CN111366729A - 一种新型冠状病毒covid-19抗原荧光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种新型冠状病毒covid-19抗原荧光检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种新型冠状病毒COVID‑19抗原荧光检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括底板，底板上铺设有样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸；结合垫上含有荧光微球标记的新型冠状病毒COVID‑19 Spike蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；包被膜包含检测区包被T和质控区包被C，检测区包被T有与结合垫上的新型冠状病毒COVID‑19 Spike蛋白单克隆抗体不同表位的新型冠状病毒COVID‑19 Spike蛋白单克隆抗体，质控区包被C有鸡IgY抗体。本发明的试剂盒可精准检测样本中是否存在新型冠状病毒Spike蛋白，实现现场快速检测。

Description

一种新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒 COVID-19抗原荧光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
2019新型冠状病毒COVID-19属于正冠状病毒亚科 (OrthocoronS1virinS1e)。从发现病毒性肺炎是由该病毒引起的数十 日内，由于人口流动性的原因，全国范围内相继出现确诊病例。该病 毒的潜伏期长达14天，在无症状的情况下也可传染。国家卫生健康 委员会决定将新型冠状病毒感染的肺炎纳入法定传染病乙类管理，采 取甲类传染病的预防、控制措施。
目前市场上暂无2019新型冠状病毒COVID-19抗原检测产品， 因此，亟需一种快速、特异、精准检测的新型冠状病毒COVID-19病 毒抗原荧光检测试剂盒。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供一种新型 冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒，该试剂盒可快速、特异、 精准的检测出新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白的含量，具有灵敏、 准确、稳定的优点，可以对待测样品实现快速、超敏、准确的现场检 测，并且提供定量的检测结果。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测免疫层析试剂盒，该 试剂盒包括底板，所述底板上铺设有样品垫、结合垫、包被膜和吸水 纸，所述样品垫和吸水纸分别位于底板的两端，所述样品垫搭接于结 合垫，所述结合垫搭接于包被膜，所述吸水纸搭接于包被膜；样品垫 优选为玻璃纤维材料，经Tris盐溶液浸泡处理后热烘干处理后裁切制 成，包被膜优选为硝酸纤维素膜。
所述结合垫上含有荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；所述包被膜包 含检测区包被T和质控区包被C，所述检测区包被T有与结合垫上的 新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体不同表位的新型冠状 病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体，所述质控区包被C有鸡IgY 抗体。
本发明进一步设置为：所述结合垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体浓度为0.5～2.5mg/mL，所述羊抗鸡抗体浓度 为0.5-2.0mg/mL，所述结合垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋 白单克隆抗体固化后的含量为0.8～1.5μg/cm2，所述结合垫上的羊抗 鸡抗体固化后的含量为0.8～1.0μg/cm2。
本发明进一步设置为：所述结合垫通过结合垫处理液处理；所述 结合垫处理液包括以下原料：5％～10％甜菜碱，3％～5％酪蛋白，5％～10％吐温-100溶解于0.01M及pH值为6.2～7.2的磷酸盐缓冲盐 溶液。
本发明进一步设置为：所述样品垫含有浓度为0.5～2.0mg/ml的 鼠IgG抗体。
本发明进一步设置为：所述检测区包被T上的新型冠状病毒 COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-2.5mg/ml，用量为 26μl/27-29cm。
本发明进一步设置为：所述鸡IgY抗体浓度为0.5-2.0mg/ml、 用量为26μl/27-29cm。
本发明进一步设置为：所述荧光微球的粒径为0.1～0.5μm，所述 荧光微球的激发光和发射光波长为400～750nm。
本发明还提供了一种新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试 剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、荧光微球的清洗与活化：将荧光微球悬液离心处理后，加入 吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，接着依次加入碳二亚胺和N-羟基硫 代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺 酸溶液重悬，重复清洗后超声混匀备用；
S2、荧光微球标记抗体的制备：在步骤S1活化后得到的荧光微 球悬液中，分别逐滴加入新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆 抗体和羊抗鸡抗体，混匀后室温反应，离心清洗，沉淀用含有5％牛 血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液重悬后室温反应，离心清洗，沉淀再用 含1％牛血清白蛋白的TBST缓冲液超声重悬，得到荧光微球标记的 新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊 抗鸡抗体；
