPEG3はタンパク質の非特異的吸着を防ぎ、ここでDTSP上のカルボキシル部分はそのアプタマーと安定な結合を形成する。
[0041] 特定の態様において、その二成分SAMチオール溶液は、3−メルカプトプロピオン酸(MPA)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)の1mMエタノール溶液をその二成分SAMの総濃度を約1mMで維持しながら混合することにより調製される。
[0043] 特定の態様において、その方法はさらに、還元脱着によりMPAを排除してPEG3を未変化(intact)のままにし、そしてジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)をそのアプタマー上のアミノ基と共有結合させることを含み、ここでそのアプタマーはDTSPにのみ結合し、ここで一方でPEG3は結合を一切形成しない。
[0045] 特定の態様において、その表面は約5nM〜約1000nMの範囲の最適な動力(dynamic)を有する。
[0047] 特定の態様において、その混合された長さの層は3−メルカプトプロピオン酸(MPA)と組み合わせられた11−メルカプトウンデカン酸(MUA)を含む。
[0052] 特定の態様において、その分析物は血液または血清中のタンパク質の糖化形態を含む。
[0054] 特定の態様において、その分析物は、ヒトヘモグロビン、ヒト血清アルブミン(HSA)が含まれるアルブミン、免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンM(IgM)、フィブリノーゲン、および/またはその断片の1以上の非糖化および/または糖化形態を含む。
[0057] 特定の態様において、その分析物は少なくとも1種類の第1分析物、少なくとも1種類の第2分析物および少なくとも1種類の第3分析物を含み、その第1、第2および第3分析物のそれぞれは異なる半減期を有し、その方法はさらに、その第1、第2および第3分析物を定量化して1以上の期間にわたるその第1、第2および第3分析物のレベルに関する遡及判定を提供することを含む。
[0059] 特定の態様において、その方法は過去の平均グルコースレベルをモニタリングするために有用であり、その方法は以下の工程を含む:本明細書で記述される方法により形成されたセンサーを血液試料と接触させ;その血液中のそのタンパク質の糖化形態の量を決定し;そしてその血液試料中に糖化形態で存在するそのタンパク質の量を、所与の時間フレームに関して対照グルコースレベルに関連付ける。
[0061] 別の観点において、本明細書において、1種類以上の分析物の存在を決定するためのセンサーが提供され、ここでそのセンサーは本明細書で記述される方法のいずれか1つにより形成される。
[0063] 特定の態様において、そのセンサーは、大きな生体分子、小さな生体分子、有機分子、小分子、核酸、金属イオン、タンパク質、酵素、ペプチド、薬物、色素、癌細胞、ウイルス、ホルモン、または微生物から選択される1種類以上の分析物と相互作用することができる。
[0065] 特定の態様において、そのタンパク質は血液タンパク質である。
[0067] 特定の態様において、そのセンサーは1分未満の応答時間を有する。
[0069] 別の観点において、本明細書において、本明細書で記述されるようなセンサーおよびそのセンサーを含有する少なくとも1個の容器を含む、1種類以上の分析物の検出のためのキットが提供され、ここで試料をその容器に添加することができる。
[0074] 特定の態様において、その連結は二成分SAMおよび還元脱着プロセスによる。
[0077] そのSAM連結は、そのアプタマーと安定な結合を形成することができるカルボキシ部分を有するチオール化合物を含む。
[0079] 特定の態様において、そのSAM連結はジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を用いて形成され、ここでPEG3はタンパク質の非特異的吸着を防ぎ、ここでDTSP上のカルボキシル部分はそのアプタマーと安定な結合を形成する。
[0081] 特定の態様において、その二成分SAMチオール溶液は、3−メルカプトプロピオン酸(MPA)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)の1mMエタノール溶液をその二成分SAMの総濃度を約1mMで維持しながら混合することにより調製される。
[0083] 特定の態様において、そのMPAが還元脱着により排除されてPEG3が未変化のままになっており;そしてジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)がそのアプタマー上のアミノ基と結合しており、そしてPEG3は結合を一切形成しない。
[0085] 特定の態様において、その表面は約5nM〜約1000nMの範囲の最適な動力を有する。
[0087] 特定の態様において、その混合された長さの層は3−メルカプトプロピオン酸(MPA)と組み合わせられた11−メルカプトウンデカン酸(MUA)を含む。
[0089] 特定の態様において、そのアミノ酸はシステインを含む。
[0091] 特定の態様において、そのセンサーは血液中のタンパク質の糖化形態からなる分析物を感知するために設計されている。
[0093] 特定の態様において、その分析物はヒトヘモグロビン、ヒト血清アルブミン(HSA)が含まれるアルブミン、免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンM(IgM)、フィブリノーゲン、および/またはその断片の1以上を含み、その分析物は糖化および/または非糖化形態である。
[0095] 特定の態様において、その第1分析物はヘモグロビンからなり、その第2分析物は免疫グロブリンM(IgM)からなり;そして、ここでその第1分析物または第2分析物のいずれかが糖化または非糖化形態で存在する。
[00100] 特定の態様において、そのアプタマーには特定の分析物と相互作用することができるヌクレオチド配列が含まれる。
[00103] 特定の態様において、その分析物は血液タンパク質である。
[00105] 特定の態様において、そのセンサーは1分未満の応答時間を有する。
[00107] 特定の態様において、そのセンサーにはアプタマーが含まれ、ここでそのアプタマーはSEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14および15のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有するDNA配列を含む。
a)核酸のプールに単一部位標的タンパク質複合体を添加し、ここでそのプール中に存在する単一標的部位結合アプタマーおよび非標的タンパク質結合アプタマーの両方がその単一部位標的タンパク質複合体に結合し、単一標的部位結合アプタマー+非標的タンパク質結合アプタマー+単一部位標的タンパク質複合体を形成し;
b)その単一標的部位結合アプタマー+非標的タンパク質結合アプタマー+単一部位標的タンパク質複合体をそのプールから分離し;
c)その単一標的部位結合アプタマーおよびその非標的タンパク質結合アプタマーをその単一部位標的タンパク質複合体から溶離し;
d)前の工程の溶離液に非標的タンパク質複合体を添加し、ここで工程c)の溶離液中に存在する非標的タンパク質結合アプタマーはその非標的タンパク質複合体に結合し、非標的タンパク質結合アプタマー+非標的タンパク質複合体を形成し;
