ES2901720T3

ES2901720T3 - Preparación de partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente, y método de inmunoensayo mediante el uso de dichas partículas

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Publication number: ES2901720T3
Application number: ES14794167T
Authority: ES
Original assignee: Denka Co Ltd
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2022-03-23
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Also published as: CN105358980A; US20160116481A1; KR20160005123A; KR102121324B1; US20190361029A1; JP6096586B2; JP2014219354A; EP2995954A1; EP2995954B1; CN105358980B; WO2014181863A1; EP2995954A4

Abstract

Partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, que son partículas de látex de poliestireno coloreadas en las que se han introducido grupos funcionales carboxilo y están marcadas con un colorante fluorescente mediante dichos grupos carboxilo, las cuales se utilizan para inmunoensayos de modo que el colorante usado para la marcación es una sustancia que emite fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario de un color cuya longitud de onda equivale a una longitud de onda de absorción de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, de forma que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color azul y la longitud de onda de la fluorescencia emitida por el colorante fluorescente es de 450 nm - 570 nm.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación de partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente, y método de inmunoensayo mediante el uso de dichas partículas

Ámbito técnico

La presente invención se refiere a un método para detectar de manera rápida y específica un analito contenido en una muestra y a un kit que usa este método.

Antecedentes

Los métodos de inmunoensayo realizados con partículas portadoras insolubles han sido de uso general hasta la fecha.

La realización de los métodos de inmunoensayo con partículas portadoras insolubles consta de las siguientes etapas: preparar una muestra de ensayo en la cual se ha inmovilizado un ligando capaz de unirse específicamente a una sustancia diana en un sitio determinado sobre una membrana de estructura fibrosa, por ejemplo de nitrocelulosa; dejar que partículas portadoras insolubles (p.ej. de oro coloidal, de platino-oro coloidal y/o de poliestireno coloreadas) sobre las cuales se ha inmovilizado un ligando capaz de unirse específicamente a una sustancia diana y una muestra que contenga una sustancia diana se desarrollen sobre la muestra de ensayo, haciendo uso de un fenómeno capilar, de modo que se forme un sándwich con la sustancia diana intercalada entre el ligando inmovilizado sobre la membrana de nitrocelulosa y el ligando inmovilizado sobre las partículas portadoras insolubles redisueltas; y detectar la sustancia diana por observación visual o mediante un aparato adecuado.

Las partículas portadoras insolubles (p.ej. de oro coloidal, de platino-oro coloidal y/o de poliestireno coloreadas) tienen la ventaja de poder ser detectadas por observación visual. Sin embargo, la sensibilidad de la detección no mejoraría decisivamente, aunque estas partículas portadoras insolubles se aplicaran sobre un aparato de detección adecuado. Por otra parte, cuando se utiliza un ligando marcado con una sustancia fluorescente o partículas portadoras insolubles que contienen una sustancia fluorescente, la sensibilidad de la detección puede mejorarse radicalmente mediante un aparato adecuado, lo cual es ventajoso. Sin embargo, en tal caso, dicho ligando o dichas partículas no son detectables por observación visual y se necesitan grandes cantidades de sustancias diana. Además, aunque la detección pueda llevarse a cabo dentro de un período corto de tiempo tras la observación visual, hay que utilizar un aparato destinado a tal fin, lo cual es contraproducente porque complica los procedimientos de detección.

Para resolver este problema se ha propuesto el uso de una mezcla de partículas portadoras insolubles, observables visualmente, con partículas fluorescentes (véase literatura de patentes 1). En este caso, sin embargo, los ligandos de las partículas portadoras insolubles y los ligandos de las partículas fluorescentes compiten entre sí. Por lo tanto, si la cantidad de una sustancia diana es muy pequeña, los ligandos de las partículas fluorescentes no se pueden unir a la sustancia diana y como resultado la sensibilidad no siempre es elevada. Además es problemática la baja eficiencia de la producción, porque hay que preparar por separado dos tipos de partículas portadoras insolubles.

También se ha propuesto la utilización de partículas compuestas para inmunocromatografía, las cuales se caracterizan porque el exterior de las partículas metálicas finas está recubierto por al menos una capa de sílice que contiene como mínimo un tipo de sustancia fluorescente (véase literatura de patentes 2). La presente invención se basa en la premisa de que la absorción de la luz por las partículas metálicas finas provoca la absorción de fluorescencia desde la sustancia fluorescente del lado exterior, lo cual significa que el tipo de sustancia fluorescente es limitado y que se requiere el uso de una capa de sílice. En este caso se requieren técnicas especiales para preparar tales partículas, lo que también es problemático. En la patente US 2009/289201 A1 (literatura de patentes 3) se describen perlas de látex coloreadas marcadas con colorante fluorescente, en las cuales el color de la perla es el mismo que el color emitido por el marcador fluorescente.

Lista de referencias

Literatura de patentes

Literatura de patentes 1: Publicación de patente JP (Kokai) n° 2010-014631 A

Literatura de patentes 2: Publicación de patente JP (Kokai) n° 2011-220705 A

Literatura de patentes 3: Publicación de patente US n° 2009/289201 A1

Resumen de la presente invención

Problema técnico

Las partículas portadoras insolubles usadas en los métodos de inmunoensayo han estado generalmente disponibles como productos de diagnóstico in vitro para pruebas en el punto de atención (POCT) y en particular se han empleado como ayuda diagnóstica para enfermedades infecciosas bacterianas o virales. Estas enfermedades infecciosas ponen a veces en peligro la vida, si afectan a bebés y ancianos con inmunidad comprometida. Las enfermedades infecciosas del virus de la gripe y similares también ponen en peligro la vida de niños y adultos. Por otra parte, hay antibióticos y medicamentos específicos para ciertas bacterias y virus, lo cual significa que un diagnóstico temprano puede dar lugar a un tratamiento fiable. Además, las enfermedades causadas por el virus de la gripe son muy infecciosas y por lo tanto pueden transmitir las infecciones en los hospitales y las salas de espera de las clínicas. En las circunstancias actuales es necesario que los productos de diagnóstico in vitro para las POCT sean muy sensibles y permitan la determinación en un período de tiempo lo más breve posible.

La presente invención tiene por objeto proporcionar: partículas portadoras insolubles utilizables para inmunoensayos rápidos de gran sensibilidad, que permitan la observación visual y la medición con aparatos de elevada sensibilidad; un método para prepararlas; un método de inmunoensayo mediante el uso de las mismas; y un kit de inmunoensayo que las incluya.