S3、结合垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，将步骤 S2得到的两种荧光微球标记抗体和含有5％～10％甜菜碱，3％～5％ 酪蛋白，5％～10％吐温-100溶解于0.01M及pH值为6.2～7.2的磷酸 盐缓冲盐溶液的结合垫处理液稀释，喷涂在结合垫上，烘干备用；
S4、包被膜的制备：分别将另一种新型冠状病毒COVID-19 Spike 蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用磷酸缓冲盐溶液调节浓度，然后将二 者分别在检测区包被T和质控区包被C划膜，烘干备用；
S5、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，用含5％～ 8％葡萄糖、1％～2％吐温-100的Tris溶液浸泡，浸泡充分后烘干，烘 干后上面喷涂鼠IgG抗体；
S6、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和 吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后 切割成试纸条。
本发明进一步设置为：所述步骤S1中加入的吗啉乙磺酸溶液体 积为20～50mM，pH为5.0～6.5。
本发明进一步设置为：所述步骤S4中，检测区包被T上与结合 垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体不同表位的新 型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体和质控区包被C上的鸡 IgY抗体两者间隔5～8mm。
通过采用上述技术方案，Spike蛋白是新型冠状病毒COVID-19 的膜融合蛋白，本发明是通过利用粒径为0.1～0.5μm的荧光微球上 的羧基、醛基、羟甲基等基团共价偶联抗体上，样本经过样品垫前处 理后流经结合垫时，样本中的新型冠状病毒spike蛋白与结合垫上的 含有荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体 或羊抗鸡抗体结合，在层析作用下移动至包被膜，被检测区包被T 上的另一新型冠状病毒spike蛋白抗体捕获，形成三明治结构的抗体- 抗原-抗体复合物并聚集在检测区域，当荧光微球受到光源激发并释 放出其特定波长400～750nm的发射光，通过荧光检测系统将收集到 的光信号转化为数字信号，从而可快速精准的测定样本中新型冠状病 毒spike蛋白的含量，在本发明中鼠IgG抗体用于消除样本中的人抗 鼠IgG抗体，防止其对检测区包被T和质控区包被C测试的影响。
本发明将结合垫处理液对制备得到的荧光微球标记的抗体进行 稀释，结合垫处理液为甜菜碱、酪蛋白、吐温-100溶解于pH值为6.2～ 7.2的磷酸盐缓冲盐溶液，使得样品中的新型冠状病毒spike蛋白流经 至结合垫时，可更好的与结合垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike 蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体结合，进而使得抗体-抗原-抗体复合物 结合的更佳紧密，使得待测样品精确度更高，灵敏度更高，优于市面 上的检测水平。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒， 可用于大规模疑似和接触性病例的新冠肺炎的筛查，操作简单，只需 样本稀释、加样、检测等3步即可完成检测，技术耗时短，可在5分 钟内完成检测，提高了工作效率。
2.本发明提供的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂 盒，首次将新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白抗体与荧光微球结合， 使得检测更为精确，稳定，灵敏。
附图说明
图1为本发明新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒的 结构示意图。
图中：1、样品垫；2、结合垫；3、包被膜；4、吸水纸；5、底 板。
具体实施方式
以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。
如图1所示，本发明新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测免疫 层析试剂盒，包括底板5，底板5上铺设有样品垫1、结合垫2、包 被膜3和吸水纸4，样品垫1和吸水纸4分别位于底板5的两端，样 品垫1搭接于结合垫2，结合垫2搭接于包被膜3，吸水纸4搭接于 包被膜3；样品垫优选为玻璃纤维材料，经0.1mol/L Tris盐溶液浸泡 处理后湿度18％、温度50℃的环境中热烘干处理后裁切制成；
结合垫上含有荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋 白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
包被膜包含检测区包被T和质控区包被C，检测区包被T有与结 合垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体不同表位的 新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体，质控区包被C有鸡IgY抗体。
实施例1、本发明试剂盒及其制备方法
S1、荧光微球的清洗与活化：选用粒径为0.1μm的荧光微球，荧 光微球的激发光和发射光波长分别为400nm和505nm，将荧光微球 置于离心管中并置于低温超速离心机中，以12000×g转速离心处理 10min，形成荧光微球悬液，去除上清后，沉淀物用20mM pH5.0的吗啉乙磺酸溶液重悬，再用超声波100W处理50s，使荧光微球悬液 的浓度为10mg/ml，依次加入50μl的浓度100mg/ml碳二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，置于旋转混匀仪，室温混匀15min后， 12000×g转速离心20min，弃除上清后用20mM pH5.5的吗啉乙磺 酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用；
