KR102121324B1 - 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자의 조제와 이것을 사용한 면역검정법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 신속성이 높으며, 고감도 면역검정(immunoassay)에 사용하는, 육안으로 판정할 수도 있고, 또한 고감도 장치 측정이 가능한 불용성 담체 입자의 제공을 목적으로 한다.
면역검정에 사용하는, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자로서, 상기 가시역 착색 불용성 담체 입자에 의한 상기 형광 색소가 발하는 파장역의 형광의 흡수가 작은, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자.

Description

형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자의 조제와 이것을 사용한 면역검정법{PREPARATION OF NON-SOLUBLE CARRIER PARTICLES FOR VISIBLE REGION COLORING AND LABELED USING FLUORESCENT PIGMENT, AND IMMUNOASSAY METHOD USING SAID NON-SOLUBLE CARRIER PARTICLES FOR VISIBLE REGION COLORING}
본 발명은, 검체 중의 피분석 물질을 특이적으로, 신속하게 검출하기 위한 방법 및 이것을 사용한 키트에 관한 것이다.
종래부터, 불용성 담체 입자를 사용한 면역검정법(immunoassay)이 널리 행해지고 있었다.
불용성 담체 입자를 사용한 면역검정법에서는, 니트로셀룰로오스 멤브레인과 같은 섬유 구조를 가지는 막의 소정의 위치에 피검출 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 고정화한 시험편에, 불용성 담체 입자로서, 금 콜로이드, 백금 금 콜로이드, 착색 폴리스티렌 입자 등을 사용하고, 여기에 피검출 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 고정화한 입자와 피검출 물질을 포함하는 검체를 전술한 시험편에 모세관 현상을 이용하여 전개함으로써, 니트로셀룰로오스 멤브레인 상의 리간드와 재용해한 불용성 담체 입자 상의 리간드로 피검출 물질을 샌드위치하고, 육안으로 또는 전용 장치를 사용하여 검출하는 방법이 사용되고 있다.
금 콜로이드, 백금 금 콜로이드, 착색 폴리스티렌 입자 등의 불용성 담체 입자는 육안에 의해 판정할 수 있는 장점이 있지만, 이들 불용성 담체 입자는 전용 장치를 사용하여 검출해도 극적인 검출 감도의 향상은 바랄 수 없다. 한편, 형광 물질을 표지한 리간드 또는 형광 물질을 포함하는 불용성 담체 입자를 사용하는 경우, 전용 장치를 사용하면, 극적인 검출 감도 향상을 바랄 수 있는 장점이 있지만, 한편, 육안으로 판정하지 못하고, 피검출 물질의 양이 많고, 육안 판정에 의해 단시간에 검출할 수 있다고 하더라도, 전용 장치를 사용할 필요가 있어, 오히려 번거롭게 된다.
이 문제점을 해결하고자, 육안 판정이 가능한 불용성 담체 입자와 형광 입자를 혼합하여 사용하는 것이 제안되어 있지만(특허 문헌 1을 참조), 불용성 담체 입자 상의 리간드와 형광 입자 상의 리간드가 경합하므로, 피검출 물질이 매우 적은 경우, 효율적으로 형광 입자 상의 리간드가 결합하지 못하며, 반드시 고감도가 되는 것은 아니다. 또한, 생산 효율을 고려할 경우, 2종류의 불용성 담체 입자를 따로따로 조제할 필요가 있어, 효율이 좋지 못한 과제가 남아 있다.
또한, 금속으로 이루어지는 미립자의 외측이, 적어도 1종의 형광 물질을 함유하는 실리카 중 적어도 1층으로 덮힌 구조를 가지는 면역크로마토그래피용 복합 입자를 사용하는 것이 제안되어 있지만(특허 문헌 2를 참조), 본 발명에서는 금속으로 이루어지는 미립자의 흡광에 의해 외측의 형광 물질의 형광이 흡수되므로, 형광 물질의 종류가 제한되는 것과, 실리카층을 사용하는 것이 전제로 되어 있고, 그 조제에는 특별한 기술이 필요한 과제가 남아 있다.
일본공개특허 제2010-014631호 공보 일본공개특허 제2011-220705호 공보
불용성 담체 입자를 사용하는 면역검정법은, POCT(Point Of Care Test)로서 체외 진단용 의약품으로서 널리 사용되고 있고, 특히 세균이나 바이러스로부터 유래하는 감염증의 진단 보조에 이용되고 있다. 감염증은, 때에 따라서는 면역력이 낮은 유아나 고령자 등이 이환(罹患)하는 경우, 생명과 관계되는 경우가 있으며, 인플루엔자 바이러스 감염증 등에서는, 소아나 성인에 있어서도 마찬가지이다. 한편, 일부 세균이나 바이러스에는 항생 물질이나 특효약 등의 치료약이 있어서, 조기에 진단함으로써 확실하게 치료로 이어질 수 있다. 또한, 인플루엔자 바이러스 감염증은, 감염성이 강하고, 원내 감염이나 병원의 대기실에서의 감염을 일으킬 가능성이 있다. 이와 같은 현재의 실정에 있어서, POCT로서의 체외 진단용 의약품에는, 고감도이면서, 한편으로는 가능한 한 짧은 시간에 판정할 수 있는 것이 요구되고 있다.
본 발명은, 신속성이 높고, 고감도 면역검정에 사용하고, 육안 판정도 가능하며, 또한 고감도 장치 측정이 가능한 불용성 담체 입자, 그 조제 방법, 및 이것을 사용한 면역검정 방법, 및 그것을 포함하는 면역검정 키트의 제공을 목적으로 한다.
상기 과제는, 육안에 의해 확인할 수 있는 가시역 착색 불용성 담체 입자상의 관능기에 리간드를 결합할 때, 동시에 형광 물질을 결합함으로써 해결할 수 있다. 불용성 담체 입자의 흡광 파장과 동일한 파장의 색과 보색의 관계에 있는 색의 파장의 형광을 발하는 형광 물질을 조합함으로써, 불용성 담체 입자에 형광이 흡수되지 않고, 효율적으로 검출할 수 있다. 즉, 적색 불용성 담체 입자에는 적색의 형광을 발하는 형광 물질을 사용한다. 이것을 면역검정에 사용함으로써, 피검출 물질의 양이 많은 경우에는, 육안 판정에 의해 신속하게 검출할 수 있고, 피검출 물질의 양이 적은 경우에는, 전용 장치를 사용하여 고감도로 검출할 수 있다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
[1] 면역검정에 사용하는, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자로서, 상기 가시역 착색 불용성 담체 입자에 의한 상기 형광 색소가 발하는 파장역의 형광의 흡수가 작은, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자.
