JPH08283298A - 抗オンコプテリンモノクローナル抗体及びそれを用いた免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 試料の前処理が必要なく、検体当たりの測定
時間が短い、オンコプテリンの測定手段を提供するこ
と。 【構成】 オンコプテリンと反応し、ビオプテリン及び
１，３−ジアミノプロパンとは反応しないモノクローナ
ル抗体並びに該モノクローナル抗体検体中のオンコプテ
リンとの抗原抗体反応を利用して該検体中のオンコプテ
リンを測定する免疫測定方法を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗オンコプテリンモノ
クローナル抗体及びそれを用いた免疫測定方法に関す
る。本発明は、癌、特に肝臓癌、前立腺癌及び膀胱癌の
ような固形癌の診断に有用である。

【０００２】

【従来の技術】オンコプテリン（Ｎ² −（３−アミノプ
ロピル）ビオプテリン）は、健常人の尿中にはほとんど
検出されないが、癌、特に肝臓癌、前立腺癌及び膀胱癌
のような固形癌の患者の尿中には高濃度に検出されるの
で、癌（特に固形癌）のマーカーとして利用されてい
る。

【０００３】従来、オンコプテリンは高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）により測定されている（J. Bio
chem. 113, 1-3(1993)）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＨＰＬ
Ｃによる測定は、試料の前処理（酸加水分解）が必要で
あり、また、検体当たりの測定時間が長く、多数同時測
定ができないという問題点があった。

【０００５】従って、本発明の目的は、試料の前処理が
必要なく、検体当たりの測定時間が短い、オンコプテリ
ンの測定手段を提供することである。

【０００６】本願発明者は鋭意研究の結果、オンコプテ
リンに反応するが、生体中の他の類似化合物には反応し
ないモノクローナル抗体を得ることに成功し、本発明を
完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、オンコプテリンと反
応し、ビオプテリン及び１，３−ジアミノプロパンとは
反応しないモノクローナル抗体を提供する。また、本発
明は、上記本発明のモノクローナル抗体と検体中のオン
コプテリンとの抗原抗体反応を利用して該検体中のオン
コプテリンを測定する免疫測定方法を提供する。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００９】オンコプテリンは下記式［Ｉ］により表さ
れる化合物である。

【００１０】

【化１】

【００１１】式［Ｉ］から明らかなように、オンコプテ
リンはビオプテリンの２位のアミノ基にプロピルアミノ
基が置換したものである。本発明のモノクローナル抗体
は、上述のように、オンコプテリンとは反応するが、オ
ンコプテリンの構成部分であるビオプテリン及び１，３
−ジアミノプロパンとは反応しない。

【００１２】好ましい態様では、下記実施例で具体的に
得られたモノクローナル抗体＃１１９２のように、ネオ
プテリンとも反応しない。

【００１３】また、好ましい態様では、下記モノクロー
ナル抗体＃１１９２のようにオンコプテリンのプテリン
環の２位に結合した３−アミノプロピル基中のアミノ基
の水素原子が置換したオンコプテリン誘導体（以下、単
に「オンコプテリン誘導体」ということがある）と反応
する。このような誘導体の例としては、(1) ２級アミン
を形成して結合する試薬（例：グルタルアルデヒド（還
元処理あり））を介してオンコプテリンがウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）やキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）等のようなキャリアタンパク質に結合された
もの、(2) アミド結合を形成して結合する試薬（例：Ｎ
−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロ
ピオネート（ＳＰＤＰ））を介してオンコプテリンがＢ
ＳＡやＫＬＨ等のようなキャリアタンパク質に結合され
たもの及び(3) シッフ塩基を形成して結合する試薬
（例：グルタルアルデヒド（還元処理なし））を介して
オンコプテリンがＢＳＡやＫＬＨ等のようなキャリアタ
ンパク質に結合されたものが挙げられる。上記(1) 、
(2) 及び(3) の例として、オンコプテリンがグルタルア
ルデヒド（上記(1) 及び(3) ）又はＳＰＤＰ（上記(2)
）を介してＢＳＡに結合した誘導体の化学式を下記式
［II] 、［III]及び[IV]にそれぞれ示す。