S2、荧光微球标记抗体的制备：
1)在步骤S1活化后得到的荧光微球悬液中，逐滴加入新型冠状 病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体，混匀后室温置于旋转混匀仪 上反应3h后10000×g转速离心清洗3次，沉淀用5％BSS1的PBS 溶液重悬后室温旋转反应后10000×g离心清洗1次，用1％BSS1的TBST溶液重悬，使得新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗 体终浓度为0.5mg/ml，得到荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体；
2)在步骤S1活化后得到的荧光微球悬液中，逐滴加入羊抗鸡抗 体，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后12000×g转速离心清洗 3次，沉淀用5％BSS1的PBS溶液重悬后室温旋转反应后12000×g 离心清洗1次，用1％BSS1的TBST溶液重悬，使得羊抗鸡抗体终 浓度为0.5mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
S3、结合垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成30cm×20mm 的条状，将步骤S2得到的两种荧光微球标记抗体按照1:1的稀释比 例，使用5％重量百分比甜菜碱，3％重量百分比酪蛋白，5％重量百 分比吐温-100溶解于0.01M及pH值为6.2的磷酸盐缓冲盐溶液的结合垫处理液稀释1倍，以0.2μg/cm2的用量喷涂在结合垫上，热烘24 h后置于湿度25％的环境中储存备用；
S4、包被膜的制备：分别将另一种不同表位的新型冠状病毒 COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1mM的PBS溶液 均调节终浓度至0.5mg/mL，二者分别以26μl/27-29cm的包被液量在 检测区和质控区划膜，二者间隔5mm，在湿度18％、温度45℃的环 境中热烘干36h后置于湿度20％的室温下备用；
S5、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成30cm×20mm 的条状，用含5％葡萄糖、2％吐温-100的Tris溶液浸泡，浸泡充分后， 置于湿度15％，温度45℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂0.5mg/ml 的鼠IgG，喷涂量为10μg/cm2；
S6、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和 吸水纸，样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，各组分之 间重叠的部分为2.5mm，按照产品要求切割成合适宽度4mm的试纸 条。
结合垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体固化 后的含量为0.8μg/cm2，结合垫上的羊抗鸡抗体固化后的含量为 0.8g/cm2。
实施例2、本发明试剂盒及其制备方法
S1、荧光微球的清洗与活化：选用粒径为0.3μm的荧光微球，荧 光微球的激发光和发射光波长分别为550nm和400nm，将荧光微球 置于离心管中并置于低温超速离心机中，以12000×g转速离心处理 20min，形成荧光微球悬液，去除上清后，沉淀物用30mM pH5.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，再用超声波100W处理60s，使荧光微球悬液 的浓度为10mg/ml，依次加入50μl的浓度100mg/ml碳二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，置于旋转混匀仪，室温混匀15min后， 12000×g转速离心30min，弃除上清后用20mM pH6的吗啉乙磺酸 溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用；
S2、荧光微球标记抗体的制备：
1)在步骤S1活化后得到的荧光微球悬液中，逐滴加入新型冠状 病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体，混匀后室温置于旋转混匀仪 上反应3.5h后12000×g转速离心清洗3次，沉淀用5％BSS1的PBS 溶液重悬后室温旋转反应后12000×g离心清洗1次，用1％BSS1的 TBST溶液重悬，使得新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗 体终浓度为1.5mg/ml，得到荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体；
2)在步骤S1活化后得到的荧光微球悬液中，逐滴加入羊抗鸡抗 体，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3.5h后12000×g转速离心清 洗3次，沉淀用5％BSS1的PBS溶液重悬后室温旋转反应后10000×g 离心清洗1次，用1％BSS1的TBST溶液重悬，使得羊抗鸡抗体终浓度为1.0mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
S3、结合垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成30cm×20mm 的条状，将步骤S2得到的两种荧光微球标记抗体按照1:1的稀释比 例，使用7％重量百分比甜菜碱，4％重量百分比酪蛋白，8％重量百 分比吐温-100溶解于0.01M及pH值为6.6的磷酸盐缓冲盐溶液的结合垫处理液稀释3倍，以0.2μg/cm2的用量喷涂在结合垫上，热烘24 h后置于湿度25％的环境中储存备用；