[2] 표지에 사용하는 형광 색소가, 가시역 착색 불용성 담체 입자의 흡광 파장과 동일한 파장의 색과 보색의 관계에 있는 색의 파장의 형광을 발하는 형광 물질인, [1]의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자.
[3] 가시역 착색 불용성 담체 입자가, 청색으로 착색된 입자이며, 형광 색소가 발하는 형광의 파장이 450 ㎚∼570 ㎚인, [1] 또는 [2]의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자.
[4] 가시역 착색 불용성 담체 입자가, 청색으로 착색된 입자이며, 형광 색소가 플루오레세인 또는 플루오레세인이소티오시아네이트인, [3]의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자.
[5] 가시역 착색 불용성 담체 입자가, 적색으로 착색된 입자이며, 형광 색소가 발하는 형광의 파장이 590 ㎚∼750 ㎚인, [1] 또는 [2]의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자.
[6] 가시역 착색 불용성 담체 입자가, 적색으로 착색된 입자이며, 형광 색소가 ATBTA-EU3＋인, [5]의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자.
[7] 불용성 담체 입자가 폴리스티렌 라텍스 입자인, [1]∼[6] 중 어느 하나의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자.
[8] [1]∼[7] 중 어느 하나의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 사용한 면역검정 방법.
[9] 측정하고자 하는 항원 또는 항체를 포함하는 항원 항체 복합체에 [1]∼[7] 중 어느 하나의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 결합시켜, 불용성 담체 입자의 착색을 육안에 의해 관찰하거나, 및/또는 불용성 담체 입자로부터 발해지는 형광을 측정함으로써 항원 항체 복합체의 존재를 결정하는 것을 포함하는, [8]의 면역검정법.
[10] 면역크로마토그래피법인, [8] 또는 [9]의 면역검정법.
[11] [1]∼[7] 중 어느 하나의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 포함하는 면역검정 키트.
[12]
(i) 가시역 착색 불용성 담체 입자의 흡광 스펙트럼을 측정하는 공정,
(ii) 상기 가시역 착색 불용성 담체 입자의 흡수가 적은 파장역을 결정하는 공정,
(iii) 상기 파장역의 형광을 발하는 형광 색소를 선택하는 공정, 및
(iv) 선택한 형광 색소로 상기 가시역 착색 불용성 담체 입자를 표지하는 공정
을 포함하는, [1]∼[7] 중 어느 하나의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 조제하는 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원2013-100422호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
본 발명의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자의 존재는 육안에 의해 검출할 수도 있고, 형광 검출 장치를 사용하여 검출할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를, 담체 입자의 존재를 지표로 하여 피검출 물질을 측정하는 면역검정에 사용한 경우, 피검출 물질의 유무를 육안에 의해서도, 형광 검출 장치에 의해서도 판단할 수 있다. 본 발명의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 사용함으로써, 형광 검출 장치 등의 설비가 없는 시설, 장소에서도 POCT(Point Of Care Test)를 간편하게 행할 수 있고, 또한, 형광 검출 장치를 사용하여 형광을 측정함으로써, 보다 고정밀도의 측정도 행할 수 있다.
도 1은 백색 폴리스티렌 입자와 적색 폴리스티렌 입자의 흡광 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 2는 백색 폴리스티렌 입자와 청색 폴리스티렌 입자의 흡광 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 백색 폴리스티렌 입자와 녹색, 황색 폴리스티렌 입자의 흡광 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
이하에서, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, 면역검정에 사용하기 위한, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자이다.
불용성 담체 입자란, 입자 자체가 액체에 불용성이며, 항원이나 항체를 결합시키고 유지하는 담체가 되는 입자를 말한다. 본 발명에 있어서는, 검사약 등의 기술 분야에서 사용되는 라텍스 입자를 사용할 수 있다. 라텍스 입자란, 콜로이드상(狀)으로 수중에 분산한 유탁액을 형성하는 입자를 말한다. 입자의 재질은 한정되지 않지만, 검사약 등의 기술 분야에서 항체, 항원, 리간드, 리셉터 등의 단백질을 결합하는 고상(固相) 담체의 재료에 사용되는 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리스티렌, 스티렌-아크릴산 공중합체 등의 스티렌 공중합체, 폴리카보네이트, 폴리메틸렌메타아크릴레이트(PMMA), 폴리비닐 톨루엔 등의 수지, 실리카, 셀룰로오스 등이 있다. 이 중에서도, 스티렌을 베이스로 하는 입자가 바람직하다. 스티렌을 베이스로 하는 입자란, 폴리스티렌이나 스티렌 또는 스티렌의 유도체와 중합성 불포화 카르본산이나 중합성 불포화 술폰산 등과의 공중합체를 말한다. 스티렌의 유도체로서는, 클로로메틸스티렌, 디비닐벤젠 등을 예로 들 수 있고, 중합성 불포화 카르본산으로서는, 아크릴산, 메타크릴산 등을 예로 들 수 있고, 중합성 불포화 술폰산으로서는, 스티렌술폰산 소다 등을 예로 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 스티렌을 베이스로 하는 라텍스 입자를 폴리스티렌 라텍스 입자라고 하고, 간단하게 폴리스티렌 입자라고 하는 경우도 있다. 또한, 내부나 표면에 철, 니켈, 코발트 등의 자성체를 포함시킨 자성체 입자라도 된다.
사용하는 입자의 입경(粒徑)은, 10 ㎚∼수백 ㎚, 바람직하게는 30 ㎚∼500 ㎚이다.