e)その非標的タンパク質結合アプタマー+非標的タンパク質複合体を前の工程の溶離液から分離してその溶離液中の単一標的部位結合アプタマーを残し;そして、
f)その単一標的部位結合アプタマーをその溶離液から分離し、場合によりさらにその単一標的部位結合アプタマーを増幅する。
[00114] 特定の態様において、その非標的タンパク質複合体は固体支持体上に固定されている。
[00116] 別の観点において、本明細書において、糖化ヘモグロビンに結合するアプタマーが提供され、ここでそのアプタマーはSEQ ID NO:4および5からなる群から選択される核酸配列を含む。
[00118] 特定の態様において、そのアプタマーは100nM以下のヒトヘモグロビンに関する解離定数を有する。
[00121] 別の観点において、本明細書において、SEQ ID NO:4および5のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有し、ヒト糖化ヘモグロビンに結合するアプタマーが提供される。
[00125] 特定の態様において、そのアプタマーは100nM以下のヒトヘモグロビンに関する解離定数を有する。
[00128] 別の観点において、本明細書において、SEQ ID NO:6および7のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有し、ヒト非糖化ヘモグロビンに結合するアプタマーが提供される。
[00132] 特定の態様において、そのアプタマーは100nM以下のヒト糖化血清アルブミンに関する解離定数を有する。
[00135] 別の観点において、本明細書において、SEQ ID NO:3、8および9のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有し、ヒト糖化血清アルブミンに結合するアプタマーが提供される。
[00139] 特定の態様において、そのアプタマーは100nM以下のヒト非糖化血清アルブミンに関する解離定数を有する。
[00142] 別の観点において、本明細書において、SEQ ID NO:10、11、12、13、14および15のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有し、ヒト非糖化血清アルブミンに結合するアプタマーが提供される。
[00145] 特定の態様において、その修飾は、糖の位置における化学的置換、ヌクレオチド間結合における化学的置換、および塩基の位置における化学的置換からなる群から選択される。
[00147] 別の観点において、本明細書において、少なくとも1種類の本明細書で記述されるようなアプタマーを含むキットが提供される。
[00149] 特定の態様において、そのPEG化されたアプタマー分子には(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)が含まれる。
[00152] 特定の態様において、その修飾は、糖の位置における化学的置換、ヌクレオチド間結合における化学的置換、および塩基の位置における化学的置換からなる群から選択される。
[00154] 1種類以上の本明細書で記述されるアプタマーを含むキット。
[00174] この明細書において引用される全ての刊行物、公開された特許文書、および特許出願は、本発明が属する技術分野(単数または複数)における技術のレベルを示している。本明細書で引用される全ての刊行物、公開された特許文書、および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、公開された特許文書、または特許出願が具体的に、かつ個別に参照により援用されることが示されたのと同程度まで参照により本明細書に援用される。
[00177] 本明細書で用いられる際、用語“含む(comprises)”、“含むこと(comprising)”、“含まれる(includes)”、“含まれること(including)”、“含有する(contains)”、“含有すること(containing)”、およびそれらのあらゆる変形は非排他的な包含を含むことが意図されており、従って、要素もしくは要素のリストを含む、要素もしくは要素のリストが含まれる、または要素もしくは要素のリストを含有する問題のプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、または組成物には、それらの要素のみが含まれるのでなく、問題のそのようなプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、または組成物に明確に列挙されていない、または本来備わっていない他の要素も含まれてよい。
[00195] 記述された方法および装置は、所望の試験環境中の、および微妙な(sensitive)濃度の糖化タンパク質を検出することができる所望の高い感度および特異性の両方を有するシステムを提供する。
[00202] その方法はさらに、異なるタイプのタンパク質、例えば糖化ヘモグロビンおよび血液タンパク質の他の糖化形態の評価を可能にする。
[00205] 本明細書で記述される方法は、異なるタイプのアプタマーを検出するために有用である。1態様において、ヘモグロビン、アルブミン、およびIgMの糖化/非糖化タンパク質に特異的なオリゴヌクレオチド(アプタマー)を単離および同定するために、指数関数的増幅によるリガンドの系統的進化(SELEX)濃縮プロトコルを用いることができる。
[00209] タンパク質の検出のため、自己組織化単分子膜(SAM)を用いて特異的なアプタマーを金SPR感知表面に付着させる。SPR分光法自体は、伝導体および誘電体の間の界面において起こる現象に関連している。この界面において、電子構造における電荷密度の振動である表面プラズモンが存在することができる。これらの表面プラズモンは、可視〜近赤外スペクトルにおける光により最も一般的に励起される。この励起は、連続的な金属表面における自由に伝播する表面プラズモンとして、または金属に基づくナノ粒子構造の使用による局在性の作用としてのどちらかで起こり得る。本明細書で記述される1態様において、自由に伝播する表面プラズモンのアプローチが用いられる。
[00223] 材料
同定されたアプタマーは、15bpのアプタマー(APT1):
[00224] トシル基活性化(Tosylactivated)磁性ビーズ(MB)をInvitrogen(カリフォルニア州カールスバッド)から購入した。全ての他の化学物質をSigma Aldrich(カリフォルニア州カールスバッド)から入手可能な最高純度で購入した。アプタマー溶液を1M pH8リン酸緩衝液を用いて調製した。3−メルカプトプロピオン酸(MPA)溶液をエタノール中で調製した。タンパク質試料溶液を5mM KClおよび1mM MgCl2を含む0.1M pH7.2 PBS緩衝溶液を用いて調製した。用いたリン酸は100mMであった。全ての他の溶液を脱イオン(DI)水中で調製した。
[00226] SPRの測定は、商業グレードのSensiQ Discoveryシステム(ICx Technologies、バージニア州アーリントン)を25℃で用いて実施された。このセンサーはクレッチマン配置に基づいており、ここでプリズムにより統合された発光ダイオード(LED)からの光はまず偏光し、次いで金表面から内部反射される。光反射の角度および相対強度をフォトダイオードアレイを用いて測定した。試料溶液を感知表面に適用した際、SPRプロフィールの最小値(SPR角としても知られている)が装填された試料の屈折率の関数としてシフトし、リアルタイムの屈折率の読みを与えた(しかし、単独ではそのセンサーは所与の標的に一切特異的/選択的ではない)。そのSPR応答プロフィールはSensiQソフトウェアにより記録され、次いでMATLAB(登録商標)内で処理された。