S4、包被膜的制备：分别将另一种不同表位的新型冠状病毒 COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1mM的PBS溶液 调节终浓度至1.5mg/mL、1.0mg/mL，二者分别以26μl/27-29cm的 包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔7mm，在湿度18％、温 度45℃的环境中热烘干36h后置于湿度20％的室温下备用；
S5、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成30cm×20mm 的条状，用含7％葡萄糖、3％吐温-100的Tris溶液浸泡，浸泡充分后， 置于湿度15％，温度45℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂1.0mg/ml 的鼠IgG，喷涂量为10μg/cm2；
S6、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和 吸水纸，样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，各组分之 间重叠的部分为2.5mm，按照产品要求切割成合适宽度4mm的试纸 条。
结合垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体固化 后的含量为1.0μg/cm2，结合垫上的羊抗鸡抗体固化后的含量为0.9 μg/cm2。
实施例3、本发明试剂盒及其制备方法
S1、荧光微球的清洗与活化：选用粒径为0.5μm的荧光微球，荧 光微球的激发光和发射光波长分别为750nm和750nm，将荧光微球 置于离心管中并置于低温超速离心机中，以12000×g转速离心处理 20min，形成荧光微球悬液，去除上清后，沉淀物用50mM pH6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，再用超声波100W处理60s，使荧光微球悬液 的浓度为10mg/ml，依次加入50μl的浓度100mg/ml碳二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，置于旋转混匀仪，室温混匀15min后， 12000×g转速离心30min，弃除上清后用35mM pH6.0的吗啉乙磺 酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用；
S2、荧光微球标记抗体的制备：
1)在步骤S1活化后得到的荧光微球悬液中，逐滴加入新型冠状 病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体，混匀后室温置于旋转混匀仪 上反应4h后12000×g转速离心清洗3次，沉淀用5％BSS1的PBS 溶液重悬后室温旋转反应后12000×g离心清洗1次，用1％BSS1的TBST溶液重悬，使得新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗 体终浓度为2.5mg/ml，得到荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体；
2)在步骤S1活化后得到的荧光微球悬液中，逐滴加入羊抗鸡抗 体，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后12000×g转速离心清洗 3次，沉淀用5％BSS1的PBS溶液重悬后室温旋转反应后10000×g 离心清洗1次，用1％BSS1的TBST溶液重悬，使得羊抗鸡抗体终 浓度为2.0mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
S3、结合垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成30cm×20mm 的条状，将步骤S2得到的两种荧光微球标记抗体按照1:1的稀释比 例，使用10％重量百分比甜菜碱，5％重量百分比酪蛋白，10％重量 百分比吐温-100溶解于0.01M及pH值为7.2的磷酸盐缓冲盐溶液的结合垫处理液稀释5倍，以0.2μg/cm2的用量喷涂在结合垫上，热烘 24h后置于湿度25％的环境中储存备用；
S4、包被膜的制备：分别将另一种不同表位的新型冠状病毒 COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1mM的PBS溶液 调节终浓度至2.5mg/mL、2.0mg/mL，二者分别以26μl/27-29cm的 包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔8mm，在湿度18％、温 度45℃的环境中热烘干48h后置于湿度20％的室温下备用；
S5、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成30cm×20mm 的条状，用含8％葡萄糖、3％吐温-100的Tris溶液浸泡，浸泡充分后， 置于湿度15％，温度45℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂2.0mg/ml 的鼠IgG，喷涂量为10μg/cm2；
S6、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和 吸水纸，样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，各组分之 间重叠的部分为2.5mm，按照产品要求切割成合适宽度4mm的试纸 条。
结合垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体固化 后的含量为1.5μg/cm2，结合垫上的羊抗鸡抗体固化后的含量为1.0 μg/cm2。
实施例4、本发明试剂盒及其制备方法
S1、荧光微球的清洗与活化：选用粒径为0.2μm的荧光微球，荧 光微球的激发光和发射光波长分别为450nm和500nm，将荧光微球 置于离心管中并置于低温超速离心机中，以12000×g转速离心处理 20min，形成荧光微球悬液，去除上清后，沉淀物用15mM pH6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，再用超声波100W处理60s，使荧光微球悬液 的浓度为10mg/ml，依次加入50μl的浓度100mg/ml碳二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，置于旋转混匀仪，室温混匀15min后， 12000×g转速离心30min，弃除上清后用30mM pH6.0的吗啉乙磺 酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用；