가시역 착색 입자란, 사람이 눈으로 보아서 인식할 수 있는 색으로 착색된 입자를 말한다. 상기 가시역 착색 입자는, 특정 파장의 가시광선을 반사함으로써, 사람이 그 반사된 가시광선에 의해 색을 인식할 수 있다. 가시광선은, 파장 380 ㎚∼750 ㎚정도의 광선이다. 착색 입자의 색은, 유채색으로서 색상으로 표현되며, 적색, 등색(橙色), 황색, 녹색, 청색, 보라색 등이 있고, 각 색은 이하의 특정 파장의 가시광선을 반사함으로써 사람에게 그 색으로 착색되어 있는 것으로 인식된다.
적색 620∼750 ㎚
등색 590∼620 ㎚
황색 570∼590 ㎚
녹색 495∼570 ㎚
청색 450∼495 ㎚
보라색 380∼450 ㎚
가시역 착색 입자는, 상기한 입자를 각 색의 색소로 염색함으로써 제조할 수 있다. 색소에 의한 염색은, 입자 표면의 염색이라도 되지만, 색소의 탈리(脫離)를 방지하기 위하여, 색소를 입자에 배이게 함으로써 입자 내부도 염색하는 것이 바람직하다. 또한, 단독 색소로 염색하는 것도 가능하지만, 복수의 색소로 염색함으로써 임의의 색으로 착색된 가시역 착색 입자를 얻을 수 있다. 예를 들면, 적색 입자, 청색 입자, 녹색 입자, 황색 입자, 핑크색 입자 등의 각 색의 착색 입자를 제조할 수 있다. 착색에 사용하는 색소는 수지 등의 염색에 사용할 수 있는 공지의 색소를 사용할 수 있고, 예를 들면, 수단 블루(Sudan Blue), 수단 III(Sudan III), 수단 레드 IV, 퀴니자린 그린(Quinizarin Green), 오일 오렌지 등의 염료나 안료를 사용하여 착색할 수 있다. 또한, 각종 재질로 이루어진, 각종 색으로 착색된 입자가 시판되고 있어, 이들 시판 착색 입자를 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서는, 상기한 가시역 착색 불용성 담체 입자는, 형광 색소로 표지한다. 표지는, 예를 들면, 형광 색소를 형광 표지제로 하여 가시역 착색 불용성 담체 입자에 결합시키면 된다. 결합시키는 형광 색소의 종류는 한정되지 않고, 검사약 등의 분야에서 사용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 이 때, 형광 색소는 형광 색소로부터 발하는 형광의 가시역 착색 입자로의 흡수가 작은 형광 색소를 선택한다. 이는, 가시역 착색 입자에 결합시킨 형광 색소로부터 발해지는 형광이 입자에 흡수되면, 충분한 강도의 형광을 입자로부터의 시그널로서 측정할 수 없게 되기 때문이다. 형광 색소로부터 발하는 형광이 가시역 착색 입자에 흡수되지 않는 형광이란, 가시역 착색 입자가 흡수하는 광의 파장역과 형광 색소로부터 발해지는 형광의 파장역이 중복되지 않는 것을 말한다. 예를 들면, 사용하는 가시역 착색 입자의 흡광 스펙트럼을 흡광 광도계를 사용하여 측정하고, 가시역 착색 입자의 흡수가 작은 파장역의 형광을 발하는 형광 색소를 사용하면 된다. 가시역 착색 입자의 흡수가 작은 파장역은, 상기 가시역 착색 입자의 흡수가 큰 파장역의 색과 보색의 관계에 있는 색의 파장역이며, 불용성 담체 입자의 흡광 파장과 동일한 파장의 색과 보색의 관계에 있는 색의 파장의 형광을 발하는 형광 물질을 사용할 수 있다. 예를 들면, 적색 입자는, 적색광을 반사하므로, 사람이 시각에 의해 적색으로 착색되어 있는 것으로 인식한다. 한편, 적색 착색 입자는, 적색과 보색의 관계에 있는 색의 광을 흡수한다. 적색광의 파장은 620∼750 ㎚ 부근이다. 적색과 보색의 관계에 있는 색은 청색으로부터 녹색이며, 청색광의 파장은 450∼495 ㎚ 부근, 녹색광의 파장은 495 ㎚∼570 ㎚ 부근이다. 따라서, 적색의 가시역 착색 입자를 사용하는 경우에는, 청색으로부터 녹색과 보색의 관계에 있는 색의 파장의 형광을 발하는 형광 색소를 사용하면 된다. 청색으로부터 녹색까지의 색과 보색의 관계에 있는 색은 등색으로부터 적색이며, 그 파장은 590 ㎚∼750 ㎚ 부근이다. 따라서, 적색으로 착색된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 사용하는 경우에는, 590 ㎚∼750 ㎚, 바람직하게는 590 ㎚∼650 ㎚의 파장역의 형광을 발하는 형광 색소를 사용하면 된다.
또한, 청색 입자는, 청색광을 반사하므로, 사람이 시각에 의해 청색으로 착색되어 있는 것으로 인식한다. 한편, 청색 착색 입자는, 청색과 보색의 관계에 있는 색의 광을 흡수한다. 청색광의 파장은 450∼495 ㎚ 부근이다. 청색과 보색의 관계에 있는 색은 등색으로부터 적색이며, 등색 광의 파장은 590∼620 ㎚ 부근, 적색광의 파장은 620 ㎚∼750 ㎚ 부근이다. 따라서, 청색의 가시역 착색 입자를 사용하는 경우에는, 등색으로부터 적색까지의 색과 보색의 관계에 있는 색의 파장의 형광을 발하는 형광 색소를 사용하면 된다. 등색으로부터 적색까지의 색과 보색의 관계에 있는 색은 청색으로부터 녹색이며, 그 파장은 450 ㎚∼570 ㎚ 부근이다. 따라서, 청색으로 착색된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 사용하는 경우에는, 450 ㎚∼570 ㎚, 바람직하게는 500 ㎚∼550 ㎚의 파장역의 형광을 발하는 형광 색소를 사용하면 된다. 또한, 청색 입자는 600 ㎚∼700 ㎚의 흡수가 커지는 경향이 있으므로, 이 파장역을 피하여, 600 ㎚∼700 ㎚보다 저파장역의 형광을 발하는 형광 색소가 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 사용하고자 하는 가시역 착색 입자의 흡광 스펙트럼을 흡광 광도계에 의해 측정하고, 흡수가 작은 광의 파장역을 결정하고, 상기 파장역의 형광을 발하는 형광 색소를 선택하고, 이하에 기재된 방법으로, 상기 가시역 착색 입자에 결합시키면 된다. 이와 같은 형광 색소를 사용함으로써, 형광 색소로부터 발해진 형광의 가시역 착색 불용성 담체 입자로의 흡수를 낮게 억제할 수 있으므로, 충분한 형광 강도를 얻을 수 있다.