【００１４】

【化２】

【００１５】

【化３】

【００１６】

【化４】

【００１７】下記実施例で得られたモノクローナル抗体
は、１，３−ジアミノプロパンに加え、他の直鎖状アル
キルアミン及びそのアセチル誘導体（例えば、テトラメ
チレンジアミン（プトレシン）、Ｎ−（３−アミノプロ
ピル）−１，４−ジアミノブタン（スペルミジン）及び
Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，４−ジア
ミノブタン（スペルミン）並びにこれらのアセチル化
体）とも反応しない。

【００１８】本発明のモノクローナル抗体は、オンコプ
テリンをＢＳＡやＫＬＨのようなキャリアタンパク質
に、２位の３−アミノプロピル基中のアミノ基を介して
結合したものを免疫原として用いて動物を免疫した後、
該動物から脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採
取し、これを常法であるケーラーとミルシュタインの方
法によりミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを形
成し、これらのハイブリドーマのうち、オンコプテリン
と反応するがビオプテリン及び１，３−ジアミノプロパ
ンとは反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマを選択し、該ハイブリドーマからモノクローナ
ル抗体を回収することにより得ることができる。免疫方
法及びハイブリドーマの形成方法自体はこの分野におけ
る周知の方法により行うことができ、その詳細な一例が
下記実施例に記載されている。また、オンコプテリンと
反応するがビオプテリン及び１，３−ジアミノプロパン
とは反応しないモノクローナル抗体は、例えばオンコプ
テリンをＢＳＡやＫＬＨのようなキャリアタンパク質
に、２位の３−アミノプロピル基中のアミノ基を介して
結合したものが不動化されたマイクロプレートのウェル
のような担体をブロッキングした後、ビオプテリン及び
１，３−ジアミノプロパン溶液を加え、これにモノクロ
ーナル抗体溶液を加えて反応させ、洗浄後、担体に結合
しているモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ等で検出する
ことにより選択することができる。オンコプテリン、ビ
オプテリン及び１，３−ジアミノプロパンのいずれとも
反応しないものは洗浄により洗い流されるので担体とは
結合しない。また、オンコプテリンと反応するものであ
ってもビオプテリン又は１，３−ジアミノプロパンとも
反応するものは、担体上のオンコプテリンと反応する前
にこれらと反応してしまい、担体上に不動化されるもの
はほとんどない。従って、上記方法により担体に結合さ
れたものはオンコプテリンと反応するがビオプテリン及
び１，３−ジアミノプロパンとは反応しないモノクロー
ナル抗体である。下記実施例では、このようにして選択
されたモノクローナル抗体をさらに二次スクリーニング
にかけて本発明のモノクローナル抗体を選択している。
すなわち、キャリアタンパク質に結合したオンコプテリ
ンを担体に結合し、これに逓減希釈したビオプテリン溶
液又はオンコプテリン溶液を加え、次いでモノクローナ
ル抗体溶液を加え、洗浄し、ＥＬＩＳＡ等により担体に
結合したモノクローナル抗体を検出する。ビオプテリン
による阻害濃度に対するオンコプテリンによる阻害濃度
の低いものを選択する。なお、上記の方法において、Ｅ
ＬＩＳＡはこの分野において周知の方法であり、下記実
施例にも詳述されている。

【００１９】なお、抗原となるオンコプテリンは、公知
の方法（例えばM. Sawada et al.,1984, Clin. Chim. A
cta, 138, 275記載の方法）により合成することができ
る。

【００２０】本発明のモノクローナル抗体は、オンコプ
テリンと反応するがビオプテリンと反応しないので、こ
れを用いて免疫分析を行うことにより、生体由来の試料
中のオンコプテリンを、健常人にも多く存在するビオプ
テリンと区別して特異的に測定することができる。さら
に、本発明の好ましい態様では、モノクローナル抗体は
ネオプテリンとも反応しないので、ビオプテリンのみな
らずネオプテリンとも区別してオンコプテリンを測定す
ることができる。さらに、好ましい態様では、本発明の
モノクローナル抗体はオンコプテリン誘導体とも反応す
るので、抗原としてオンコプテリン誘導体を用いること
もでき、有利である。すなわち、例えばマイクロプレー
トのウェルのような担体に抗原を結合する場合、オンコ
プテリンをそのまま結合すると抗原性が失われる虞があ
るが、キャリアタンパク質と結合したオンコプテリン誘
導体を用いれば、キャリアタンパク質の部分が担体に容
易に結合されるので、オンコプテリンの抗原性が失われ
ない。従って、モノクローナル抗体がこのようなオンコ
プテリン誘導体と反応するという性質は免疫測定を行う
上で非常に有利である。