[00233] EIS測定
[00234] それぞれの官能化された層の固定の成功を、EIS測定により確証した。図2は、異なる電極でのインピーダンススペクトルのナイキストプロットを示す。むき出しの金の電極は高い周波数において非常に小さいサイクルを表し、これは電解質溶液中で溶解したレドックスプローブへの非常に低い電子移動抵抗を示している(曲線A)。MPAを電極上に固定し、EAおよびPPAで処理した際、電子移動抵抗(Ret)は125Ωに増大した(曲線B)。次いで、5μMのAPT1アプタマーを添加し、SAMと結合させた際、Retは600Ωに増大した(曲線C)。この態様において、その金電極上の反応部位をEA(エタノールアミン)によりブロッキングしてその金表面上へのアプタマーの非特異的吸着を防ぎ、そうしてそのアプタマーがSAMにのみ付着することを確実にした。そのRetの増大は、その固定されたアプタマーおよびそのレドックスプローブの間の静電反発により引き起こされ、これは界面の電子移動に関する障壁をもたらす。これらの結果は、そのSAM層のその金表面上への固定の成功およびそのアプタマーのそのSAMへの安定な結合を示している。
[00236] アプタマーとカップリングしたMBを完全に洗浄した後、トロンビンを添加し、濃度変化をカルボキシル修飾SPRセンサーを用いて測定した。屈折率は添加されたトロンビンの濃度変化によってのみ制御される。他の実験変数、例えばタンパク質変性および温度はSPRの結果に小さな影響しか有さず、従ってその結果に影響を及ぼすとは考えられなかった。
[00241] 2種類の異なるアプタマーを金表面上に固定し、それぞれ1つずつの結合性能を比較した。参照のため、異なるトロンビン濃度(5nM、25nM、50nM、250nM、1000nM、2000nM)の試料を個々に、むき出しのAuのセンサー、APT1センサーおよびAPT2センサーそれぞれの上に装填した。次いで第2の実験を同じトロンビン濃度を用いて実施した;しかし、400nM BSAの混乱させる構成要素がそれぞれのトロンビン試料に比較のために添加された。図4において“トロンビンのみ”の実験に関して示されているように、SPRシフトはむき出しのAuのセンサー表面に関して比較的高いトロンビン濃度に関してさえも非常に低かった。
[00245] MB結合試験において、APT1はAPT2よりもわずかに高い結合能力を有し、それはその官能化されたセンサーの感度の点でSPRの結果と一致している。理論により束縛されることを望むわけではないが、この態様において、これはより小さいアプタマーはその標的タンパク質の結合部位に接近するより大きな可能性を有するためである可能性があると信じられている。また、特定の態様において、より複雑な二次構造を有するより大きいアプタマーは標的化合物との結合を形成するために余分な空間的柔軟性を必要とする可能性がある。
[00251] そのセンサーの可逆性を試験するため、固定された試料濃度をそのセンサーに10回繰り返し装填した。そのセンサーの再生はPPAによりなされた。50nM、250nMおよび500nMのトロンビン濃度を用いた平均SPR応答を標準偏差に関するエラーバーと共に図6において示す。全てのデータは新しく調製された感知スライドから得られた。SPR応答は一般に同じ試料濃度に関してそれぞれの装填に関して約0.5%減少した。全ての感知スライドは、10回目の装填後に元のSPRシフト応答の95%より多くを維持していた。また、2回目の試料の装填は通常その後の装填と比較した場合に最大の応答変化を有していた。実験の要求に応じて、より長いPPA注入時間によりそのセンサーの回復率を増大させることができる。BSAの出現はそのセンサーの感度を低下させた(例えば、図6において、BSAの出現はその応答曲線においてわずかに傾きを低減した)が、それはそのセンサーの可逆性には影響を及ぼさなかった。図6は、センサーが50nM〜500nMの試料の範囲においてBSAの出現ありおよびなしで線形応答を維持したことも示している。
[00253] センサーの他の態様
[00254] 別の態様において、そのセンサーには混合された長さのスペーサー層が含まれることができる。1つの限定的でない例において、その混合された長さの層はMPAと組み合わせられた11−メルカプトウンデカン酸(MUA)であることができ、それは特定の態様において感度および特異性を増大させるために用いることができる。
[00256] 別の態様において、非特異的なタンパク質結合を低減するために、エチレンオキシドのような親水性の基をそのアプタマーの5c末端上に挿入することができる。
[00259] 異なる血液タンパク質の検出に関して、目的の標的タンパク質に特異的に直接結合するアプタマーを見つけるため、SELEX手順を用いることができる。次いで、ほとんどあらゆるタンパク質に関する標的特異的なセンサーを形成するため、その開発されたアプタマーを次いでアミン末端処理し、本明細書で記述される方法の1つを用いて金表面上に固定することができる。従って、アプタマーを抗体を超える利点を伴って特定の化合物を標的とするようにSELEXにより生成することができる。
[00262] SPRアプタマーに基づく糖化アルブミンタンパク質の感知
[00263] 糖化ヒト血清アルブミン(HSA)の検出および定量化の両方を行った。開発され、用いられたアプタマー(チオール化、非還元)は、
[00264] 金スライドを物理蒸着(PVD)により調製し、予め汚れを除いた顕微鏡用カバースライド上に1nmのチタンの層および50nmの金の層を形成した。次いでその金スライドを大量のDI水およびエタノールにより洗浄した。その金スライドを使用前に窒素ガス中で乾燥させた。
[00270] アプタマーを自己組織化単分子膜(SAM)に付着するように開発した。特定の態様に関して、タンパク質ヘモグロビン、アルブミン、およびIgMは、それぞれの半減期が血糖管理における短期、中期、および長期の履歴にわたる情報を提供するため、有用である。一部の一般的な血液タンパク質に関する特性の要約を下記の表1において提供する。
[00275] 糖化タンパク質の総タンパク質に対するパーセント比の測定は、所与の時間窓にわたる平均血中グルコースに関連していた。
[00278] 次いで同定されたアプタマーを最初に結合特性、感度、特異性、および選択性が含まれる一般的な性能に関して特性付けることができる。下記の表2において示されているのは、性能レベルに基づく標的の明細(specifications)の例である。
[00281] また、特定の態様において、その糖化および非糖化特異的アプタマー候補をCOOHで修飾された金SPR表面上への固定を促進するための5’−NH2−C6アタッチメントを用いて修飾することができる。次いでSPR測定を用いてアプタマー候補に関するそれぞれの親和性定数を特性付ける。
[00286] 上記で記述された連結法に加えて、用いることができる別の方法には、二成分自己組織化単分子膜(SAM)および還元脱着プロセスによる連結が含まれる。SAMの充填密度およびSAMの長さはSPRシグナルに影響を及ぼすため、その二成分SAMの密度および長さを還元脱着プロセスを用いて調節することができる。