Solución al problema

El problema anterior se puede resolver uniendo una sustancia fluorescente a un grupo funcional carboxilo sobre una partícula portadora insoluble visible, que es una partícula de látex de poliestireno coloreada que puede ser confirmada visualmente cuando hay un ligando unido a ella. Una combinación de partículas portadoras insolubles y una sustancia emisora de fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario de otro color, cuya longitud de onda sea equivalente a la longitud de onda de absorción de las partículas portadoras insolubles, permite una detección eficiente sin que se produzca la absorción de fluorescencia por las partículas portadoras insolubles. En concreto, para partículas portadoras insolubles de color rojo se usa una sustancia fluorescente que emite fluorescencia roja. El empleo de este tipo de combinación para los inmunoensayos permite una detección rápida basada en la observación visual cuando la cantidad de una sustancia diana es grande y también permite una detección de gran sensibilidad mediante el uso de un aparato adecuado cuando la cantidad de una sustancia diana es pequeña.

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier contenido que caiga fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Además la presente revelación abarca concretamente lo siguiente.

[1] Partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente, que se usan para inmunoensayos, donde la absorción de fluorescencia por las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, es baja dentro de un intervalo de longitud de onda de fluorescencia emitida por el colorante fluorescente.

[2] Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente según [1], en las cuales el colorante fluorescente usado para la marcación es una sustancia fluorescente que emite fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario de otro color cuya longitud de onda equivale a una longitud de onda de absorción de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas.

[3] Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente de acuerdo con [1] o [2], de forma que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color azul y la longitud de onda de fluorescencia emitida por el colorante fluorescente es de 450 nm - 570 nm.

[4] Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente según [3], de forma que las partículas transportadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color azul y el colorante fluorescente es fluoresceína o isotiocianato de fluoresceína.

[5] Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente de acuerdo con [1] o [2], de forma que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color rojo y la longitud de onda de fluorescencia emitida por el colorante fluorescente es de 590 nm - 750 nm.

[6] Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente según [5], de forma que las partículas transportadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color rojo y el colorante fluorescente es ATBTA-EU3+.

[7] Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1]-[6], de forma que las partículas portadoras insolubles son partículas de látex de poliestireno.

[8] Un método de inmunoensayo que incluye el uso de partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1]-[7].

[9] El método de inmunoensayo de acuerdo con [8], que además consiste en determinar la presencia o ausencia de un complejo antígeno-anticuerpo al permitir que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1]-[7] se unan a un complejo antígeno-anticuerpo que comprende un antígeno o anticuerpo diana; y observar visualmente la coloración de las partículas portadoras insolubles y/o medir la fluorescencia emitida por las partículas portadoras insolubles.

[10] El método de inmunoensayo según [8] o [9], que es un método inmunocromatográfico.

[11] Un kit de inmunoensayo que incluye las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1]-[7].

[12] Un método para preparar las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1]-[7], que consta de:

(i) una etapa de medición de los espectros de absorbancia de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas; (ii) una etapa de determinación de un intervalo de longitud de onda en el cual la absorción por las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, sea baja;

(iii) una etapa de selección de un colorante fluorescente que emita fluorescencia en el intervalo de longitud de onda determinado; y

(iv) una etapa de marcación de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, utilizando el colorante fluorescente seleccionado.

Efectos ventajosos de la presente invención

La presencia de partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente según la presente invención puede detectarse por observación visual o empleando un detector de fluorescencia. Por lo tanto, cuando las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente de la presente invención, se utilizan en los inmunoensayos para medir una sustancia diana, basándose en la presencia de partículas portadoras, la presencia o ausencia de la sustancia diana se puede determinar por observación visual o empleando un detector de fluorescencia. El uso de partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas con un colorante marcador fluorescente de la presente invención, permite implementar las POCT de manera sencilla, incluso en una instalación o ubicación que no disponga de un equipo tal como un detector de fluorescencia. Por otra parte, el uso de un detector de fluorescencia también permite medir la fluorescencia con una mejor precisión.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra los espectros de absorbancia de partículas de poliestireno blancas y rojas.

La figura 2 muestra los espectros de absorbancia de partículas de poliestireno blancas y azules.

La figura 3 muestra los espectros de absorbancia de partículas de poliestireno blancas, verdes y amarillas.

Descripción de formas de ejecución

La presente invención se describe detalladamente a continuación.

Conforme a la presente invención se preparan partículas portadoras insolubles visibles, que son partículas de látex de poliestireno coloreadas en las que se han introducido grupos funcionales carboxilo y están marcadas con un colorante fluorescente mediante dichos grupos carboxilo, las cuales se utilizan para inmunoensayos de manera que el colorante usado para la marcación es una sustancia que emite fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario de otro color cuya longitud de onda es equivalente a una longitud de onda de absorción de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas. Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, según la presente invención son partículas de color azul y la longitud de onda de fluorescencia emitida por el colorante fluorescente es de 450 nm - 570 nm, o bien, las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, según la presente invención son partículas de color rojo y la longitud de onda de fluorescencia emitida por el colorante fluorescente es de 590 nm - 750 nm.

El término “partículas portadoras insolubles” se refiere a partículas que son insolubles en medio líquido y sirven como soportes capaces de unirse a un antígeno o anticuerpo y retenerlo. En la presente invención se emplean partículas de látex de poliestireno coloreadas, que son usuales en el ámbito técnico de los agentes de ensayo o similares. El término “partículas de látex” se refiere a partículas dispersadas coloidalmente en agua para formar una emulsión. Conforme a la presente invención, el material de las partículas es poliestireno. No obstante, también se revelan materiales usuales de los vehículos de fase sólida en el ámbito técnico de los agentes de ensayo o similares para la fijación de proteínas tales como anticuerpos, antígenos, ligandos o receptores. Como ejemplos de dichos materiales cabe citar: resinas tales como poliestireno, copolímeros de estireno (p.ej. copolímero de estireno-ácido acrílico), policarbonato, polimetilen metacrilato (PMMA) y poliviniltolueno; sílice; y celulosa. Alternativamente, según la presente revelación, las partículas pueden ser igualmente de tipo magnético, cuyo interior o superficie esté formado por un material magnético tal como hierro, níquel o cobalto.

Los tamaños de las partículas utilizadas aquí son de 10 nm hasta varios cientos de nanómetros y preferiblemente de 30 nm - 500 nm.