【００２１】本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫
分析は、従来の免疫分析と全く同様にして行うことがで
き、その具体的な方法は問わない。すなわち、免疫測定
法の形式により分類すれば、サンドイッチ法、競合法、
凝集法等に適用可能であるし、また、標識により分類す
れば、酵素標識法、放射標識法、蛍光標識法及びビオチ
ン標識法等に適用可能である。これらの免疫測定方法自
体はこの分野において周知であり、下記実施例にも免疫
測定法の詳細な例が記載されている。

【００２２】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体
的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定さ
れるものではない。

【００２３】実施例１ (1) 免疫原の調製 ＢＳＡ１６μｇ／ｍｌを２ｍｌの０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ８．３）に溶解し、ここへグルタルアルデヒド溶
液（５０％水溶液）を２５μｌ添加し最終濃度０．２％
として、２５℃で４時間ゆっくりと撹拌して反応させ
た。これを０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．３）で平衡化
したＧ−２５ゲル濾過カラム（φ１．２×１０ｃｍ）を
通過させてタンパク画分を１．２５ｍｌ回収した。ここ
へ、M. Sawada et al., 1984, Clin. Chim. Acta, 138,
275記載の方法と同様にして合成したオンコプテリン
（ＯＮＰ）を１ｍｇ添加して４℃で４８時間反応した
後、１Ｍグリシン、０．１Ｍトリスヒドロキシアミノメ
タンの水溶液を１５０μｌ添加して反応を停止した。さ
らに、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを１ｍｇ添加して
４℃で一晩静置後、該溶液をＰＢＳ（２Ｌ×３回）で透
析して、ＢＳＡ−ＯＮＰ結合体を得た。

【００２４】２段目の反応の前後で試料の一部（２０μ
ｌ）をとり、Ｇ−２５ゲル濾過カラム（φ１．０×３０
ｃｍ）に通し（流速：１．０ｍｌ／分、溶媒：ＰＢＳ
（ｐＨ７．６））、反応の進行を確認した。その結果、
ＢＳＡとＯＮＰの結合比率（モル比）は、ＢＳＡ：ＯＮ
Ｐ＝１：１０．１であった。

【００２５】(2) モノクローナル抗体の作製 (i) 免疫感作 (1) で調製したＢＳＡ−ＯＮＰをＰＢＳで５００μｇ／
ｍｌに希釈し、フロインド完全アジュバントと等量混合
してエマルジョン化した。このエマルジョンをマウス１
匹あたり１００μｌずつＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注
射した。以下、フロインド完全アジュバンドの代わりに
フロインド不完全アジュバンドを用いて２週間毎に合計
３回注射を繰り返した。

【００２６】(ii)細胞融合 免疫されたマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ステンレ
スメッシュにより単細胞にほぐし、脾細胞の１／５量の
マウスミエローマ細胞株Ｐ３×６３−Ａｇ８−６５３細
胞とＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）を混合し遠
心分離後、細胞のペレットに５０％ポリエチレングリコ
ール１５００（ベーリンガー社製）を加え、細胞融合を
行った。その後徐々にＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し遠
心分離により上清を除去した融合細胞を含むペレット
を、２０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＨＡＴ培地
（０．０１ｍＭヒポキサンチン、１．６μＭチミジン、
０．０４μＭアミノプリテンを含むＲＰＭＩ１６４０培
地）に懸濁し９６穴マイクロプレートに１ウェルあたり
４×１０⁵ 個の細胞をまき込んで５％ＣＯ₂ 下３７℃で
培養した。２週間後、以下の方法により目的の抗体をス
クリーニングした。