[00295] サイクリックボルタンメトリー(CV)および電気化学インピーダンス分光法(EIS)を用いて固定されたSAMの表面被覆およびその試料の酸化還元応答を測定することができる。その表面組成物を吸着されたチオールに関するサイクリックボルタモグラムのピーク面積から概算することができる。修飾された電極上に沈着した二成分SAMの応答を、未修飾の電極の応答と比較することができる。
[00299] HbA1c、アルブミン、およびIgMの糖化/非糖化タンパク質の検出のためのSPR感知プラットフォームは、最初に既知の標的タンパク質比率を有する生理食塩水緩衝液を用いる試験において較正することができる。それぞれの試料溶液を、固定されたレベルの総タンパク質に関して、血液中で見られる比率レベルと比較して妥当な比率レベルで調製することができる(表1参照)。
[00302] 実際の血清における性能を評価するため、糖尿病でない源からの血清を利用することができる。その血清試料を分析して、標準的な臨床試験により(両方のタンパク質標的に関する)糖化対総タンパク質のそれぞれの割合を決定することができる。
[00305] 糖化および/または非糖化タンパク質部位に対して標的化されたアプタマーの同定のための向上したSELEX法
[00306] 糖化タンパク質部位への親和性を有するアプタマーの同定を可能にするため、SELEXプロトコルを向上させた。この向上したSELEXプロトコルは、糖化タンパク質の総タンパク質に対するパーセント比の決定を可能にした。
[00310] タンパク質分子(例えばアルブミン)は糖化に関して利用可能な多数の部位を有する。糖化レベルは通常総タンパク質レベルに関する糖化されている所与のタンパク質の濃度の百分率を指し、一方で糖化率は単一のタンパク質分子内のどれだけ多くの部位がグルコースまたはグルコース誘導体に結合しているかを指す。3D立体構造および電荷分布は高度に糖化されたタンパク質分子および非糖化タンパク質分子の間で著しく異なっているが、軽度に糖化されたタンパク質分子(すなわち単一の糖化点)および非糖化タンパク質分子の間では非常に類似している。従って、非糖化形態に対して低い親和性を有する高親和性単一部位特異的糖化タンパク質結合アプタマーを開発することは非常に挑戦的である。
[00313] その“アプタマー−糖化タンパク質標的MB”複合体を最初のDNAプールから分離する。
[00317] それに続く工程において、その“選択的な”アプタマーをその“非糖化タンパク質標的MB”複合体から溶離する。
[00322] 有用なアプタマーの例が下記に示されており、ここでXXXおよびYYYは追加の結合基、例えばビオチン、チオール、アミン等のいずれか1つ以上を指し、それは所与の自己組織化単分子膜(SAM)の開発を促進するために用いることができる。
[00324] 非糖化ヘモグロビンアプタマー
[00325] 糖化:ヒト血清アルブミン(HSA)アプタマー
[00326] 非糖化:ヒト血清アルブミン(HSA)アプタマー
[00327] 実施例5
[00328] 標的特性に基づいて感度および選択性を最適化するためのSAMを用いる表面官能化法
[00329] アプタマーの可動化のための二成分SAM形成の感度および選択性はさらに高めることができる。例えば、連結の間隔ならびにアプタマーおよびSPR表面の間の距離を調節するため、2つの異なるタイプの自己組織化チオール分子をその表面上に沈着させる。11−メルカプトウンデカン酸(SH−(CH2)5−COOH、MUA)およびメルカプトプロパノール(SH−(CH2)2−OH、MPL)の1mMエタノール溶液を別々に調製する。それぞれの溶液を、その2つの構成要素の総濃度を1mMで維持しながら1:1の体積比で混合する。MUAおよびMPLの二成分SAMが金表面上に、その金表面をその混合されたチオール溶液中に1時間浸すことにより形成される。次いで、その金表面を続いてエタノールおよびDI水を用いてすすぐ。
[00334] 試料中に存在する混乱させる物質の作用を低減するための方法
[00335] その官能化プロセスの一部として、MPL層は本質的に親水性である。この特性は、タンパク質のその表面への非特異的吸着を防ぐことができる。別の態様において、そのアプタマー認識要素は、伸長された連結のアプローチにより、(なお所望の感度を維持しながら)通常のSPR感知範囲を超えて伸ばすことができる。この態様において、チオール類に関するような終結(terminations)により多数の連結を得ることができる。その終結の間で、その表面を金ナノ粒子溶液に曝露することにより金ナノ粒子界面を作ることができる。このナノ粒子カップリングは、そのアプタマー結合応答をSPRセンサーにより通常のSPR検出限界を超えた分離距離において検出することを可能にすることができる。
[00339] バイオマーカーの検出
[00340] 本明細書で記述される方法およびプラットフォームは、疾患の診断および評価のためのバイオマーカーの検出の分野においても有用である。
[00346] キット
[00347] 本明細書で記述されるセンサーは、部品のキットの形態で提供することができる。そのようなキットには、診断キット、バイオマーカー発見キット、環境試験キット、生物災害または生物兵器検出キット、および医学または分析化学の適用において標的を検出するためのキットが含まれるが、それらに限定されない。限定的でない例として、そのアミン末端アプタマーは単独の分子として含まれることができ、または既に支持体に付着していることができる。追加の構成要素が含まれることもでき、それはマイクロ流体チップ、参照標準、および当業者が本開示を読めば同定可能である追加の構成要素を含むことができる。また、そのキットの構成要素は、本明細書で開示される方法を実施するため、適切な説明書および他の必要な試薬と共に提供することができる。一部の態様において、そのキットは別々の容器中にその組成物を含有することができる。そのアッセイを実施するための紙または電子支持体、例えばテープまたはCD−ROM上の説明書、例えば書面の説明書または音声の説明書もそのキット中に含まれることができる。そのキットは、用いられる個々の方法に応じて、他の包装された試薬および物質(例えば洗浄緩衝液等)も含有することができる。
Claims (133)
- 1種類以上の分析物に関するセンサーの感度および/または選択性を最適化するための方法であって、以下の工程:
1タイプ以上のアプタマーを自己組織化単分子膜(SAM)連結を有する支持体に連結し、該SAM連結は該支持体上に官能化された表面を形成するための所望の連結間隔および/または連結長を有し、
該所望の連結間隔および/または連結長は、表面プラズモン共鳴(SPR)、ラマン分光法、または蛍光分光法の感度および選択性の少なくとも1つを分析物および/またはアプタマーの特性に基づいて最適化するように選択される;
を含む、前記方法。 - SAM連結の少なくとも1つの充填密度および/または長さが表面プラズモン共鳴(SPR)シグナルに影響を及ぼす、請求項1に記載の方法。
- 連結が二成分SAMおよび還元脱着プロセスによる、請求項1に記載の方法。
- 脱着プロセスが、支持体の官能化された表面をタンパク質吸着に耐性の物質に曝露して該官能化された支持体上でのタンパク質の非特異的な吸着を防ぐことを含む、請求項3に記載の方法。
- タンパク質吸着に耐性の物質が(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を含む、請求項4に記載の方法。