El término “partículas visibles coloreadas” se refiere a partículas de un color visiblemente reconocible por las personas. Cuando las partículas visibles coloreadas reflejan luz visible de una longitud de onda concreta, las personas pueden reconocer su color al percibir la luz visible reflejada. La luz visible tiene una longitud de onda entre 380 nm - 750 nm, aproximadamente. El color de las partículas coloreadas es una tonalidad expresada como un color cromático que es, por ejemplo, rojo, naranja, amarillo, verde, azul o violeta. Las personas reconocen la coloración de cada uno de estos colores al percibir la luz visible reflejada, que tiene respectivamente las siguientes longitudes de onda concretas. Rojo: 620-750 nm

Naranja: 590-620 nm

Amarillo: 570-590 nm

Verde: 495-570 nm

Azul: 450-495 nm

Violeta: 380-450 nm

Se pueden producir partículas visibles coloreadas tiñendo las mencionadas partículas con colorantes adecuados. Al teñirlas con un colorante se pueden colorear las superficies de las partículas. No obstante, para evitar la desorción de un colorante es preferible teñir el interior de cada partícula, impregnándolas con el colorante. Aunque es posible teñir con un solo colorante, se pueden utilizar diferentes colorantes para obtener partículas visibles coloreadas con colores arbitrarios. Así, por ejemplo, se pueden preparar partículas de diversos colores, tales como partículas rojas, partículas azules, partículas verdes, partículas amarillas y partículas rosadas. En la tinción se pueden usar colorantes conocidos como los empleados para teñir resinas, etc. La coloración se puede realizar con colorantes o pigmentos tales como el azul Sudán, el rojo Sudán III, el rojo Sudán IV, el verde de quinizarina y el aceite de naranja. También se dispone en el comercio de partículas de diferentes colores hechas de distintos materiales. Estas partículas coloreadas disponibles comercialmente también son utilizables.

Conforme a la presente invención, las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de látex de poliestireno teñidas en las que se introducen grupos funcionales carboxilo y se marcan con un colorante fluorescente mediante el grupo carboxilo. Por ejemplo, se deja que un colorante fluorescente, como agente de marcación, se una a las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas. Dicho colorante es una sustancia que emite fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario de otro color cuya longitud de onda es equivalente a una longitud de onda de absorción de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, de tal manera que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color azul y la longitud de onda de fluorescencia emitida por el colorante fluorescente es de 450 nm - 570 nm, o bien, las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color rojo y la longitud de onda de fluorescencia emitida por el colorante fluorescente es de 590 nm - 750 nm. Debe tenerse en cuenta que se selecciona un colorante fluorescente basándose en que la absorción de la fluorescencia emitida por un colorante fluorescente es baja cuando la fluorescencia es absorbida por las partículas de colores visibles. Esto se debe a que, si las partículas absorben la fluorescencia emitida por un colorante fluorescente unido a las partículas visibles coloreadas, la fluorescencia no se puede medir con suficiente intensidad en forma de señales procedentes de las partículas. Un estado en el que la fluorescencia emitida por un colorante fluorescente no es absorbida por las partículas visibles coloreadas es un estado en el cual el intervalo de longitud de onda de la luz absorbida por dichas partículas no se solapa con el intervalo de longitud de onda de la fluorescencia emitida por un colorante fluorescente. Por ejemplo, los espectros de absorbancia de las partículas visibles coloreadas que haya que usar se miden con un absorciómetro, empleando un colorante fluorescente que emita fluorescencia a un intervalo de longitud de onda en el cual la absorción de la fluorescencia por las partículas visibles coloreadas sea baja. El intervalo de longitud de onda en que la absorción de fluorescencia por las partículas visibles coloreadas es baja es un intervalo de longitud de onda de otro color complementario de un color cuyo intervalo de longitud de onda en el cual la absorción de fluorescencia por las partículas visibles coloreadas es alta. Por lo tanto se puede utilizar una sustancia fluorescente que emita fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario de otro color con una longitud de onda equivalente a la longitud de onda de absorción de las partículas portadoras insolubles. Por ejemplo, las partículas rojas reflejan la luz roja, lo que permite a las personas reconocer visualmente la coloración roja. Por otra parte, las partículas de color rojo absorben la luz de un color complementario al rojo. La longitud de onda de la luz roja es aproximadamente de 620-750 nm. Los colores complementarios del rojo van del azul al verde. La longitud de onda de la luz azul es de aproximadamente 450-495 nm y la longitud de onda de la luz verde es de aproximadamente 495-570 nm. Por tanto, cuando se utilizan partículas visibles de color rojo, puede emplearse un colorante fluorescente que emita fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario del color que va del azul al verde. Un color complementario del color que va del azul al verde es un color que va del naranja al rojo, con una longitud de onda de aproximadamente 590-750 nm. Por consiguiente, cuando se utilizan partículas portadoras insolubles de color rojo visible, se emplea un colorante fluorescente que emite fluorescencia a un intervalo de longitud de onda de 590-750 nm y preferiblemente de 590-650 nm.

Asimismo, las partículas azules reflejan la luz azul y, por tanto, las personas reconocen visualmente la coloración azul. Por otra parte, las partículas de color azul absorben la luz de un color complementario al azul. La longitud de onda de la luz azul es de aproximadamente 450-495 nm. Los colores complementarios del azul van del naranja al rojo. La longitud de onda de la luz naranja es de aproximadamente 590-620 nm y la longitud de onda de la luz roja es de aproximadamente 620-750 nm. Por consiguiente, cuando se utilizan partículas visibles de color azul, puede emplearse un colorante fluorescente que emita fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario de otro color que va del naranja al rojo. Un color complementario de un color que va del naranja al rojo es un color que va del azul al verde, con una longitud de onda de aproximadamente 450-570 nm. Por consiguiente, cuando se emplean partículas portadoras insolubles visibles de color azul, se utiliza un colorante fluorescente que emite fluorescencia a un intervalo de longitud de onda de 450-570 nm y preferiblemente de 500-550 nm. Además, la absorción a 600-700 nm tiende a aumentar en el caso de partículas azules. Para evitar esta longitud de onda se emplea un colorante fluorescente que emite fluorescencia a un intervalo de longitud de onda inferior a 600-700 nm.