【００２７】(iii) １次スクリーリング (1) と同様にして調製したＫＬＨ−ＯＮＰ（ＫＬＨとＯ
ＮＰの結合比率（モル比）はＫＬＨをＢＳＡの分子量換
算して、ＫＬＨ：ＯＮＰ＝１：１０．５相当）をＰＢＳ
で希釈して５μｇ／ｍｌの濃度として９６穴イムノプレ
ートに５０μｌづつ加えて、４℃で１５時間静置した。
その後、該液を捨てて０．２％カゼイン−ＰＢＳ溶液を
１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間静置してブロッ
キングした。

【００２８】次いで、該液を捨てた後、ビオプテリンお
よび１，３−ジアミノプロパン溶液（各々０．１ｍｇ／
ｍｌ，１μｌ／ｍｌ）を２５μｌづつ添加し、さらに９
６穴マイクロプレートに培養していたハイブリドーマの
培養上清を各々ＰＢＳで２０倍に希釈したものを２５μ
ｌづつ９６穴イムノプレートの対応するウェルに添加し
て３７℃で１時間反応した。反応後、プレートをＰＢＳ
で洗浄して０．５％カゼイン−ＰＢＳで希釈した抗マウ
スＩｇ−ＨＲＰ標識抗体を各５０μｌづつ添加して、室
温で１時間反応した。ウェルを洗浄した後、ＯＰＤ（１
ｍｇ／ｍｌ）、０．０２％過酸化水素を含むクエン酸−
リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌ加え、１０分
間静置した後９Ｎ硫酸を５０μｌ添加して反応停止し
て、発色したウェルを目的の抗体を産生しているハイブ
リドーマの含まれる群として選択した。

【００２９】(iv)二次スクリーニング 次に、こうして選択されたウェルについて、１次スクリ
ーニングで用いたのと同じＫＬＨ−ＯＮＰ固定化プレー
ト（ブロッキグ済み）を作成し、以下に示す方法により
目的のクローンを更に選択した。

【００３０】すなわち、ビオプテリン濃度を段階的に変
化させた０．２％カイゼン−ＰＢＳ溶液（ＢＰ濃度：２
００μｇ／ｍｌ，６６．７μｇ／ｍｌ，２２．２μｇ／
ｍｌ，７．４μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ…以下同様
に３倍希釈）をプレートの左半分にそれぞれ２５μｌづ
つ添加し、同様にオンコプテリン濃度を段階的に変化さ
せた０．２％カゼイン−ＰＢＳ溶液（ＯＮＰ濃度：２０
０μｇ／ｍｌ，６６．７μｇ／ｍｌ，２２．２μｇ／ｍ
ｌ，７．４μｇ／ｍｌ，２．５μｇ／ｍｌ…以下同様に
３倍希釈）をプレートの右半分にそれぞれ２５μｌづつ
添加した。次いで、１次スクリーニングで選択したウェ
ルのハイブリドーマ培養上清の２０倍希釈（ＰＢＳ）液
をそれぞれの培養上清毎に、各々の段階的濃度のビオプ
テリン濃度及びオンコプテリン濃度に２５μｌづつ添加
して、以下１次スクリーニングと同様の操作を行った。

【００３１】発色反応の結果、ＢＰよりもＯＮＰについ
て低い濃度で阻害が起きている（吸光度が低い）ものの
内特にその濃度が低いもの（ＢＰにより阻害濃度に対す
るＯＮＰによる阻害濃度の最も低いもの）を目的の抗体
を産生するハイブリドーマとして選択し、これについて
限界希釈法により目的のクローン（Ｎ１１９２）として
確立した。

【００３２】(v) モノクローナル抗体の精製 クローン（Ｎ１１９２）を１０％ＦＣＳを加えたＰＲＭ
Ｉ１６４０培地で培養し、遠心分離（２００ｇ，５分
間）してＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して再度遠心分離
した後ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０⁷ 個／ｍｌの濃
度に懸濁した。これを７日前に予めプリスタン（２，
６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を注射し
ておいたＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に０．５ｍｌずつ接
種した。約２週間後、腹部の膨張したマウスから腹水を
採取し、遠心分離（２００ｇ，５分間）により細胞を除
去した後、これを硫酸アンモニウムを加えて５０％飽和
溶液とし、沈殿を分離してＰＢＳに溶解した。

【００３３】これを３Ｍ塩化カリウムを含む１．５Ｍグ
リシン緩衝液（ｐＨ８．０）で十分に透析し、プロテイ
ンＡカラム（φ５ｍｍ×２０ｍｍ）（ファルマシア社
製）にアプライして十分に吸着させた後３Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で溶出した。