- SAM連結が、アプタマーと安定な結合を形成することができるカルボキシ部分を有するチオール化合物を含む、請求項1に記載の方法。
- チオール化合物がジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)を含む、請求項6に記載の方法。
- SAM連結がジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を用いて形成され、
ここでPEG3はタンパク質の非特異的吸着を防ぎ、そして
ここでDTSP上のカルボキシル部分はアプタマーと安定な結合を形成する、請求項1に記載の方法。 - 二成分SAMチオール溶液が該SAM連結において用いられる、請求項1に記載の方法。
- 二成分SAMチオール溶液が、3−メルカプトプロピオン酸(MPA)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)の1mMエタノール溶液を該二成分SAMの総濃度を約1mMで維持しながら混合することにより調製される、請求項9に記載の方法。
- MPAおよびPEG3が約20:80、約50:50または約80:20の比率で存在する、請求項10に記載の方法。
- さらに以下の工程:
還元脱着によりMPAを排除してPEG3を未変化のままにし;そして
ジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)をアプタマー上のアミノ基と結合させ、一方でPEG3は結合を一切形成しない;
を含む、請求項10に記載の方法。 - アプタマーが3−メルカプトプロピオン酸(MPA)上に固定されることができるアミン修飾アプタマーを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 表面が約5nM〜約1000nMの範囲の最適な動力を有する、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載の方法。
- センサーが、混合された長さのスペーサー層を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 混合された長さの層が、3−メルカプトプロピオン酸(MPA)と組み合わせられた11−メルカプトウンデカン酸(MUA)を含む、請求項15に記載の方法。
- SAM連結が、支持体の表面に直接結合することができる水溶性チオール含有アミノ酸により形成される、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載の方法。
- アミノ酸がシステインを含む、請求項17に記載の方法。
- 1以上の分析物のためのセンサーを形成するための方法であって、以下の工程:
a)3−メルカプトプロピオン酸(MPA)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)からなる二成分を支持体上に吸着させ;
b)工程a)の支持体からMPAを還元脱着させ;
c)工程b)の支持体上にジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)を形成し;
d)少なくとも1タイプのアプタマーを工程c)の支持体上で固定し;そして、
e)工程d)の支持体上のPEG3から未結合のアプタマーを除去し、そうして該支持体のDTSP層に付着したアプタマーを残す;
を含む、前記方法。 - 1以上の分析物のためのセンサーを形成するための方法であって、以下の工程:
a)3−メルカプトプロピオン酸(MPA)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)からなる二成分をエタノール溶液中で金表面支持体上に吸着させ;
b)0.5M KOH溶液中で工程a)の支持体からMPAを還元脱着させ、ここでMPAおよびPEG3の相分離した二成分自己組織化単分子膜(SAM)中の吸着したMPAは、該溶液に−1.2Vの電位を30分間かけることにより選択的に還元され;
c)PEG3層を上に有する工程b)の支持体を1mM DSTP溶液中に浸漬してその上にDTSP層を形成し;
d)少なくとも1タイプのアプタマーを工程c)の支持体上で固定し;そして
e)工程d)の支持体上のPEG3からアプタマーを除去し、そうして該支持体のDTSP層に付着したアプタマーを残す;
を含む、前記方法。 - 支持体が金表面を有する、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 分析物が血液中のタンパク質の糖化形態を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 総血清タンパク質レベルから特定の糖化タンパク質の割合を決定することを含む、請求項22に記載の方法。
- 分析物が、ヒトヘモグロビン、ヒト血清アルブミン(HSA)が含まれるアルブミン、免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンM(IgM)、フィブリノーゲン、および/またはそれらの断片の1以上を含み、該分析物が糖化または非糖化形態である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 分析物が、少なくとも1つの第2分析物と異なる半減期を有する少なくとも1つの第1分析物を含み、方法が、該第1および第2分析物を定量化して1以上の期間にわたる該第1および第2分析物のレベルに関する遡及判定を提供することをさらに含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 第1分析物がヘモグロビンからなり、第2分析物が免疫グロブリンM(IgM)からなり;かつここで該第1分析物または第2分析物のいずれかが糖化形態または非糖化形態で存在する、請求項25に記載の方法。
- 分析物が、少なくとも1つの第1分析物、少なくとも1つの第2分析物および少なくとも1つの第3分析物を含み、該第1、第2および第3分析物のそれぞれが異なる半減期を有し、方法が、該第1、第2および第3分析物を定量化して1以上の期間にわたる該第1、第2および第3分析物のレベルに関する遡及判定を提供することをさらに含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 第1分析物がヘモグロビンからなり、第2分析物がIgMからなり、そして第3分析物がアルブミンからなり;該第1分析物、第2分析物または第3分析物の1以上が糖化形態または非糖化形態で存在する、請求項27に記載の方法。
- 過去の平均血中分析物レベルのモニタリングにおける使用のための本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載の方法であって、該方法が以下の工程:先行する請求項のいずれか1項に記載の方法により形成されたセンサーを血液試料と接触させ;該血液中の分析物の糖化形態の量を決定し;そして該血液試料分析物中に糖化形態で存在する該分析物の量を所与の時間フレームに関して対照レベルに関連付ける;を含む、前記方法。
- タンパク質の糖化形態の量が表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて決定される、請求項29に記載の方法。