De acuerdo con la presente invención, se miden con un absorciómetro los espectros de absorbancia de las partículas visibles coloreadas que vayan a utilizarse, para determinar el intervalo de longitud de onda de la luz de baja absorción, se elige un colorante fluorescente que emita fluorescencia en el intervalo de longitud de onda relevante, y se deja que el colorante fluorescente se una a las partículas visibles coloreadas, usando el método descrito a continuación. El uso de dicho colorante fluorescente permite reducir la absorción de la fluorescencia emitida por el colorante fluorescente cuando la fluorescencia es absorbida por partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, logrando así suficiente intensidad de fluorescencia.

Como ejemplos de colorante fluorescente utilizado generalmente para la marcación fluorescente de partículas visibles coloreadas cabe mencionar los colorantes fluorescentes orgánicos y los derivados de dichos colorantes fluorescentes que tienen una estructura básica, como la fluoresceína, la rodamina, la cumarina, el colorante Cy, los colorantes Alexa Fluor (marca registrada), EvoBlue, la oxazina, la carbopirironina, el naftaleno, el bifenilo, el antraceno, el fenantreno, el pireno, el carbazol o similares. También se puede emplear un complejo de tierras raras como el quelato de europio (EU3+) o el quelato de terbio (Tb3+). Como ejemplo de quelato de europio (EU3+) se puede usar ATBTA ([4'-(4'-amino-4-bifenilil)-2,2':6',2”-terpiridina-6,6”-diilbis(metiliminodiacetato)]europato(MI))-EU3+, que tiene un grupo amino. Además se puede usar una proteína de fluorescencia, como por ejemplo una proteína verde fluorescente (GFP).

Según la presente invención, las partículas visibles coloreadas se marcan con un colorante fluorescente, introduciendo grupos funcionales carboxilo en las partículas visibles coloreadas, introduciendo igualmente un grupo funcional en el colorante fluorescente y permitiendo que el colorante fluorescente se una a las partículas visibles coloreadas a través de los grupos carboxilo. Por ejemplo, se puede unir un grupo amino con un grupo carboxilo mediante un enlace amido. Según la presente revelación, los grupos funcionales pueden unirse entre sí utilizando un reactivo reticulante. Ejemplos de reactivos reticulantes son los ésteres de N-hidroxisuccinimida, la maleimida, el EDAC (cloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida) y el glutaraldehído. Además, en caso de usar un complejo de tierras raras como colorante fluorescente, se puede emplear ATBTA-EU3+ o similar en el que se ha introducido un grupo amino. Asimismo, en caso de usar una proteína de fluorescencia, se puede utilizar la unión entre grupos funcionales. Además, de acuerdo con la presente revelación, una proteína de fluorescencia se puede unir a las partículas visibles coloreadas por adsorción física. Se puede emplear un colorante fluorescente disponible comercialmente en el que se haya introducido un grupo amino o un grupo carboxilo.

Según otra forma de ejecución de la presente revelación se puede premezclar un colorante fluorescente con el material principal constituido por las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas. Así, por ejemplo, se pueden preparar partículas portadoras insolubles amasando un colorante fluorescente y un colorante visible con un material como la resina empleada para las partículas portadoras insolubles de látex. Las partículas portadoras insolubles fluorescentes también se pueden marcar con un colorante visible. Las partículas portadoras insolubles fluorescentes utilizadas aquí incluyen las partículas portadoras insolubles preparadas con una sustancia capaz de emitir fluorescencia, así como las partículas portadoras insolubles a las que se ha unido un colorante fluorescente. Como ejemplos de tales partículas cabe citar las que llevan MIMIIO4 o M'AbO-^ (donde MI indica itrio (Y), lantano (La) o gadolinio (Gd) y M" indica niobio (Nb), fósforo (P) o vanadio (V)) activado con un elemento de tierras raras como europio (Eu) o terbio (Tb). Se pueden utilizar las reveladas en la publicación de patente JP (Kokai) n° 2012-32263 A. Además, el término “colorante visible” se refiere a un colorante para dar un color que las personas puedan reconocer visualmente. Se pueden usar colorantes conocidos empleados para teñir resinas y similares. Como ejemplos de ellos cabe citar colorantes y pigmentos tales como azul Sudán, rojo Sudán III, rojo Sudán IV, verde de quinizarina y aceite de naranja. Así, por ejemplo, se pueden preparar partículas portadoras insolubles amasando un colorante fluorescente en una resina utilizable como material de las partículas portadoras insolubles de látex y luego teñir las partículas con un colorante visible. De acuerdo con la presente invención, las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, preparadas con el material principal mezclado con dichos colorantes fluorescentes y con partículas portadoras insolubles fluorescentes marcadas con un colorante visible, se pueden emplear igualmente como partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente. Es decir, las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente, incluyen cualquier partícula portadora insoluble que sea de color visible y emita fluorescencia.

A continuación se describen varios colorantes fluorescentes utilizables en la presente invención, con unas cifras entre paréntesis que corresponden a sus longitudes de onda de fluorescencia (nm). Los colorantes fluorescentes marcados con * no son conformes a la presente invención. Las longitudes de onda de fluorescencia pueden variar según las condiciones de medición. La medición se puede llevar a cabo dentro del intervalo de cada longitud de onda indicada a continuación ± varias decenas de nanómetros (p.ej. ± 25 nm). La presente invención no se limita a los siguientes colorantes fluorescentes. Se pueden utilizar diversos colorantes fluorescentes de acuerdo con sus longitudes de onda de fluorescencia.