【００３４】(vi)モノクローナル抗体のクラス及びサブ
クラス モノクローナル抗体の抗体クラスとサブクラスは、マウ
スモノクローナル・サブ−アイソタイピングキット（AM
ERICAN QUALEX 社製）を使用して決定した。その結果、
得られたモノクローナル抗体はＩｇＧ１と決定された。

【００３５】(vii) 寄託 上記のようにして得られたモノクローナル抗体＃１１９
２を産生するハイブリドーマＮ１１９２は、生命工学工
業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４７９１である。

【００３６】実施例２ 抗体の反応性 (1) ＯＮＰ誘導体の作製 ＢＳＡ１００ｍｇをＰＢＳ（ｐＨ７．６）８ｍｌに溶解
し、ＳＰＤＰ２５ｇを少量の８０％ＤＭＦ水溶液に溶解
して添加して、室温で窒素ガス条件下で５時間反応し
た。これをＧ−２５ゲル濾過カラム（φ２．０×５０ｃ
ｍ）を通過させてタンパク画分を８ｍｌ回収した。そこ
へジチオスレイトール１０ｍｇを添加して４℃で一晩放
置してＳＨ化したＢＳＡを得た。

【００３７】別途、ＯＮＰ２５ｍｇをＰＢＳ（ｐＨ７．
６）２ｍｌに溶解し、ＳＰＤＰ４０ｍｇを少量の８０％
ＤＭＦ水溶液に溶解して添加して、室温で窒素ガス条件
下で５時間反応したものを先に示したＳＨ化したＢＳＡ
の溶液に添加して、４℃で１５時間反応した。反応終了
後、該液をＰＢＳ（２Ｌ×３回）で透析して、ＢＳＡ−
ＯＮＰ結合体（アミド結合型）を得た。

【００３８】最終の反応の前後で試料の一部（２０μ
ｌ）をとり、Ｇ−２５ゲル濾過カラム（φ１．０×３０
ｃｍ）に通し（流速：１．０ｍｌ／分、溶媒：ＰＢＳ
（ｐＨ７．６））、反応の進行を確認した。その結果、
ＢＳＡとＯＮＰの結合比率（モル比）は、ＢＳＡ：ＯＮ
Ｐ＝１：２４．２であった。

【００３９】また、実施例１と同様にして最終の還元処
理のみを省略してＢＳＡ−ＯＮＰ結合体（シッフ塩基
型）を得た。

【００４０】(2) 抗体の反応性 実施例１で得たＢＳＡ−ＯＮＰをＰＢＳに希釈して０．
１μｇ／ｍｌの濃度として９６穴イムノプレートに５０
μｌづつ添加した。室温で１５時間静置後、該液を捨て
て０．２％カゼインＰＢＳ溶液を１００μｌづつ添加
し、３７℃で１時間静置してブロッキングした。

【００４１】ついで該液を捨てた後、ＢＳＡ−ＯＮＰ
（アミド結合型）、ＢＳＡ−ＯＮＰ（シッフ塩基型）を
それぞれ０．２％カゼイン−ＰＢＳ溶液（１μｇ／ｍ
ｌ）として該プレートのウェルに加えた。また、比較と
して０．２％カゼイン−ＰＢＳ溶液のみのもの、実施例
１のＢＳＡ−ＯＮＰの０．２％カゼイン−ＰＢＳ溶液
（１μｇ／ｍｌ）を加えたものも同様に行った（それぞ
れ２５μｌづつ）。そこへ、モノクローナル抗体（＃１
１９２）をＰＢＳで希釈して５ｎｇ／ｍｌとしてそれぞ
れ、各濃度オンコプテリン、ビオプテリン及び１，３−
ジアミノプロパンを添加したウェルに２５μｌづつ添加
して、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、ウェル
を洗浄して０．５％カゼイン−ＰＢＳで希釈した抗マウ
スＩｇ−ＨＲＰ標識抗体を各５０μｌづつ添加して、室
温で１時間反応した。ウェルを洗浄した後、ＯＰＤ（１
ｍｇ／ｍｌ）、０．０２％過酸化水素を含むクエン酸−
リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌ加え、１０分
間静置した後９Ｎ硫酸を５０μｌ添加して反応停止し
て、４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＢＳＡ
−ＯＮＰ（アミド結合型）、ＢＳＡ−ＯＮＰ（シッフ塩
基型）、０．２％カゼイン−ＰＢＳ溶液のみのもの、実
施例１のＢＳＡ−ＯＮＰはそれぞれ、０．０２１、０．
０３５、１．０３８、０．０１５であった。