- 支持体に自己組織化単分子膜(SAM)連結により連結された1タイプ以上のアプタマーを含み、該SAM連結が該支持体上に官能化された表面を形成するための所望の連結間隔および/または連結長を有し、
該所望の連結間隔および/または連結長が表面プラズモン共鳴(SPR)、ラマン分光法、または蛍光分光法の感度および選択性の少なくとも1つを分析物および/またはアプタマー特性に基づいて最適化するように選択される、センサー。 - SAM連結の少なくとも1つの充填密度および/または長さが表面プラズモン共鳴(SPR)シグナルに影響を及ぼす、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 連結が二成分SAMおよび還元脱着プロセスによる、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 支持体の官能化された表面が、該官能化された表面上でのタンパク質の非特異的な吸着を防ぐために十分なタンパク質吸着に耐性の物質に曝露されている、前記の請求項に記載のセンサー。
- タンパク質吸着に耐性の物質が(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を含む、前記の請求項に記載のセンサー。
- SAM連結が、アプタマーと安定な結合を形成することができるカルボキシ部分を有するチオール化合物を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- チオール化合物がジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)を含む、前記の請求項に記載のセンサー。
- 本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサーであって、SAM連結がジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を用いて形成され、
ここでPEG3はタンパク質の非特異的吸着を防ぎ、そして
ここでDTSP上のカルボキシル部分は該アプタマーと安定な結合を形成する、前記センサー。 - 二成分SAMチオール溶液がSAM連結において用いられる、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 二成分SAMチオール溶液が、3−メルカプトプロピオン酸(MPA)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)の1mMエタノール溶液を該二成分SAMの総濃度を約1mMで維持しながら混合することにより調製される、前記の請求項に記載のセンサー。
- MPAおよびPEG3が約20:80、約50:50または約80:20の比率で存在する、前記の請求項に記載のセンサー。
- MPAが還元脱着により排除されてPEG3が未変化のままになっており;そしてジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)がアプタマー上のアミノ基と結合しており、かつPEG3は結合を一切形成しない、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- アプタマーが、3−メルカプトプロピオン酸(MPA)上に固定されることができるアミン修飾アプタマーを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 表面が約5nM〜約1000nMの範囲の最適な動力を有する、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- センサーが、混合された長さのスペーサー層を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 混合された長さの層が、3−メルカプトプロピオン酸(MPA)と組み合わせられた11−メルカプトウンデカン酸(MUA)を含む、前記の請求項に記載のセンサー。
- SAM連結が、支持体の表面に直接結合することができる水溶性チオール含有アミノ酸を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- アミノ酸がシステインを含む、前記の請求項に記載のセンサー。
- 少なくとも支持体の表面が金である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 血液中のタンパク質の糖化形態からなる分析物を感知するために設計された、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 総血清タンパク質レベルから特定の糖化タンパク質の割合を決定するために設計された、前記の請求項に記載のセンサー。
- 分析物が、ヒトヘモグロビン、ヒト血清アルブミン(HSA)が含まれるアルブミン、免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンM(IgM)、フィブリノーゲン、および/またはそれらの断片の1以上を含み、該分析物が糖化および/または非糖化形態である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 分析物が、少なくとも1つの第2分析物と異なる半減期を有する少なくとも1つの第1分析物を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 第1分析物がヘモグロビンからなり、第2分析物が免疫グロブリンM(IgM)からなり;そして、ここで該第1分析物または第2分析物のいずれかが糖化形態または非糖化形態で存在する、前記の請求項に記載のセンサー。
- 分析物が、少なくとも1つの第1分析物、少なくとも1つの第2分析物および少なくとも1つの第3分析物を含み、該第1、第2および第3分析物のそれぞれが異なる半減期を有する、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 第1分析物がヘモグロビンからなり、第2分析物がIgMからなり、第3分析物がアルブミンからなり;該第1分析物、第2分析物または第3分析物の1以上が糖化形態または非糖化形態で存在する、前記の請求項に記載のセンサー。
- 以下の工程:先行する請求項のいずれか1項に記載の方法により形成されたセンサーを血液試料と接触させ;該血液中の該分析物の糖化形態の量を決定し;そして該血液試料分析物中に糖化形態で存在する該分析物の量を、所与の時間フレームに関して対照レベルに関連付ける;により過去の平均血中分析物レベルをモニタリングするための、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサーの使用。
- タンパク質の糖化形態の量が表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて決定される、前記の請求項に記載の使用。