Colorantes fluorescentes orgánicos

Dylight 405 (420)*, DY-405 (420)*, Azul cascada (420)*, Alexa Fluor 405 (421)*, AMCA (440)*, Alexa-350 (442)*, AMCA-X (447)*, Azul pacifico (455), Azul marino (460), DY-415 (467), Azul real (480), ATTO 425 (484), Cy2 (505), ATTO 465 (508), DY-475XL (509), Aurora boreal 493 (514), BODIPY 505/515 (515), DY-490 (516), Dylight 488 (518), Alexa-488 (519), 5-FITC (519), FAM (520), DY-495-X5 (520), DY-495 (521), fluoresceína (521), isotiocianato de fluoresceína (FITC) (522), ATTO 488 (523), HiLyte Fluor 488 (523), MFP 488 (523), ATTO 495 (527), OG-488 (524), rodamina 110 (525), OG-514 (530), Oyster500 (530), Verde espectral (538), Alexa-430 (541), ATTO 520 (545), ATTO 532 (553), Cas Y (554), Alexa-532 (554), DY-500XL (555), DY-485XL (560), Alexa-555 (565), HiLyte Plus 555 (552/567), DyLight 549 (568), HiLyte Fluor 555 (568), Cy3 (565), Dylight 547 (570), rodamina (570), TRITC (570), DY-548 (572)*, DY-554 (572)*, DY-555 (572)*, Alexa Fluor 546 (573)*, DY-556 (573)*, Aurora boreal 557 (574)*, Oyster 550 (574)*, 5-TAMRA (574)*, DY-505-X5 (574)*, DY-547 (574)*, Oyster 556 (575)*, DY-549 (575)*, Alexa-546 (575)*, ATTO 550 (576)*, PE (578)*, B-PE (578)*, R-PE (578)*, DY-560 (578)*, TAMRA (580)*, tetrametil-rodamina (578)*, RITC/TMR (580)*, MFP 555 (585)*, Naranja espectral (588)*, DY-510XL (590), rodamina B (590), ATTO 565 (592), Cy3.5 (596), Rojo rodamina X (ROX) (599), DY-590 (599), 5-ROX (602), Alexa-568 (603), BODIPY 580/605 (605), Rojo espectral (612), ECD (613), Rojo Texas (615), DyLight 594 (618), Alexa Fluor 594 (619), HiLyte Fluor TR (622), ATTO 590 (624), MFP 590 (624), DY-610 (630), DY-480XL (630), ATTO 610 (634), DY-615 (641), ficocianina C (647), ATTO 620 (643), Alexa-633 (647), ficocianina (650), DY-481XL (650), ATTO 633 (657), DY-630 (657), DY-632 (657), DY-633 (657), MFP 631 (658), DyLight 633 (658), Aurora boreal 637 (658), DY-631 (658), DY-634 (658), Aloficocianina (APC) (660), APC-XL (660), DY-520XL (664), Alexa-647 (668), Cy5 (667), DY-521XL (668), Oyster 645 (669), Rojo Quantum (670), DY-635 (671), DY-636 (671), DY-647 (673), DyLight 647 (673), HiLyte Fluor (647), DyLight 649 (674), HiLyte Plus 647 (674), Oyster650 (674), DY-648 (674), DY-650 (674), PerCP (675), DY-652 (675), DY-649 (676), DY-651 (678), Oyster 656 (679), ATTO 655 (684), Alexa-660 (690), Cy5.5 (694), DY-677 (694), DY-678 (698), HiLyte Fluor 680 (699), DY-675 (699), DY-676 (699), IRDye700DX (700), Alexa-680 (702), DY-681 (708), DY-680 (709), DY-682 (709), DyLight 680 (715), Alexa Fluor700 (723), DY-700 (730), DY-701 (731), DY-730 (758)*, DY-732 (759)*, DY-734 (759)*, DY-731 (760)*, DY-752 (772)*, DY-750 (776)*, DyLight 750 (778)*, HiLyte Fluor 750 (778)*, DY-749 (778)*, HiLyte Plus 750 (779)*, APC7 (779)*, DY-751 (779)*, DyLight 800 (794)*, IRDye800CW (800)*, DY-780 (800)*, DY-781 (800)*, DY-782 (800)*, DY-776 (801)*, DY-777 (801)*, IRDye800 (806)*, etc.

Complejo de tierras raras

ATBTA-EU3* (616), etc.

Proteínas fluorescentes

Sirius (424)*, CFP (505), AcGFP (505), EGFP (509), EYFP (527), YFP (527), Amarillo Zs (539), Naranja m (562), Rojo Ds 2 (582)*, Rojo As 2 (592), mRFP1 (607), Cereza m (610), Rojo Hc (618), Frambuesa m (625), Ciruela m (649), etc.

Por ejemplo, cuando se utilizan partículas de látex de poliestireno azul como partículas visibles coloreadas, teniendo en cuenta que las partículas de látex de poliestireno azul tienen un pico de absorción alrededor de 600-700 nm, se puede emplear un colorante fluorescente que tenga una longitud de onda de fluorescencia dentro de un intervalo de longitud de onda de, por ejemplo, menos de 600-700 nm, por ejemplo de 450-570 nm, según la presente invención, en concreto de 450-550 nm aproximadamente y sobre todo de 500 nm aproximadamente. Un ejemplo de un colorante fluorescente de este tipo es la fluoresceína, cuya longitud de onda es de 521 nm. Asimismo, cuando se usan partículas de látex de poliestireno rojo como partículas visibles coloreadas, teniendo en cuenta que las partículas de látex de poliestireno rojo tienen un pico de absorción alrededor de 500-550 nm, se puede utilizar un colorante fluorescente que tenga una longitud de onda de fluorescencia que sea, por ejemplo, superior a 500-550 nm, por ejemplo 590-750 nm, según la presente invención, en concreto se pueden usar uno de aproximadamente 600-700 nm. Un ejemplo de dicho colorante fluorescente es el ATBTA-EU3* cuya longitud de onda de fluorescencia es de 616 nm.

Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según la presente invención, pueden ser reconocidas visualmente por las personas, y el colorante emite fluorescencia. Cuando se utilizan partículas portadoras insolubles para el inmunoensayo, se deja que un antígeno o un anticuerpo se una a las partículas portadoras insolubles, y que un anticuerpo o un antígeno contenido en la muestra de un sujeto de ensayo se una a las mismas; luego se recogen o se acumulan las partículas portadoras insolubles que llevan un complejo del antígeno y el anticuerpo. La presencia del anticuerpo o antígeno en la muestra del sujeto de ensayo se detecta en función de la presencia o ausencia de dichas partículas portadoras insolubles. Cuando las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según la presente invención, se usan para el inmunoensayo, la presencia del anticuerpo o del antígeno se puede detectar por observación visual del color. Asimismo, la presencia del anticuerpo o del antígeno puede detectarse midiendo la fluorescencia emitida por los soportes insolubles mediante un detector de fluorescencia.

Para permitir que un antígeno o anticuerpo se una a las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente, se puede provocar la unión entre un grupo funcional de una partícula portadora insoluble y un grupo funcional de un antígeno o anticuerpo, de forma similar al método para dejar que un colorante fluorescente se una a partículas portadoras insolubles. También se puede permitir que un antígeno o un anticuerpo se unan a las partículas portadoras insolubles por adsorción física.

La presente invención comprende además un método para preparar dichas partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente, que consta de: (i) una etapa de medición de los espectros de absorbancia de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas; (ii) una etapa de determinación de un intervalo de longitud de onda en el cual la absorción por las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, sea baja; (iii) una etapa de selección de un colorante que emita fluorescencia en el intervalo de longitud de onda determinado; y (iv) una etapa de marcación de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, con el colorante fluorescente seleccionado.