S2、荧光微球标记抗体的制备：
1)在步骤S1活化后得到的荧光微球悬液中，逐滴加入新型冠状 病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体，混匀后室温置于旋转混匀仪 上反应3h后12000×g转速离心清洗3次，沉淀用5％BSS1的PBS 溶液重悬后室温旋转反应后12000×g离心清洗1次，用1％BSS1的TBST溶液重悬，使得新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗 体终浓度为1.8mg/ml，得到荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体；
2)在步骤S1活化后得到的荧光微球悬液中，逐滴加入羊抗鸡抗 体，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应2.5h后12000×g转速离心清 洗3次，沉淀用5％BSS1的PBS溶液重悬后室温旋转反应后10000×g 离心清洗1次，用1％BSS1的TBST溶液重悬，使得羊抗鸡抗体终浓度为1.5mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
S3、结合垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成30cm×20mm 的条状，将步骤S2得到的两种荧光微球标记抗体按照1:1的稀释比 例，使用6％重量百分比甜菜碱，3％重量百分比酪蛋白，6％重量百 分比吐温-100溶解于0.01M及pH值为6.8的磷酸盐缓冲盐溶液的结合垫处理液稀释2倍，以0.2μg/cm2的用量喷涂在结合垫上，热烘24 h后置于湿度25％的环境中储存备用；
S4、包被膜的制备：分别将另一种不同表位的新型冠状病毒 COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1mM的PBS溶液 调节终浓度至1.5mg/mL、1.2mg/mL，二者分别以26μl/27-29cm的 包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔6mm，在湿度18％、温 度45℃的环境中热烘干36h后置于湿度20％的室温下备用；
S5、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成30cm×20mm 的条状，用含8％葡萄糖、3％吐温-100的Tris溶液浸泡，浸泡充分后， 置于湿度15％，温度45℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂1.0mg/ml 的鼠IgG，喷涂量为10μg/cm2；
S6、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和 吸水纸，样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，各组分之 间重叠的部分为2.5mm，按照产品要求切割成合适宽度4mm的试纸 条。
结合垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体固化 后的含量为1.0μg/cm2，结合垫上的羊抗鸡抗体固化后的含量为0.8 μg/cm2。
对比例1
与实施例4相同，区别仅在于，不对结合垫进行结合垫处理液稀 释，其余具体步骤与实施例4相同。
对比例2
与实施例4相同，区别仅在于，结合垫处理液不包含甜菜碱，其 余具体步骤与实施例4相同。
对比例3
与实施例4相同，区别仅在于，结合垫处理液不包含酪蛋白，其 余具体步骤与实施例4相同。
试验一、新型冠状病毒样本检测
利用测试荧光免疫层析试剂盒的荧光光谱检测系统，新型冠状病 毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒的检测区包被T和质控区包被C 捕获的荧光微球标记抗体，荧光微球在荧光光源激发光照射下被激 发，发射出荧光信号被荧光信号检测系统捕获后转换为电信号并通过 软件分析系统得出测试结果，实现对新型冠状病毒COVID-19 Spike 蛋白的精确检测，见表1。
本测试采用的新型冠状病毒样本为经深圳市疾病预防控制中心 检测过的样本，其中阳性样本128份，阴性样本72份。取模拟样本 75μl分别加入到实施例1～4及对比例1～3的试剂盒的测试孔中，5 分钟之内等待结果，本试验设置空白对照组，采用市面用的胶体金试 纸条。
采用的荧光光谱检测系统：S1FS-100免疫荧光单通道荧光测试 仪，该仪器为广州蓝勃生物科技有限公司生产。
表1
组别 阳性样本
实施例1 阳性
实施例2 阳性
实施例3 阳性
实施例4 阳性
对比例1 未检出
对比例2 未检出
对比例3 弱阳性
空白对照组 未检出
测试结果：阳性符合率为98.4％，阴性符合率为100％，总符合 率为98.4％。
试验二、酶联免疫吸附实验
总共90例，其中新型冠状病毒病例组30例，细菌性肺炎组30 例，健康对照人群30例，采用本发明实施例1～4及对比例1～3的 试剂盒进行检测。
表2
Figure BDA0002427273090000171
说明：Youden指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)，Youden指 数值达到最大为最佳诊断界值。
由表2的数据可知，本发明试剂盒中的两种荧光微球标记抗体用 含有5％～10％重量百分比甜菜碱，3％～5％重量百分比酪蛋白，5％～ 10％重量百分比吐温-100溶解于0.01M及pH值为6.2～7.2的磷酸盐 缓冲盐溶液的结合垫处理液进行稀释，增加了待测样品灵敏度、特异 度，使得本发明制备得到的试剂盒质量更高。