- アプタマーが、特定の分析物と相互作用することができるヌクレオチド配列を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- センサーが、大きな生体分子、小さな生体分子、有機分子、小分子、核酸、金属イオン、タンパク質、酵素、ペプチド、薬物、色素、癌細胞、ウイルス、ホルモン、または微生物から選択される1以上の分析物と相互作用することができる、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 分析物が、生物学的試料、環境試料、化学的試料、薬学的試料、食品試料、農業試料、および獣医学的試料の1以上である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 分析物が血液タンパク質である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- センサーが、リンカーの特性に基づいてpM〜nMの検出が可能である調整可能な検出可能範囲を有する、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- センサーが1分未満の応答時間を有する、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- およそ周囲温度において1分未満の応答時間を有する、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- アプタマーが、SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14および15のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有するDNA配列を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- アプタマーが、本特許請求の範囲において特許請求されるアプタマーのいずれか1つを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー。
- 本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のセンサー;および該センサーが含まれる少なくとも1個の容器を含み、試料を該容器に添加することができる、1以上の分析物の検出のためのキット。
- 1以上の固体支持体、センサーを溶離液から分離するための1以上の分離剤、およびアプタマーを該センサーから分離するための1以上の試薬をさらに含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のキット。
- 単一標的部位結合アプタマーおよび非標的タンパク質結合アプタマーを中に有する核酸のプールから単一標的部位結合アプタマーを同定する方法であって、以下の工程:
a)核酸のプールに単一部位標的タンパク質複合体を添加し、ここで該プール中に存在する単一標的部位結合アプタマーおよび非標的タンパク質結合アプタマーの両方が該単一部位標的タンパク質複合体に結合し、単一標的部位結合アプタマー+非標的タンパク質結合アプタマー+単一部位標的タンパク質複合体を形成し;
b)該単一標的部位結合アプタマー+非標的タンパク質結合アプタマー+単一部位標的タンパク質複合体を該プールから分離し;
c)該単一標的部位結合アプタマーおよび該非標的タンパク質結合アプタマーを該単一部位標的タンパク質複合体から溶離し;
d)前の工程の溶離液に非標的タンパク質複合体を添加し、ここで工程c)の溶離液中に存在する非標的タンパク質結合アプタマーは該非標的タンパク質複合体に結合し、非標的タンパク質結合アプタマー+非標的タンパク質複合体を形成し;
e)該非標的タンパク質結合アプタマー+非標的タンパク質複合体を前の工程の溶離液から分離して該溶離液中の単一標的部位結合アプタマーを残し;そして
f)該単一標的部位結合アプタマーを該溶離液から分離し、場合によりさらに該単一標的部位結合アプタマーを増幅する;
を含む、前記方法。 - 単一標的部位結合アプタマーを用いてヘモグロビン、免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンM(IgM)およびアルブミンの1つに関して選択する、請求項70に記載の方法。
- 単一標的部位結合アプタマーがSEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14および15から選択される、請求項70に記載の方法。
- 単一部位標的タンパク質が固体支持体上に固定されている、請求項70に記載の方法。
- 非標的タンパク質複合体が固体支持体上に固定されている、請求項70に記載の方法。
- 固体支持体が磁性ビーズ、クロマトグラフィー用マトリックス、マイクロタイターディッシュまたはアレイを含む、請求項70に記載の方法。
- 糖化ヘモグロビンに結合するアプタマーであって、該アプタマーがSEQ ID NO:4および5からなる群から選択される核酸配列を含む、前記アプタマー。
- 糖化ヘモグロビンがヒトヘモグロビンである、請求項76に記載のアプタマー。
- アプタマーが、100nM以下のヒトヘモグロビンに関する解離定数を有する、請求項76に記載のアプタマー。
- アプタマーが少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項76に記載のアプタマー。
- 修飾が、糖の位置における化学的置換、ヌクレオチド間結合における化学的置換、および塩基の位置における化学的置換からなる群から選択される、請求項79に記載のアプタマー。
- 有効量の請求項76に記載のアプタマーまたはその塩、およびそのための支持体を含む、試験試薬。
- 請求項76に記載のアプタマーを含む、キット。
- 糖化ヘモグロビンに結合する本特許請求の範囲における請求項のいずれか1項に記載のアプタマーであって、該アプタマーが、SEQ ID NO:4および5からなる群から選択される核酸配列ならびに5’リンカーおよび3’リンカーの1以上を含む、前記アプタマー。
- リンカーが自己組織化単分子膜(SAM)である、請求項83に記載のアプタマー。
- SEQ ID NO:4および5のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有し、ヒト糖化ヘモグロビンに結合するアプタマー。
- 糖化ヘモグロビンの領域に特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸アプタマー分子にコンジュゲートされた自己組織化単分子膜(SAM)を含む物質の組成物であって、該ポリヌクレオチド配列がSEQ ID NO:4および5からなる群から選択される、前記組成物。
- アプタマー分子がPEG化されている、請求項86に記載の組成物。
- PEG化アプタマー分子が(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を含む、前記の請求項に記載の組成物。
- SAM連結がジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を用いて形成される、請求項86に記載の組成物。
- 非糖化ヘモグロビンに結合するアプタマーであって、該アプタマーがSEQ ID NO:6および7からなる群から選択される核酸配列を含む、前記アプタマー。
- 非糖化ヘモグロビンがヒトヘモグロビンである、請求項90に記載のアプタマー。
- アプタマーが、100nM以下のヒトヘモグロビンに関する解離定数を有する、請求項90に記載のアプタマー。
- アプタマーが少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項90に記載のアプタマー。