El tipo de inmunoensayo mediante el empleo de partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según la presente invención, no está limitado. Puede ser un método inmunocromatográfico, un método de aglutinación o similar, pero preferiblemente es un método inmunocromatográfico. Puede llevarse a cabo un método inmunocromatográfico usando un dispositivo inmunocromatográfico conocido según un método conocido. Asimismo, la presente invención incluye un método de inmunoensayo con el uso de partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente. El método consiste en además determinar la presencia o la ausencia de un complejo de antígeno-anticuerpo: permitiendo que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente, se unan a un complejo antígeno-anticuerpo que contiene un antígeno o un anticuerpo diana; y observar visualmente la coloración de las partículas portadoras insolubles y/o medir la fluorescencia emitida por las partículas portadoras insolubles. Es decir, un antígeno o un anticuerpo son sometidos a la medición, basándose en el color o en la fluorescencia de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente. La medición es tanto cualitativa como cuantitativa.

Por ejemplo, en un método inmunocromatográfico para detectar un antígeno en la muestra de un sujeto de ensayo, un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una sustancia diana, por ejemplo un antígeno, se inmoviliza en un sitio predeterminado (sitio de detección) sobre un substrato apropiado de fase sólida, tal como una membrana de nitrocelulosa. Se deja que un complejo de la sustancia diana con partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con el colorante fluorescente de la presente invención, las cuales se han unido a un antígeno al que se fija específicamente un anticuerpo que debe detectarse, migre y se desarrolle en el substrato de fase sólida por medio de un fenómeno capilar. En este caso, después de combinar las partículas portadoras insolubles y la sustancia diana, la mezcla se puede agregar a un sitio predeterminado sobre el substrato de fase sólida (un sitio de adición de muestra). Alternativamente, las partículas portadoras insolubles se pueden inmovilizar de antemano sobre el substrato de fase sólida (en un sitio de marcación), permitiendo así la disolución de las partículas portadoras insolubles con la adición de una muestra líquida, a fin de permitir que las partículas portadoras insolubles formen un complejo con la sustancia diana. Como resultado, en el sitio de detección del substrato de fase sólida se forma un complejo del antígeno en fase sólida - el anticuerpo como sustancia diana - con las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente. La sustancia diana puede detectarse confirmando la presencia de partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente, en el sitio de detección por observación visual 0 medición con un detector de fluorescencia. Para medir un anticuerpo contenido en la muestra del sujeto de ensayo se inmoviliza en un substrato de fase sólida un antígeno al que se une específicamente el anticuerpo como sustancia diana, y después se deja que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente, se unan al antígeno.

El tipo de sustancia diana para el método de la presente invención no está limitado. Como ejemplos cabe citar: virus como el VIH, el virus de la hepatitis y el virus de la gripe; y bacterias como Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumonía y Escherichia coli enterohemorrágica. Tampoco hay limitación de muestras. Como ejemplos de muestras utilizables cabe mencionar las obtenidas por torunda faríngea o nasal, fluidos de lavado faríngeo o nasal, aspirado nasal, saliva, suero, plasma, heces, suspensión fecal y orina recolectada de un sujeto de ensayo, así como soluciones de sus cultivos.

Además, la presente invención comprende un kit de inmunoensayo para la detección, que incluye partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según la presente invención, a las que se ha unido un antígeno o anticuerpo como sustancia diana. El kit incluye además un dispositivo inmunocromatográfico y un folleto del mismo.

Ejemplos

La presente invención se describirá más concretamente mediante los siguientes ejemplos; sin embargo, la presente invención no está limitada a estos ejemplos. En ellos, el símbolo “%” se refiere al “% en peso”.

Ejemplo 1: Preparación de partículas visibles coloreadas marcadas con un colorante fluorescente, usando partículas de poliestireno coloreadas que tienen un grupo funcional carboxilo.

1. Unión de un agente de marcación fluorescente de quelato de europio

Se diluyeron con una solución tampón de HEPES 10 mM (pH 7,0) diferentes tipos de partículas visibles coloreadas de poliestireno que llevan un grupo carboxilo como grupo funcional (véase la tabla 1 y las figuras 1-3) hasta llegar a una concentración del 0,1%. Se añadió ATBTA-Eu3+ (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) como agente de marcación fluorescente de quelato de europio hasta una concentración de 0,1 mg/ml, seguido de agitación. Después se agregó carbodiimida hasta una concentración del 1%, seguido de agitación. La mezcla resultante se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de centrifugación a 7000 g durante 30 minutos. Posteriormente se eliminó el sobrenadante y el resto se resuspendió en una solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y ABS al 3%.

2. Unión de un agente de marcación fluorescente de aminofluoresceína

Se diluyeron con una solución tampón de HEPES 10 mM (pH 7,0) diferentes tipos de partículas visibles coloreadas de poliestireno que llevan un grupo carboxilo como grupo funcional (véase la tabla 1 y las figuras 1-3) hasta llegar a una concentración del 0,1%. Se añadió 6-aminofluoresceína (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) hasta una concentración de 0,1 mg/ml, seguido de agitación. Después se agregó carbodiimida hasta una concentración del 1%, seguido de agitación. La mezcla resultante se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de centrifugación a 7000 g durante 30 minutos. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y el resto se resuspendió en una solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y ABS al 3%.

En la tabla 1 figuran las partículas de látex de poliestireno visibles, coloreadas, utilizadas aquí. Las figs. 1-3 muestran los espectros de absorbancia de las respectivas partículas.

[Tabla 1] Diferentes tipos de color de partículas de poliestireno visibles coloreadas. Las partículas de poliestireno visibles coloreadas marcadas con * no son conformes a la presente invención.

3. Medición de la intensidad de fluorescencia de partículas de poliestireno unidas al agente de marcación fluorescente de quelato de europio

Las partículas de poliestireno preparadas en el anterior apartado 1, a las que se había unido el agente de marcación fluorescente de quelato de europio, se diluyeron con una solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y ABS al 3% para llegar a una concentración del 0,01%. La solución resultante se introdujo en los pocillos de una placa FluoroNunc de 96 pocillos (de 100 pl cada uno). La intensidad de la fluorescencia se midió con un lector de placas de fluorescencia (m Tp-650FA; COr OnA ELECTRIC Co., Ltd.) a 340 nm de excitación / 615 nm de emisión. Como controles se midió una solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y ABS al 3% y partículas de poliestireno visibles, coloreadas, a las que no se había unido el agente de marcación fluorescente de quelato de europio.