가시역 착색 입자의 형광 표지에 사용하는 형광 색소로서는, 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 쿠마린, Cy dye, Alexa(등록상표) Fluor, EvoBlue, 옥사진, 카르보피로닌(Carbopyronin), 나프탈렌(naphthalene), 비페닐(biphenyl), 안트라센(anthracene), 페넨트렌(phenenthrene), 피렌(pyrene), 카르바졸(carbazole) 등을 기본 골격으로서 가지는 유기 형광 색소나 그 형광 색소의 유도체를 예로 들 수 있다. 또한, 유로퓸(EU3＋) 킬레이트나 테르븀(Tb3 ＋) 킬레이트 등의 희토류 착체도 사용할 수 있다. 유로퓸(EU3＋) 킬레이트로서 아미노기를 가지는 ATBTA([4'-(4'-Amino-4-biphenylyl)-2,2':6',2"-terpyridine-6,6"-diylbis(methyliminodiacetato)]europate(III))-EU3＋ 등을 사용할 수 있다. 또한, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein)(GFP) 등의 형광 단백질도 사용할 수 있다.
형광 색소에 의한 가시역 착색 입자의 표지는, 사전에 상기한 가시역 착색 입자에 카르복실기, 아미노기, 술폰산기, 티올기, 알데히드기 등의 관능기를 도입해 두고 상기 형광 색소에도 관능기를 도입하고, 관능기끼리의 결합 반응에 의해 형광 색소를 가시역 착색 입자에 결합시킴으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 아미노기와 카르복실기를 아미드 결합에 의해 결합시키거나, 티올기끼리를 디술피드 결합에 의해 결합시킬 수 있다. 또한, 관능기끼리를 가교 시약을 사용하여 결합시킬 수도 있다. 가교 시약으로서, N-하이드록시숙신이미드에스테르, 말레이미드, EDAC(N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염), 글루타르알데히드 등을 예로 들 수 있다. 또한, 형광 색소로서 희토류 착체를 사용하는 경우, 아미노기를 도입한 ATBTA-EU3＋ 등을 사용하면 된다. 또한, 형광 단백질을 사용하는 경우에는, 관능기끼리의 결합을 이용할 수도 있지만, 형광 단백질을 가시역 착색 입자에 물리적 흡착을 이용하여 결합시킬 수도 있다. 아미노기나 카르복실기를 도입한 형광 색소는 시판중인 것을 사용할 수 있다.
또한, 가시역 착색 불용성 담체 입자의 주재료에 사전에 형광 색소를 혼입시켜 둘 수도 있다. 예를 들면, 불용성 담체 라텍스 입자의 재료가 되는 수지 등에 형광 색소와 가시역 착색 색소를 반죽 등에 의해 함유시켜, 불용성 담체 입자를 제작할 수 있다. 또한, 형광 불용성 담체 입자를 가시역 착색 색소에 의해 표지할 수도 있다. 여기서, 형광 불용성 담체 입자란, 형광 색소를 결합시킨 불용성 담체 입자 외에, 형광을 발할 수 있는 물질로 이루어진 불용성 담체 입자도 포함한다. 이와 같은 입자로서, 예를 들면, 유로퓸(Eu), 테르븀(Tb) 등의 희토류 원소가 활성화된 MIMIIO4 또는 MIAl5O12(MI은 이트륨(Y), 란탄(La) 또는 가돌리늄(Gd), MII는 니오브(Nb), 인(P) 또는 바나듐(V))로 이루어지는 입자가 있으며, 일본공개특허 제2012-32263호 공보에 기재된 것을 사용할 수 있다. 또한, 가시역 착색 색소란, 사람이 눈으로 볼 때 인식할 수 있는 색으로 착색된 색소를 말하며, 수지 등의 염색에 사용할 수 있는 공지의 색소를 사용할 수 있고, 예를 들면, 수단 블루, 수단 III, 수단 레드 IV, 퀴니자린 그린, 오일 오렌지 등의 염료나 안료가 있다. 예를 들면, 불용성 담체 라텍스 입자의 재료가 되는 수지 등에 형광 색소를 반죽 등에 의해 함유시켜, 불용성 담체 입자를 제작하고, 그 후, 가시역 착색 색소에 의해 염색할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 이들 형광 색소를 혼입한 주재료를 사용하여 제조한 가시역 착색 불용성 담체 입자, 및 가시역 착색 색소에 의해 표지된 형광 불용성 담체 입자도, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자라고 한다. 즉, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자란, 형광을 발하고, 또한 가시역의 색으로 착색된 모든 불용성 담체 입자를 포함한다.
본 발명에 사용할 수 있는 형광 색소 및 그 형광 파장(㎚)을 괄호 내에 나타낸다. 형광 파장은 측정 조건 등에 따라, 하기 파장에 전후한다. 하기 파장의 ±수십 ㎚, 예를 들면, ±25 ㎚의 범위에서 측정할 수 있다. 이들 형광 색소는 일례이며, 이들로 한정되지 않고. 각종 형광 색소를 그 형광 파장에 기초하여 사용할 수 있다.