本发明的试剂盒，具有灵活便捷、快速的特点，不受操作地点的 限制，人员要求低，更适用于区域性疫情的监控研究。本发明中的试 剂盒，只需少量样本，5min内即可显示结果，配套仪器轻便便捷， 可手持式，可与疾控、边检、医院直接网络连接，无需人工数据录入， 数据处理分析更便捷。对疫情的监控和新型冠状病毒的研究更有意 义，为新型冠状病毒的精准研究提供更好的支持。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限 制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等 效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括底板，所述底板上铺设有样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫和吸水纸分别位于底板的两端，所述样品垫搭接于结合垫，所述结合垫搭接于包被膜，所述吸水纸搭接于包被膜；
所述结合垫上含有荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
所述包被膜包含检测区包被T和质控区包被C，所述检测区包被T有与结合垫上的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体不同表位的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体，所述质控区包被C有鸡IgY抗体。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒，其特征在于，所述结合垫上的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体浓度为0.5～2.5mg/mL，所述羊抗鸡抗体浓度为0.5-2.0mg/mL，所述结合垫上的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体固化后的含量为0.8～1.5μg/cm2，所述结合垫上的羊抗鸡抗体固化后的含量为0.8～1.0μg/cm2。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒，其特征在于，所述结合垫通过结合垫处理液处理；所述结合垫处理液包括以下原料：5％～10％甜菜碱，3％～5％酪蛋白，5％～10％吐温-100溶解于0.01M及pH值为6.2～7.2的磷酸盐缓冲盐溶液。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫含有浓度为0.5～2.0mg/ml的鼠IgG抗体。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒，其特征在于，所述检测区包被T上的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-2.5mg/ml，用量为26μl/27-29cm。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒，其特征在于，所述鸡IgY抗体浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为26μl/27-29cm。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒，其特征在于，所述荧光微球的粒径为0.1～0.5μm，所述荧光微球的激发光和发射光波长为400～750nm。
8.一种新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、荧光微球的清洗与活化：将荧光微球悬液离心处理后，加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，接着依次加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗后超声混匀备用；
S2、荧光微球标记抗体的制备：在步骤S1活化后得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体和羊抗鸡抗体，混匀后室温反应，离心清洗，沉淀用含有5％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液重悬后室温反应，离心清洗，沉淀再用含1％牛血清白蛋白的TBST缓冲液超声重悬，得到荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
S3、结合垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，将步骤S2得到的两种荧光微球标记抗体和含有5％～10％甜菜碱，3％～5％酪蛋白，5％～10％吐温-100溶解于0.01M及pH值为6.2～7.2的磷酸盐缓冲盐溶液的结合垫处理液稀释，喷涂在结合垫上，烘干备用；
S4、包被膜的制备：分别将另一种新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用磷酸缓冲盐溶液调节浓度，然后将二者分别在检测区包被T和质控区包被C划膜，烘干备用；
S5、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，用含5％～8％葡萄糖、1％～2％吐温-100的Tris溶液浸泡，浸泡充分后烘干，烘干后上面喷涂鼠IgG抗体；
S6、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
9.根据权利要求8所述的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中加入的吗啉乙磺酸溶液体积为20～50mM，pH为5.0～6.5。
10.根据权利要求8所述的新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，检测区包被T上与结合垫上的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体不同表位的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体和质控区包被C上的鸡IgY抗体两者间隔5～8mm。
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