Como resultado, las partículas de poliestireno visibles, coloreadas, a las que no se había unido el agente de marcación fluorescente de quelato de europio mostraron una intensidad prácticamente comparable o notablemente más baja que la intensidad exhibida por la solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y ABS al 3%. En el caso de las partículas de poliestireno visibles, coloreadas, a las que se había unido el agente de marcación fluorescente de quelato de europio, la intensidad de fluorescencia fue de 300 o más, tanto para las partículas de poliestireno rojo como para las partículas de poliestireno amarillo, que tuvieron una baja absorción, alrededor de 615 nm, en el espectro de absorbancia. La intensidad de la fluorescencia fue aproximadamente de 160 para las partículas de poliestireno verde, y para dos tipos de partículas de poliestireno azul, con una fuerte absorción alrededor de 615 nm, la intensidad de la fluorescencia dio un valor tan bajo como 100 o menos. En la tabla 2 figuran los resultados.

[Tabla 2] Medición de la intensidad de fluorescencia del quelato de europio con un lector de placas de fluorescencia

4. Medición de la intensidad de fluorescencia de las partículas de poliestireno unidas al agente marcador fluorescente de fluoresceína

Las partículas de poliestireno preparadas en el anterior apartado 2, a las cuales se había unido el agente de marcación fluorescente de fluoresceína, se diluyeron con una solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y ABS al 3% hasta una concentración del 0,05%. La solución resultante se introdujo en los pocillos de una placa FluoroNunc de 96 pocillos (de 100 pl cada uno). La intensidad de la fluorescencia se midió con un lector de placas de fluorescencia (MTP-650FA; CORONA ELECTRIC Co., Ltd.) a 490 nm de excitación / 530 nm de emisión. Como controles se midió una solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y ABS al 3% y partículas de poliestireno visibles, coloreadas, solo mezcladas, a las cuales no se había unido el agente marcador fluorescente de fluoresceína.

Como resultado, las partículas de poliestireno visibles, coloreadas, a las cuales no se había unido el agente marcador fluorescente de fluoresceína mostraron una intensidad prácticamente comparable o notablemente más baja que la intensidad exhibida por la solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y ABS al 3%. En el caso de las partículas de poliestireno visibles, coloreadas, a las cuales se había unido el agente de marcación fluorescente de fluoresceína, la intensidad de la fluorescencia fue de 500 o más para las partículas de poliestireno amarillo, que en el espectro de absorbancia tuvieron una baja absorción, de 530 nm aproximadamente; la intensidad de fluorescencia fue de 170 aproximadamente para las partículas verdes de poliestireno, que tuvieron una baja absorción (mayor que la de las partículas amarillas de poliestireno); la intensidad de fluorescencia fue de 70 o más para dos tipos de partículas de poliestireno azul, que tuvieron baja absorción (mayor que la de las partículas de poliestireno verde); y la intensidad de fluorescencia fue baja para las partículas de poliestireno rojas, que dieron una fuerte absorción, alrededor de 530 nm. En la tabla 3 figuran los resultados.

[Tabla 3] Medición de la intensidad de fluorescencia de la fluoresceína con un lector de placas de fluorescencia

Los resultados anteriores de los espectros de absorbancia y de las intensidades de fluorescencia de las partículas de poliestireno coloreadas a las que se había unido el agente marcador fluorescente de quelato de europio y el agente marcador fluorescente de aminofluoresceína revelaron lo siguiente: la fluorescencia se puede detectar de manera eficiente si se permite la unión de un agente marcador fluorescente a partículas de vehículo insolubles que tengan una baja absorción a la longitud de onda de fluorescencia de la sustancia fluorescente; pero en cambio la fluorescencia no se puede medir con una eficiencia elevada cuando se emplean partículas portadoras insolubles que tienen una fuerte absorción de la misma.

Ejemplo 2: Unión de un anticuerpo NP-antivirus de la gripe A y de un agente marcador fluorescente a partículas de poliestireno visibles que llevan un grupo funcional carboxilo y detección de un antígeno NP del virus de la gripe A por inmunocromatografía basada en dicha unión.

En el ejemplo 2 se compararon partículas de poliestireno visibles, coloreadas. La verificación se llevó a cabo utilizando, como materiales partículas de poliestireno rojas y partículas de poliestireno azules I, ambas de elevada visibilidad.

1. Preparación del anticuerpo monoclonal NP antivirus de la gripe A

Se inmunizó un ratón BALB/c con un antígeno del virus de la gripe A y se crió durante un tiempo predeterminado. Se extrajo el bazo del ratón y se fusionaron células del mismo con células de mieloma de ratón (P3 x 63) según el método de Kohler (Kohler y otros, Nature, vol. 256, p 495-497 (1975)). Las células de hibridoma resultantes se mantuvieron en una incubadora a 37°C. La actividad del anticuerpo del sobrenadante se comprobó por ELISA usando una placa en la que se inmovilizó un antígeno NP del virus de la gripe A y se purificaron las células (monoclonadas). Se obtuvieron dos cepas de células y se administraron separadamente por vía intraperitoneal a ratones BALB/c tratados con pristano. Aproximadamente dos semanas después se recogieron los fluidos ascíticos que contenían el anticuerpo.

Se purificó por cromatografía de afinidad la IgG de cada uno de los fluidos ascíticos recogidos, utilizando una columna de proteína A para obtener dos tipos de anticuerpos NP anti-virus de la gripe A purificados.

2. Inmovilización del anticuerpo NP-antivirus de la gripe A en una membrana de nitrocelulosa

El anticuerpo NP-antivirus de la gripe A purificado se diluyó con agua purificada hasta una concentración de 1,0 mg/ml. La solución diluida se aplicó linealmente a una posición previamente medida sobre una membrana de nitrocelulosa (Unisart CN 95; Sartorius Stedim Biotech) soportada con una película de PET. La membrana de nitrocelulosa se secó a 45°C durante 30 minutos para obtener una membrana inmovilizada con anticuerpo NP-antivirus de la gripe A (en lo sucesivo denominada membrana inmovilizada con anticuerpo).