【００４２】この結果、ＢＳＡ−ＯＮＰ（アミド結合
型）、ＢＳＡ−ＯＮＰ（シッフ塩基型）はいずれもモノ
クローナル抗体＃１１９２が反応することが確認され
た。

【００４３】実施例３ ＯＮＰの測定系／特異性の評価 実施例１で得たＢＳＡ−ＯＮＰをＰＢＳに希釈して０．
１μｇ／ｍｌの濃度として９６穴イムノプレートに５０
μｌづつ添加した。室温で１５時間静置後、該液を捨て
て０．２％カゼインＰＢＳ溶液を１００μｌづつ添加
し、３７℃で１時間静置してブロッキングした。

【００４４】ついで該液を捨てた後、オンコプテリン、
ビオプテリン及び１，３−ジアミノプロパンを含む溶液
をそれぞれのウェルに以下のように加えた。すなわち、
オンコプテリンの０．２％カゼイン−ＰＢＳ溶液（２０
μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎ
ｇ／ｍｌ、及び２ｎｇ／ｍｌ）を２５μｌ加えた。同様
に、ビオプテリン及びネオプテリンについては０．２％
カゼイン−ＰＢＳ溶液（２００μｇ／ｍｌ、２０μｇ／
ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、及び２０ｎｇ
／ｍｌ）を２５μｌ加え、１，３−ジアミノプロパンに
ついては０．２％カゼイン−ＰＢＳ溶液（２００μｇ／
ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍ
ｌ、及び２０ｎｇ／ｍｌ）を２５μｌ加えた。

【００４５】そこへ、モノクローナル抗体（＃１１９
２）をＰＢＳで希釈して５ｎｇ／ｍｌとしてそれぞれ、
各濃度のオンコプテリン、ビオプテリン及び１，３−ジ
アミノプロパンを添加したウェルに２５μｌづつ添加し
て、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、ウェルを
洗浄して０．５％カゼイン−ＰＢＳで希釈した抗マウス
Ｉｇ−ＨＲＰ標識抗体を各５０μｌづつ添加して、室温
で１時間反応した。ウェルを洗浄した後、ＯＰＤ（１ｍ
ｇ／ｍｌ）、０．０２％過酸化水素を含むクエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を１００μｌ加え、１０分間
静置した後９Ｎ硫酸を５０μｌ添加して反応停止して、
４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を、図１に示
した。

【００４６】この結果、ハイブリドーマ（Ｎ１１９２）
の産生するモノクローナル抗体＃１１９２は、ＯＮＰに
反応してビオプテリン及びネオプテリンに反応しない抗
体であることが確認された。また、これによりＯＮＰの
定量測定が可能であることが確認された。

【００４７】

【発明の効果】本発明により、ビオプテリン及び１，３
−ジアミノプロパンとは反応せず、オンコプテリンと反
応するモノクローナル抗体が初めて提供された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳ
Ａにより、濃度既知のオンコプテリン、ビオプテリン、
１，３−ジアミノプロパン及びネオプテリンを測定した
検量線を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 オンコプテリンと反応し、ビオプテリン
   及び１，３−ジアミノプロパンとは反応しないモノクロ
   ーナル抗体。
2. 【請求項２】 オンコプテリンのプテリン環の２位に結
   合した３−アミノプロピル基中のアミノ基の水素原子が
   置換したオンコプテリン誘導体と反応する請求項１記載
   のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ネオプテリンと反応しない請求項１又は
   ２記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 モノクローナル抗体＃１１９２（ＦＥＲ
   Ｍ Ｐ−１１９２）である請求項３記載のモノクローナ
   ル抗体。
5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれか１項記載の
   モノクローナル抗体と検体中のオンコプテリンとの抗原
   抗体反応を利用して該検体中のオンコプテリンを測定す
   る免疫測定方法。