- 修飾が、糖の位置における化学的置換、ヌクレオチド間結合における化学的置換、および塩基の位置における化学的置換からなる群から選択される、前記の請求項に記載のアプタマー。
- 有効量の請求項90に記載のアプタマーまたはその塩、およびそのための支持体を含む、試験試薬。
- 請求項90に記載のアプタマーを含む、キット。
- 非糖化ヘモグロビンに結合する請求項90に記載のアプタマーであって、該アプタマーが、SEQ ID NO:6および7からなる群から選択される核酸配列ならびに5’リンカーおよび3’リンカーの1以上を含む、前記アプタマー。
- 該リンカーが自己組織化単分子膜(SAM)である、前記の請求項に記載のアプタマー。
- SEQ ID NO:6および7のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有し、ヒト非糖化ヘモグロビンに結合するアプタマー。
- 非糖化ヘモグロビンの領域に特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸アプタマー分子にコンジュゲートされた自己組織化単分子膜(SAM)を含む物質の組成物であって、該ポリヌクレオチド配列がSEQ ID NO:6および7からなる群から選択される、前記組成物。
- アプタマー分子がPEG化されている、請求項100に記載の組成物。
- PEG化アプタマー分子が(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を含む、前記の請求項に記載の組成物。
- SAM連結がジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を用いて形成される、請求項100に記載の組成物。
- 糖化血清アルブミンに結合するアプタマーであって、該アプタマーがSEQ ID NO:3、8および9からなる群から選択される核酸配列を含む、前記アプタマー。
- 該糖化血清アルブミンがヒト糖化血清アルブミンである、請求項104に記載のアプタマー。
- アプタマーが、100nM以下のヒト糖化血清アルブミンに関する解離定数を有する、請求項104に記載のアプタマー。
- アプタマーが少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項104に記載のアプタマー。
- 修飾が、糖の位置における化学的置換、ヌクレオチド間結合における化学的置換、および塩基の位置における化学的置換からなる群から選択される、前記の請求項に記載のアプタマー。
- 有効量の請求項104に記載のアプタマーまたはその塩、およびそのための支持体を含む、試験試薬。
- 請求項104に記載のアプタマーを含む、キット。
- 糖化血清アルブミンに結合する請求項104に記載のアプタマーであって、該アプタマーがSEQ ID NO:3、8および9からなる群から選択される核酸配列ならびに5’リンカーおよび3’リンカーの1以上を含む、前記アプタマー。
- 該リンカーが自己組織化単分子膜(SAM)である、前記の請求項に記載のアプタマー。
- SEQ ID NO:3、8および9のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有し、ヒト糖化血清アルブミンに結合する、アプタマー。
- 糖化血清アルブミンの領域に特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸アプタマー分子にコンジュゲートされた自己組織化単分子膜(SAM)を含む物質の組成物であって、該ポリヌクレオチド配列がSEQ ID NO:3、8および9からなる群から選択される、前記組成物。
- アプタマー分子がPEG化されている、前記の請求項に記載の組成物。
- PEG化アプタマー分子が(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を含む、前記の請求項に記載の組成物。
- SAM連結がジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を用いて形成される、請求項114に記載の組成物。
- 非糖化血清アルブミンに結合するアプタマーであって、該アプタマーがSEQ ID NO:10、11、12、13、14および15からなる群から選択される核酸配列を含む、前記アプタマー。
- 該非糖化血清アルブミンがヒト糖化血清アルブミンである、請求項118に記載のアプタマー。
- アプタマーが、100nM以下のヒト非糖化血清アルブミンに関する解離定数を有する、請求項118に記載のアプタマー。
- アプタマーが少なくとも1つの化学修飾を含む、請求項118に記載のアプタマー。
- 修飾が、糖の位置における化学的置換、ヌクレオチド間結合における化学的置換、および塩基の位置における化学的置換からなる群から選択される、前記の請求項に記載のアプタマー。
- 有効量の請求項118に記載のアプタマーまたはその塩、およびそのための支持体を含む、試験試薬。
- 請求項118に記載のアプタマーを含む、キット。
- 非糖化血清アルブミンに結合する請求項118に記載のアプタマーであって、該アプタマーがSEQ ID NO:10、11、12、13、14および15からなる群から選択される核酸配列ならびに5’リンカーおよび3’リンカーの1以上を含む、前記アプタマー。
- 該リンカーが自己組織化単分子膜(SAM)である、前記の請求項に記載のアプタマー。
- SEQ ID NO:10、11、12、13、14および15のいずれか1つの配列全体に対して少なくとも70%の同一性を有し、ヒト非糖化ヘモグロビンに結合する、アプタマー。
- 非糖化血清アルブミンの領域に特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含む核酸アプタマー分子にコンジュゲートされた自己組織化単分子膜(SAM)を含む物質の組成物であって、該ポリヌクレオチド配列がSEQ ID NO:10、11、12、13、14および15からなる群から選択される、前記組成物。
- アプタマー分子がPEG化されている、前記の請求項に記載の組成物。
- PEG化アプタマー分子が(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を含む、前記の請求項に記載の組成物。
- SAM連結がジチオビス−N−スクシンイミジルプロピオネート(DTSP)および(1−メルカプト−11−ウンデシル)トリ(エチレングリコール)(PEG3)を用いて形成される、前記の請求項に記載の組成物。
- SEQ ID NO:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14および15からなる群から選択される、精製および単離された非天然存在DNA配列。
- 試料中に存在し得る少なくとも1つの混乱させる物質の作用を低減するための方法であって、以下の工程:
a)該混乱させる物質の非特異的吸着を実質的に低減する/防ぐために十分な1以上の親水性の基を該支持体上の非結合部位において組み込み、
b)アプタマーを該支持体に自己組織化単分子膜(SAM)連結を用いて連結し、該SAM連結は該支持体上に官能化された表面を形成するための所望の連結間隔および/または連結長を有し、そして
c)SPRセンサーにより通常のSPR検出限界を超える分離距離においてアプタマー結合応答を検出する;
を含む、前記方法。
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