3. Inmovilización del anticuerpo NP-antivirus de la gripe A y de una sustancia marcadora fluorescente a partículas de poliestireno visibles, coloreadas

Otro anticuerpo NP-antivirus de la A del virus, purificado, que no se inmovilizó en una membrana de nitrocelulosa, se diluyó con agua purificada hasta llegar a una concentración de 1,0 mg/ml. A esta dilución se le añadieron partículas de poliestireno rojo o partículas de poliestireno azul I hasta tener una concentración del 0,1%, seguido de agitación. A continuación se añadió ATBTA-Eu3+ (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), como agente marcador fluorescente de quelato de europio, a la mezcla líquida de las partículas de poliestireno rojo con el anticuerpo, hasta una concentración de 0,1 mg/ml. Por otra parte se añadió 6-aminofluoresceína (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) a la mezcla líquida de las partículas de poliestireno azul I con el anticuerpo hasta una concentración de 0,1 mg/ml, seguido de agitación. Se añadió carbodiimida a cada mezcla líquida hasta una concentración del 1%, seguido de agitación. Las mezclas se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de centrifugación a 7000 g durante 30 minutos. Después se eliminó el sobrenadante y el resto se resuspendió en una solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y ABS al 3% para obtener anticuerpo NP-antivirus de la gripe A partículas rojas de poliestireno unidas al quelato de europio y anticuerpo-antivirus de la gripe A partículas de poliestireno azul unidas a la fluoresceína.

4. Detección del antígeno NP del virus de la gripe A por inmunocromatografía

La membrana con el anticuerpo inmovilizado obtenida en 2 se unió a una lámina soporte, a una banda de absorción, a una almohadilla de conjugado y a una almohadilla de muestra para obtener una muestra de ensayo.

El anticuerpo NP-antivirus de la gripe A partículas de poliestireno rojo unidas al quelato de europio y el anticuerpoantivirus de la gripe A partículas de poliestireno azul unidas a la fluoresceína obtenidos en el anterior apartado 3 se diluyeron con una solución que contenía Tris 50 mM (pH 9,0) y 3% de ABS hasta una concentración del 0,1%. Así, se obtuvieron partículas rojas diluidas y partículas azules diluidas.

Se preparó una solución diluida de antígeno, diluyendo el antígeno NP del virus de la gripe A con una suspensión de muestra (Tris 10 mM (pH 7,0), BSA al 3%, TRITON® X-100 al 0,2%).

La solución diluida de antígeno (100 j l) se mezcló con partículas rojas diluidas (5 j l) o con partículas azules diluidas (5 jl). La cantidad total de cada mezcla se añadió gota a gota a una almohadilla de muestra de la probeta de ensayo. Cada almohadilla de muestra se dejó reposar 15 minutos. Después se determinó visualmente la presencia o ausencia de líneas de ensayo. Además se confirmó visualmente la fluorescencia con un transiluminador UV (transiluminador Benchtop 2UV; UVP). Se llevó a cabo la comparación e investigación del límite de detección entre las partículas rojas diluidas y las partículas de poliestireno rojas utilizadas como control, a las que solo se había unido el anticuerpo NP-antivirus de la gripe A.

Como resultado, por observación visual o detección de fluorescencia con el transiluminador UV no se confirmó ninguna línea de ensayo para la muestra probada con una suspensión que no contenía ningún antígeno. Por otra parte, para la muestra de ensayo probada con una suspensión que contenía el antígeno se confirmó visualmente una línea de ensayo de la coloración y una línea de ensayo de fluorescencia mediante el transiluminador UV. En la tabla 4 figuran los resultados.

[Tabla 4] Resultados de la detección del antígeno NP del virus de la gripe A

Además, como resultado de la comparación y la investigación del límite de detección entre las partículas de poliestireno rojas a las que se había unido el anticuerpo NP-antivirus de la gripe A solo y las partículas rojas diluidas, no se confirmó ningún cambio en el límite de detección por observación visual de la coloración. Se encontró que la sensibilidad era dos veces mayor que la del control al observar visualmente la fluorescencia. La tabla 5 muestra los resultados.

Los resultados anteriores revelaron que la confirmación visual de una línea de ensayo de coloración y la medición de una línea de ensayo de fluorescencia con el uso de un aparato puede realizarse aplicando a una inmunocromatografía partículas coloreadas unidas a sustancias fluorescentes preparadas por el método anterior. En los ejemplos anteriores, la fluorescencia se confirma visualmente. Además la fluorescencia se puede detectar con mayor sensibilidad mediante el uso del aparato.

Aplicabilidad industrial

Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según la presente invención se pueden usar para inmunoensayos tales como la inmunocromatografía.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, que son partículas de látex de poliestireno coloreadas en las que se han introducido grupos funcionales carboxilo y están marcadas con un colorante fluorescente mediante dichos grupos carboxilo, las cuales se utilizan para inmunoensayos de modo que el colorante usado para la marcación es una sustancia que emite fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario de un color cuya longitud de onda equivale a una longitud de onda de absorción de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, de forma que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color azul y la longitud de onda de la fluorescencia emitida por el colorante fluorescente es de 450 nm - 570 nm.

2. Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según la reivindicación 1, de forma que las partículas transportadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color azul y el colorante fluorescente es fluoresceína o isotiocianato de fluoresceína.

3. Partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, que son partículas de látex de poliestireno coloreadas en las que se han introducido grupos funcionales carboxilo y están marcadas con un colorante fluorescente mediante dichos grupos carboxilo, las cuales se utilizan para inmunoensayos de modo que el colorante usado para la marcación es una sustancia que emite fluorescencia a una longitud de onda de un color complementario de un color cuya longitud de onda equivale a una longitud de onda de absorción de las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, de forma que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color rojo y la longitud de onda de la fluorescencia emitida por el colorante fluorescente es de 590 nm - 750 nm.

4. Las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según la reivindicación 3, de forma que las partículas transportadoras insolubles visibles, coloreadas, son partículas de color rojo y el colorante fluorescente es ATBTA-EU3+.

5. Un método de inmunoensayo que consiste en emplear partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. El método de inmunoensayo según la reivindicación 5, que además consiste en determinar la presencia o la ausencia de un complejo antígeno-anticuerpo al permitir que las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 se unan a un complejo de antígeno-anticuerpo que lleva un antígeno o anticuerpo diana; y observar visualmente la coloración de las partículas portadoras insolubles y o medir la fluorescencia emitida por las partículas portadoras insolubles.

7. El método de inmunoensayo según la reivindicación 5 o 6, que es un método inmunocromatográfico.

8. Un kit de inmunoensayo que incluye las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

9. Un método para preparar las partículas portadoras insolubles visibles, coloreadas, marcadas con un colorante fluorescente según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que consta de: