CN201637745U - 甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸 - Google Patents

Abstract

本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种甲型H1N1流感病毒H1N1IgM和总抗体联合检测试纸，采用胶体金标记甲型H1N1流感病毒抗原，包被抗人IgM和甲型H1N1流感病毒抗原实现对血液中抗甲型H1N1流感病毒抗体的检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸

技术领域

本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速检测甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸。

背景技术

甲型H1N1流感病毒是一种新型的流感病毒，2009年在世界范围内大流行，严重危害人类的健康。其“Ha”指的是血球凝集素(Hemagglutinin)、“Na”指的是神经氨酸酶(Neuraminidase)，甲型流感病毒H有1～15型，有1～9型。H1N1是甲型流感病毒的一种，也是危害最大的病毒之一。在历史上曾造成数次大流行。

目前对甲型H1N1流感检测的主要方法是PCR基因扩增诊断方法，鼻咽试纸抗原诊断方法等。在抗体检测方面，有ELISA等检测方法，但用胶体金类免疫层析技术对甲型H1N1 IgM抗体进行检测尚未有相关报道。

对H1N1 IgM和总抗体抗体检测主要有已下作用：1：对H1N1流感进行辅助诊断。部分H1N1感染的病程较长，可达2周已上，而IgM在5-7天时即可检测出来，并且IgM的存在时间较短，是现症感染的标志，对疾病的治疗有重要的作用；若检测只有IgG抗体而没有IgM抗体，则是既往感染，可排除现症感染。对免疫接种的效果进行评价，从数据上看，目前H1N1接种的有效率约为90％，尚有10％的人需要筛选出来重新接种或用其它方式进行该病的预防。IgM的早期检出和IgG长期存能从两个方面评价疫苗的反应性和有效性。考虑到感染和接种的人群巨大，运用一种快速、简便、有效的抗体检测方法是必要的。

免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，在抗体检测方面已得到较为广泛运用，基本原理如下：利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线，通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

发明内容

本实用新型的目的是提供一种甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

本实用新型提供一种甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于塑料支撑板8一端连接上样垫1，上样垫1的一端紧密压接含有标记H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫2，胶体金垫2一端紧密压接硝酸纤维素NC膜3，硝酸纤维素NC膜3包被有相互分离的检测线T15、检测线T26和质控C线，检测线T15为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，检测线T26为包被在NC膜上的H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原，质控C线7为包被在NC膜上的抗H1N1抗体，硝酸纤维素NC膜3的另一端连接吸样垫4形成试纸。

所述的甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于所述的抗原为H1N1特异性的血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，抗原可以从H1N1病毒中纯化提取或利用基因工程重组表达。

所述的甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于所述的上样垫1为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫4由吸水滤纸构成。

所述的甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于，所述的抗原的包被方法为：以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgM抗体配制成1-2mg/ml的溶液，以0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人H1N1特异性的血球凝集素(Ha)和或神经氨酸酶(Na)抗原配制成0.5-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以1ul/cm的参数进行划线，包被T1、T2线，同时在NC膜上部包被抗H1N1抗体作为C线，划线后将NC膜在干燥间温度20-25℃，湿度小于30％干燥2-5小时。

所述的甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于，所述的混合抗原标记胶体金颗粒的方法为：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K₂CO₃调至pH8.0，按100ml胶体金溶液加入0.5-2mg H1N1特异性的血球凝集素(Ha)和(或)神经氨酸酶(Na)抗原，室温搅拌2小时，加入1％牛血清白蛋白BSA，0.1％聚乙二醇PEG20000封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml，按1ml溶液铺22cm²的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间温度20-25℃，湿度小于30％干燥2-4小时，制成胶体金垫。

所述的甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于所述的试纸的装配方法为：在干燥室内(温度20-25℃，湿度小于30％)，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；最后用裁剪机将贴好塑料板切成2-5mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成检测卡。

所述的甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于，检测方法为：将被检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品，样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在20分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。

本实用新型的有益效果是：提供一种利用免疫层析胶体金技术检测甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸。采用胶体金标记甲型H1N1流感病毒抗原，包被抗人IgM和甲型H1N1流感病毒抗原实现对血液中抗甲型H1N1流感病毒抗体的检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

附图说明：

附图为甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸结构示意图。

附图符号说明：

1：上样垫；2：胶体金垫；3：NC膜；4：吸样垫5：检测线T1；6：检测线T2；7：质控(C)线；8：塑料支撑板

具体实施方式

实施例：制备甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸

1主要材料

1.1特异性甲型H1N1流感病毒Ha抗原：Sino Biological Inc.产品，为重组抗原，用于胶体金标记；鼠抗人IgM：军事医学科学院产品，抗Ha抗体，用Ha免疫山羊自制，用于NC膜包被；氯金酸：Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜：Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。

1.2临床血清由公司在相关医院获得，其中在近期接种H1N1疫苗样本80份，未接种疫苗样本120份。

1.3甲型H1N1流感病毒IgM和IgG ELISA试剂盒，Sino Biological Inc.产品。

2方法

2.1甲型H1N1流感病毒Ha重组抗原的胶体金标记氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K₂CO₃将溶液调到pH7.0、pH8.0和pH9.0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为0.1％的PEG2000和1％的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液硼酸盐缓冲液，pH8.0，含BSA、羊血清，蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按1ml溶液铺22cm²的比例加样于无纺布上，在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫。

2.2NC膜包被用0.01M pH7.2PBS将鼠抗人IgM分别稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml，甲型H1N1流感病毒Ha重组抗原分别稀释成0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按1ul/cm进行分别划线包彼，同时在NC膜上部包被抗Ha抗体，用于产品的质控，包被完成后将NC膜在在温度20-25℃，相对湿度在＜30％的干燥间干燥2-5小时。

2.3甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体快速检测试纸的组装在干燥室内(温度20-25℃，相对湿度＜30％)取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成甲型H1N1流感病毒IgM抗体检测试剂卡。

2.4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100ul被检样品，若样品中含抗甲型H1N1流感病毒IgM或IgG抗体，则和样品垫上的标记甲型H1N1流感病毒抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到NC膜上进一步层析，当遇到包被在NC膜上T1线处的鼠抗人IgM时，复合物则又和包被抗IgM抗体结合，被捕获在包被处；当遇到包被在NC膜上T2线处的H1N1抗原时，复合物则又和包被抗原体结合，被捕获在包被线T2处；当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T或T2线；若血清中不含特异性抗体，则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在5、10、15、20、30和45分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。

2.5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合。

2.6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有临床血清进行检测，同时用Sino Biological Inc.IgM和IgG抗体检测ELISA试剂进行对照检测。

3结果

3.1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8.0；重组混合抗原的最佳标记量为1mg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为10mM硼酸酸盐缓冲液，pH8.0，含0.5％BSA、10％羊血清，2％蔗糖，0.2％Tween 20；最佳包鼠抗人IgM包被浓度为1mg/ml。检测结果的最佳判定时间为5-20分钟。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。

3.2临床血清检测以ELISA试剂为对照，80份近期接种甲型H1N1流感病毒疫苗人员的样本中，在对H1N1 IgM抗体的检测中，本试剂IgM检测出阳性65份，ELISA检测出IgM阳性血清72份，灵敏度＝65/72＝90.1％；本试剂IgM对120份未接种H1N1疫苗人员样本中检出阴性为112份，和ELISA试剂的检测出率完全一致，相对特异性100％。P＞0.05。在对H1N1 IgG抗体的检测中，80份近期接种甲型H1N1流感病毒疫苗人员的样本中，检测出阳性70份，ELISA检测出阳性血清72份，灵敏度＝70/72＝97.2％；本试剂对120份未接种H1N1疫苗人员样本中检出阴性为110份，ELISA试剂的检测阴性为112分，相对特异性为110/112＝98.2％。P＞0.05。

临床检测表明本试剂的性能和ELISA试剂相比无显著性差异，适合临床检测需要。

Claims (2)

1.一种甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于塑料支撑板(8)一端连接上样垫(1)，上样垫(1)的一端紧密压接含有标记H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫(2)，胶体金垫(2)一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(3)，硝酸纤维素NC膜(3)包被有相互分离的检测线T1(5)、检测线T2(6)和质控C线，检测线T1(5)为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，检测线T2(6)为包被在NC膜上的H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原，质控C线(7)为包被在NC膜上的抗H1N1抗体，硝酸纤维素NC膜(3)的另一端连接吸样垫(4)形成试纸。

2.根据权利要求1所述的甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于所述的上样垫(1)为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫(4)由吸水滤纸构成。

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