유기 형광 색소
Dylight405(420), DY-405(420), Cascade Blue(420), Alexa Fluor405(421), AMCA(440), Alexa-350(442), AMCA-X(447), Pacific Blue(455), Marine Blue(460), DY-415(467), Royal Blue(480), ATTO425(484), Cy2(505), ATTO465(508), DY-475XL(509), NorthernLights493(514), BODIPY 505/515(515), DY-490(516), Dylight488(518), Alexa-488(519), 5-FITC(519), FAM(520), DY-495-X5(520), DY-495(521), 플루오레세인(Fluorescein)(521), FITC(플루오레세인이소티오시아네이트)(522), ATTO488(523), HiLyte Flour488(523), MFP488(523), ATTO495(527), OG-488(524), Rhodamine110(525), OG-514(530), Oyster500(530), Spectrum Green(538), Alexa-430(541), ATTO520(545), ATTO532(553), Cas Y(554), Alexa-532(554), DY-500XL(555), DY-485XL(560), Alexa-555(565), HiLyte Plus 555(552/567), DyLight549(568), HiLyte Fluor555(568), Cy3(565), Dylight547(570), Rhodamine(570), TRITC(570), DY548(572), DY-554(572), DY-555(572), Alexa Fluor 546(573), DY-556(573), NorthernLights557(574), Oyster550(574), 5-TAMRA(574), DY-505-X5(574), DY-547(574), Oyster 556(575), DY-549(575), Alexa-546(575), ATTO550(576), PE(578), B-PE(578), R-PE(578), DY-560(578), TAMRA(580), Tetramethyl rhodamine(578), RITC/TMR(580), MFP555(585), Spectrum Orange(588), DY-510XL(590), Rhodamine B(590), ATTO565(592), Cy3.5(596), ROX(Rhodamine Red X)(599), DY-590(599), 5-ROX(602), Alexa-568(603), BODIPY 580/605(605), Spectrum Red(612), ECD(613), Texas Red(615), DyLight594(618), Alexa Flour594(619), HiLyte Fluor TR(622), ATTO590(624), MFP590(624), DY-610(630), DY480XL(630), ATTO610(634), DY-615(641), C-Phycocyanin(647), ATTO620(643), Alexa-633(647), Phycocianin(650), DY-481XL(650), ATTO633(657), DY-630(657), DY-632(657), DY-633(657), MFP631(658), DyLight633(658), NorthernLights637(658), DY-631(658), DY-634(658), APC(Allophycocyanin)(660), APC-XL(660), DY-520XL(664), Alexa-647(668), Cy5(667), DY-521XL(668), Oyster645(669), Quantum Red(670), DY-635(671), DY-636(671), DY-647(673), DyLight647(673), HiLyte Fluor(647), DyLight649(674), HiLyte Plus647(674), Oyster650(674), DY-648(674), DY-650(674), PerCP(675), DY-652(675), DY-649(676), DY-651(678), Oyster656(679), ATTO655(684), Alexa-660(690), Cy5.5(694), DY-677(694), DY-678(698), HiLyte Fluor680(699), DY-675(699), DY-676(699), IRDye700DX(700), Alexa-680(702), DY-681(708), DY-680(709), DY-682(709), DyLight680(715), Alexa Fluor700(723), DY-700(730), DY-701(731), DY-730(758), DY-732(759), DY-734(759), DY-731(760), DY-752(772), DY-750(776), DyLight750(778), HiLyte Fluor750(778), DY-749(778), HiLyte Plus750(779), APC7(779), DY-751(779), DyLight800(794), IRDye800CW(800), DY-780(800), DY-781(800), DY-782(800), DY-776(801), DY-777(801), IRDye800(806) 등.
희토류 착체
ATBTA-EU3＋(616) 등.
형광 단백질
Sirius(424), CFP(505), AcGFP(505), EGFP(509), EYFP(527), YFP(527), ZsYellow(539), mOrange(562), DsRed2(582), AsRed2(592), mRFP1(607), mCherry(610), HcRed(618), mRasberry(625), mPlum(649) 등.
예를 들면, 가시역 착색 입자로서 청색 폴리스티렌 라텍스 입자를 사용하는 경우, 청색 폴리스티렌 라텍스 입자는 600∼700 ㎚ 부근에 흡수의 피크를 가지므로, 예를 들면, 이보다 낮은 파장역, 예를 들면, 450∼550 ㎚ 부근, 바람직하게는 500 ㎚ 부근에 형광 파장을 가지는 형광 색소를 사용하면 된다. 이와 같은 형광 색소로서, 예를 들면, 형광 파장이 521 ㎚인 플루오레세인을 들 수 있다. 또한, 가시역 착색 입자로서 적색 폴리스티렌 라텍스 입자를 사용하는 경우, 적색 폴리스티렌 라텍스 입자는 500∼550 ㎚ 부근에 흡수의 피크를 가지므로, 예를 들면, 이보다 높은 파장역, 예를 들면, 600∼700 ㎚ 부근에 형광 파장을 가지는 형광 색소를 사용하면 된다. 이와 같은 형광 색소로서, 예를 들면, 형광 파장이 616 ㎚인 ATBTA-EU3＋가 있다.
본 발명의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자는, 사람의 눈으로 색을 인식할 수 있고, 또한 형광 색소로부터 형광을 발한다. 불용성 담체 입자를 면역검정에 사용하는 경우, 불용성 담체 입자에 항원 또는 항체를 결합시키고, 피험체 시료 중의 항체 또는 항원을 결합시키고, 항원과 항체의 복합체가 형성된 불용성 담체 입자를 회수 또는 집적시키고, 불용성 담체 입자의 존재의 유무에 의해, 피험체 시료 중의 항체 또는 항원의 존재를 측정한다. 본 발명의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 면역검정에 사용한 경우, 색을 육안에 의해 확인하는 육안 판정에 의해 항체 또는 항원의 존재를 측정할 수도 있고, 또한 불용성 담체로부터 발해지는 형광을 형광 검출 장치에 의해 측정하는 것에 의해서도, 항체 또는 항원의 존재를 측정할 수 있다.
항원 또는 항체를 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자에 결합시키기 위해서는, 불용성 담체 입자에 형광 색소를 결합시키는 방법과 동일한 방법으로, 불용성 담체 입자의 관능기와 항원 또는 항체의 관능기를 결합시키면 된다. 또한, 항원 또는 항체를 불용성 담체 입자에 물리적 흡착에 의해 결합시킬 수도 있다.
본 발명은, 상기한 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 조제하는 방법도 포함하며, 상기 조제 방법은, (i) 가시역 착색 불용성 담체 입자의 흡광 스펙트럼을 측정하는 공정, (ii) 상기 가시역 착색 불용성 담체 입자의 흡수가 적은 파장역을 결정하는 공정, (iii) 상기 파장역의 형광을 발하는 형광 색소를 선택하는 공정, 및 (iv) 선택한 형광 색소로 상기 가시역 착색 불용성 담체 입자를 표지하는 공정을 포함한다.
본 발명의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 이용하는 면역검정은 한정되지 않으며, 면역크로마토그래피법, 응집법 등을 예로 들 수 있지만, 면역크로마토그래피법이 바람직하다. 면역크로마토그래피법은 공지의 면역크로마토그래피법용 디바이스를 사용하여 공지의 방법으로 행할 수 있다. 본 발명은, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 이용하는 면역검정 방법도 포함한다. 상기 방법은, 측정하고자 하는 항원 또는 항체를 포함하는 항원 항체 복합체에, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 결합시켜, 불용성 담체 입자의 착색을 육안에 의해 관찰하거나, 및/또는 불용성 담체 입자로부터 발해지는 형광을 측정함으로써 항원 항체 복합체의 존재를 결정하는 것을 포함한다. 즉, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자의 색 또는 형광에 기초하여, 항원 또는 항체를 측정한다. 측정은, 정성적 측정도 포함하고 정량적 측정도 포함한다.
예를 들면, 피험체 시료 중의 항원을 검출하는 면역크로마토그래피법에 있어서는, 니트로셀룰로오스막 등의 적절한 고상 지지체 상의 소정의 위치(검출 부위)에 피검출 물질인 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 고상화(固相化)하고, 상기 고상 지지체에 모세관 현상을 이용하여, 본 발명의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자로서, 검출하고자 하는 항체가 특이적으로 결합하는 항원을 결합시킨 불용성 담체 입자와 피검출 물질의 복합체를 고상 지지체 상으로 전개 이동시킨다. 이 때, 불용성 담체 입자와 피검출 물질을 혼합한 후에, 고상 지지체 상의 소정의 위치(시료 첨가 부위)에 혼합물을 첨가할 수도 있고, 사전에 고상 지지체 상에 불용성 담체 입자를 고상화해 두고(표지 부위), 첨가한 시료 액체에 의해 불용성 담체 입자를 용해시켜, 불용성 담체 입자를 피검출 물질의 복합체를 형성시킬 수도 있다. 그 결과, 고상화한 항원-피검출 물질인 항체-형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자의 복합체가 고상 지지체 상의 검출 부위에 형성된다. 검출 부위에서의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자의 존재를 육안으로 또는 형광 검출 장치에 의해 측정함으로써, 피검출 물질을 검출할 수 있다. 피험체 시료 중의 항체를 측정하는 경우에는, 고상 지지체에, 측정하고자 하는 항체가 특이적으로 결합하는 항원을 고상화하고, 또한 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자에 상기 항원을 결합시키면 된다.
본 발명의 방법에서의 피검출 물질은 한정되지 않으며, 예를 들면, HIV, 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스 등의 바이러스, 황색포도구균, 폐렴쌍구균, 장관(腸管) 출혈성 대장균 등의 세균 등이 있다. 시료도 한정되지 않으며, 피험체로부터 채취한 인두(咽頭) 또는 비강(鼻腔)을 닦은 액, 인두 또는 비강 세정액, 비강 흡인액, 타액, 혈청, 혈장, 변, 변 현탁액, 뇨, 또는 배양액 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 피검출 물질의 항원 또는 항체를 결합시킨, 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자를 포함하는 검출용 면역검정 키트도 포함한다. 상기 키트는, 면역크로마토그래피법용 디바이스, 브로셔(brochure) 등을 포함한다.
[실시예]
본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예의 기재에 있어서, %는 중량%를 나타낸다.
실시예 1 관능기로서 카르복실기를 가지는 착색 폴리스티렌 입자를 사용한 형광 색소로 표지된 가시역 착색 형광 입자의 조제
1. 유로퓸 킬레이트 형광 표지제의 결합
10 mM HEPES(pH 7.0) 완충액으로 관능기로서 카르복실기를 가지는 복수 색의 착색 폴리스티렌 입자(표 1 및 도 1∼3 참조)를 0.1%가 되도록 희석하고, 여기에 유로퓸 킬레이트 형광 표지제인 ATBTA-Eu3 ＋(도쿄 화성 공업 주식회사 제조)를 0.1 mg/mL가 되도록 가하였다. 교반한 후, 카르보디이미드를 1%가 되도록 가하여 교반하고, 실온에서, 1시간 반응시켰다. 7000 g, 30분간 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA에 재부유(再浮遊)시켰다.
2. 아미노플루오레세인 형광 표지제의 결합
10 mM HEPES(pH 7.0) 완충액으로 관능기로서 카르복실기를 가지는 몇 색의 착색 폴리스티렌 입자(표 1 및 도 1∼3 참조)를 0.1%가 되도록 희석하고, 여기에 6-아미노플루오레세인(도쿄 화성 공업 주식회사 제조)을 0.1 mg/mL가 되도록 가하였다. 교반한 후, 카르보디이미드를 1%가 되도록 가하여 교반하고, 실온에서, 1시간 반응시켰다. 7000 g, 30분간 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA에 재부유시켰다.
사용한 가시역 착색 폴리스티렌 라텍스 입자를 표 1에 나타내고, 각 입자의 흡광 스펙트럼을 도 1∼3에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112015120980044-pct00001
3. 유로퓸 킬레이트 형광 표지제 결합 폴리스티렌 입자의 형광 강도의 측정
1.에서 조제한 유로퓸 킬레이트 형광 표지제 결합 폴리스티렌 입자를 0.01%가 되도록 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA로 희석하고, 100μL를 96 웰의 플로오로눈크(Fluoro nunc) 프레이트의 웰에 가하고, 형광 플레이트 리더(MTP-650 FA; 코로나전기 주식회사 제조)를 사용하여, 340㎚ ex/615㎚ em으로 형광 강도를 측정하였다. 대조군으로서, 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA만으로, 유로퓸 킬레이트 형광 표지제를 결합하고 있지 않은 가시역 착색 폴리스티렌 입자도 동시에 측정을 행하였다.
그 결과, 유로퓸 킬레이트 형광 표지제를 결합하고 있지 않은 가시역 착색 폴리스티렌 입자는, 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA의 형광 강도와 비교하여 거의 동등하거나 매우 낮은 강도를 나타낸다. 유로퓸 킬레이트 형광 표지제를 결합한 가시역 착색 폴리스티렌 입자에 있어서는, 흡광 스펙트럼에 있어서 615 ㎚ 부근의 흡수가 작은 적색 폴리스티렌 입자, 황색 폴리스티렌 입자 1종에 있어서 300 이상의 형광 강도를 나타내고, 다음으로, 녹색 폴리스티렌 입자가 160 정도의 강도를 나타내고, 615 ㎚ 부근에 강한 흡수를 나타낸 청색 폴리스티렌 입자 2종에 대해서는, 100 이하의 강도를 나타내어, 낮았다. 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112015120980044-pct00002
4. 플루오레세인 형광 표지제 결합 폴리스티렌 입자의 형광 강도의 측정
2.에서 조제한 플루오레세인 형광 표지제 결합 폴리스티렌 입자를 0.05%가 되도록 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA로 희석하고, 100μL를 96 웰의 플로오로눈크 플레이트의 웰에 가하고, 형광 플레이트 리더(MTP-650FA; 코로나전기 주식회사 제조)를 사용하여, 490㎚ ex/530㎚ em으로 형광 강도를 측정하였다. 대조군으로서, 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA만으로, 플루오레세인 형광 표지제를 결합하고 있지 않은 가시역 착색 폴리스티렌 입자도 동시에 측정을 행하였다.
그 결과, 플루오레세인 형광 표지제를 결합하고 있지 않은 가시역 착색 폴리스티렌 입자는, 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA의 형광 강도와 비교하여 거의 동등하거나 매우 낮은 강도를 나타낸다. 플루오레세인 형광 표지제를 결합한 가시역 착색 폴리스티렌 입자에 있어서는, 흡광 스펙트럼에 있어서 530 ㎚ 부근의 흡수가 작은 황 색폴리스티렌 입자 1종에서 500 이상의 강도로 되고, 다음으로, 흡수가 작은 녹색 폴리스티렌 입자 1종에서 170의 강도, 그 다음으로, 흡수가 작은 청색 폴리스티렌 입자 2종에서는 70 이상이 되고, 530 ㎚ 부근에 강한 흡수를 나타낸 적색 폴리스티렌 입자에서 강도가 낮았다. 결과를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure 112015120980044-pct00003
이상의 유로퓸 킬레이트 형광 표지제 및 아미노플루오레세인 형광 표지제를 결합한 착색 폴리스티렌 입자의 흡광 스펙트럼과 형광 강도의 결과로부터, 불용성 담체 입자에 결합하여 효율적으로 형광을 검출할 수 있는 것은, 결합하는 형광 물질의 형광 파장의 흡수가 작은 불용성 담체 입자에 형광 표지제를 결합시키는 경우이며, 강한 흡수를 가지는 불용성 담체 입자에서는 효율적으로 형광을 측정할 수 없는 것이 밝혀졌다.
실시예 2 관능기로서 카르복실기를 가지는 가시역 착색 폴리스티렌 입자로의 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 및 형광 표지제의 결합과 이것을 사용한 면역크로마토그래피법에 의한 A형 인플루엔자 바이러스 NP 항원의 검출
실시예 2에 있어서는, 가시역 착색 폴리스티렌 입자를 비교하여, 시인성(視認性)이 높았던 적색 폴리스티렌 입자 및 청색 폴리스티렌 입자 I를 재료로 하여 검증을 실시하였다.
1. 항 A형 인플루엔자 바이러스 NP 모노클로날 항체의 제작
A형 인플루엔자 바이러스 항원을 BALB/c 마우스에 면역하고, 일정 기간 사육한 마우스로부터 비장을 적출하고, 켈러 등의 방법(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))에 의해 마우스 골수종 세포(P3×63)와 융합했다. 얻어진 융합 세포(하이브리도마)를, 37℃ 인큐베이터 중에서 유지하고, A형 인플루엔자 바이러스 NP 항원을 고상한 플레이트를 사용한 ELISA에 의해 상청액의 항체 활성을 확인하면서 세포의 순화(단클론화)를 행하였다. 취득한 상기 세포 2주를 각각 프리스탄 처리한 BALB/c 마우스의 복강에 투여하고, 약 2주일 후, 항체 함유 복수(復水)를 채취하였다.
얻어진 복수로부터 프로틴 A 컬럼을 사용한 어피니티크로마토그래피법에 의해, 각각 IgG를 정제하고, 2종류의 정제 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 얻었다.
2. 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인로의 고정화
정제한 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 1.0 mg/mL가 되도록 정제수로 희석한 액을 PET 필름으로 백킹(backing)된 니트로셀룰로오스 멤브레인(Unisart CN 95; Sartorius Stedim Biotech사 제조)의 소정의 위치에 선형으로 도포하고, 45℃에서, 30분간 건조시켜, 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 고정화 멤브레인을 얻었다(이하, 항체 고정화 멤브레인이라고 함).
3. 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체와 형광 표지 물질의 가시역 착색 폴리스티렌 입자로의 고정화
니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화에 사용하지 않았던 다른 하나의 정제한 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 1.0 mg/mL가 되도록 정제수로 희석하고, 여기에 적색 폴리스티렌 입자 또는 청색 폴리스티렌 입자 I을 0.1%가 되도록 가하고, 교반한 후, 또한 적색 폴리스티렌 입자와 항체의 혼합액에는, 유로퓸 킬레이트 형광 표지제인 ATBTA-Eu3 ＋(도쿄 화성 공업 주식회사 제조)를 0.1 mg/mL가 되도록 가하였다. 한편, 청색 폴리스티렌 입자 I과 항체의 혼합액에는, 6-아미노플루오레세인(도쿄 화성 공업 주식회사 제조)을 0.1 mg/mL가 되도록 가하고, 교반했다. 각각에 카르보디이미드를 1%가 되도록 가하고, 더 교반했다. 실온에서, 1시간 반응시켰다. 7000 g, 30분간 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA에 재부유시키고, 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 ＋ 유로퓸 킬레이트 결합 적색 폴리스티렌 입자 및 항A형 인플루엔자 바이러스 항체 ＋ 플루오레세인 결합 청색 폴리스티렌 입자를 얻었다.
4. A형 인플루엔자 바이러스 NP 항원의 면역크로마토그래피법에 의한 검출
2.에서 얻은 항체 고정화 멤브레인를 백킹 시트, 흡수대, 콘쥬게이트 패드, 샘플 패드를 접합하여, 시험편으로 하였다.
3.에서 얻은 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 ＋ 유로퓸 킬레이트 결합 적색 폴리스티렌 입자 및 항A형 인플루엔자 바이러스 항체 ＋ 플루오레세인 결합 청색 폴리스티렌 입자를 0.1%가 되도록 50 mM Tris(pH 9.0), 3% BSA로 희석하고, 희석 적색 입자 및 희석 청색 입자로 하였다.
A형 인플루엔자 바이러스 NP 항원을 검체 부유액(10 mM Tris(pH7.0), 3% BSA, 0.2% Triton X-100)을 사용하여 희석한 항원 희석액을 조제하였다.
상기한 항원 희석액 100μL와 희석 적색 입자 5μL 또는 희석 청색 입자 5μL를 혼합하고, 각각 시험편의 샘플 패드에 전량을 적하하였다. 15분간 정치한 후, 육안으로, 테스트 라인의 유무를 확인하고, 또한 UV 트랜스 일루미네이터(Benchtop 2 UV transilluminator; UVP사 제조) 상에서, 형광을 육안으로, 확인하였다. 희석 적색 입자에서는 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체만을 결합한 적색 폴리스티렌 입자를 대조군으로 하여, 검출 한계의 비교 검토를 행하였다.
그 결과, 항원을 포함하지 않는 검체 부유액으로 시험한 시험편에서는, 육안과 UV 트랜스 일루미네이터에 의한 형광 모두에서 테스트 라인은 확인하지 못하였고, 항원을 포함하는 검체 부유액으로 시험한 시험편에서는, 육안에 의해 착색의 테스트 라인을 확인할 수 있고, 또한 UV 트랜스 일루미네이터에 의한 형광의 테스트 라인을 확인할 수 있었다. 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure 112015120980044-pct00004
또한, 항A형 인플루엔자 바이러스 NP 항체만을 결합한 적색 폴리스티렌 입자와 희석 적색 입자를 사용한 검출 한계의 비교 검토의 결과, 착색 육안 판정에 의한 검출 한계는 변함이 없고, 형광 육안 판정에 있어서, 2배 높은 감도를 얻을 수 있었다. 결과를 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure 112015120980044-pct00005
이상의 결과로부터, 본법으로 조제한 형광 물질 결합 착색 입자를 면역크로마토그래피법에 사용함으로써, 육안에 의한 착색 테스트 라인의 판정과 장치를 사용한 형광 테스트 라인의 측정이 가능한 것이 밝혀졌다. 또한, 본 실시예에서는 형광을 육안에 의해 판정하고 있지만, 장치를 사용하여 검출함으로써 보다 고감도로 검출할 수 있는 것으로 여겨진다.
[산업상 이용가능성]
본 발명의 형광 색소로 표지된 가시역 착색 불용성 담체 입자는 면역크로마토그래피법 등의 면역검정에 사용할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에서 원용한다.

Claims (12)

  1. 면역검정(immunoassay)에 사용하는, 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자로서, 표지에 사용하는 형광 색소가, 가시역 착색 불용성 담체 입자의 흡광 파장과 동일한 파장의 색과 보색의 관계에 있는 색의 파장 형광을 발하는 형광 물질이며, 가시역 착색 불용성 담체 입자가 450nm~495nm의 가시광선을 반사하는 색소로 착색된 입자이고, 형광 색소가 발하는 형광의 파장이 450nm~570nm인, 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자.
  2. 제1항에 있어서,
    가시역 착색 불용성 담체 입자가, 450nm~495nm의 가시광선을 반사하는 색소로 착색된 입자이며, 형광 색소가 플루오레세인 또는 플루오레세인이소티오시아네이트인, 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자.
  3. 면역검정에 사용하는, 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자로서, 표지에 사용하는 형광 색소가, 가시역 착색 불용성 담체 입자의 흡광 파장과 동일한 파장의 색과 보색의 관계에 있는 색의 파장 형광을 발하는 형광 물질이며, 가시역 착색 불용성 담체 입자가 620nm~750nm의 가시광선을 반사하는 색소로 착색된 입자이고, 형광 색소가 발하는 형광의 파장이 590nm~750nm인, 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자.
  4. 제3항에 있어서,
    가시역 착색 불용성 담체 입자가, 620nm~750nm의 가시광선을 반사하는 색소로 착색된 입자이며, 형광 색소가 ATBTA-EU3＋인, 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    불용성 담체 입자가 폴리스티렌 라텍스 입자인, 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자.
  6. 측정하고자 하는 항원 또는 항체를 포함하는 항원 항체 복합체에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자를 결합시켜, 불용성 담체 입자의 착색을 육안에 의해 관찰하거나, 및/또는 불용성 담체 입자로부터 발해지는 형광을 측정함으로써 항원 항체 복합체의 존재를 결정하는 것을 포함하는 면역검정 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    면역크로마토그래피법(immunochromatography)인, 면역검정 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자를 포함하는 면역검정 키트.
  9. (i) 가시역 착색 불용성 담체 입자의 흡광 스펙트럼을 측정하는 공정,
    (ii) 상기 가시역 착색 불용성 담체 입자의 흡수가 적은 파장역을 결정하는 공정,
    (iii) 상기 파장역의 형광을 발하는 형광 색소를 선택하는 공정, 및
    (iv) 선택한 형광 색소를 상기 가시역 착색 불용성 담체 입자에 결합시키는 공정
    을 포함하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 형광 색소를 결합시킨 가시역 착색 불용성 담체 입자를 조제하는 방법.
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  11. 삭제
  12. 삭제
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