WO2017150517A1 - 生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット - Google Patents

生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット Download PDF

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浩之 知久
典之 笠置
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Definitions

  • the present invention relates to a kit for quantifying a substance to be measured in a biological sample.
  • a fluorescence detection method is widely used as a highly sensitive and easy measurement method for quantifying a measurement target substance such as a protein, an enzyme or an inorganic compound contained in a biological sample.
  • the fluorescence detection method detects the presence of a substance to be measured by detecting the fluorescence emitted when the excitation light of the above specific wavelength is irradiated to the sample thought to contain the substance to be measured which emits fluorescence by being excited by the light of the specific wavelength. It is a method to confirm.
  • the substance to be measured is not a fluorescent substance
  • a substance in which a substance that specifically binds to the substance to be measured is labeled with a fluorescent dye is brought into contact with a sample, and then fluorescence is emitted when irradiated with excitation light in the same manner as above. By detection, the presence of the substance to be measured can be confirmed.
  • a method which utilizes the effect of electric field enhancement by plasmon resonance.
  • a sensor chip provided with a metal film in a predetermined area on a transparent support is prepared.
  • excitation light is made incident at an angle greater than or equal to the total reflection angle from the side opposite to the metal film formation surface of the support with respect to the interface between the support and the metal film.
  • the irradiation of the excitation light generates surface plasmons on the metal film, and the electric field enhancing action by the generation of the surface plasmons enhances the fluorescence, thereby improving the signal / noise ratio (S / N ratio).
  • the surface plasmon excitation fluorescence detection method (Surface Plasmon Fluorescence, hereinafter referred to as "SPF method") is about 10 times signal enhancement as compared to the fluorescence detection method according to incident light excitation (hereinafter referred to as "incident fluorescence method”) Degree can be obtained and measured with high sensitivity.
  • Bile acid is a steroid derivative present in mammalian bile and is a general term for compounds having a cholanic acid skeleton, and representative ones include cholic acid, deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid.
  • Patent Document 1 discloses a method for determining the presence, absence or amount of an analyte in a sample, and (a) specifically recognizing the analyte The sample is mixed with a nonmetallic labeled composition consisting of colloidal nonmetallic particles to which a binding component capable of binding is attached, and then (b) the presence / absence or amount of the analyte / colloidal nonmetallic particle complex is determined.
  • Patent Document 1 describes that the binding component bound to nonmetallic particles is selected from the group consisting of an antigen, a hapten and an antibody, and as analytes, cholic acid, deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid Etc. are illustrated.
  • An object of the present invention is to provide a kit capable of quantifying a substance to be measured in a biological sample with high accuracy even if the substance to be measured contains substances having a plurality of different structures.
  • a fluorescent particle having a first binding substance having a binding property to a substance to be measured comprising a substrate provided with a detection region having a second binding substance having binding property, at least three kinds of binding substances as the first binding substance.
  • the kit according to (1), wherein each fluorescent particle of the fluorescent particle has the at least three types of binding substances.
  • the second binding substance is a substance of at least three different structures or a combination of the three different structures and a carrier. .
  • the second binding substance includes cholic acid and / or cholic acid / albumin conjugate, deoxycholic acid and / or deoxycholic acid / albumin conjugate, and chenodeoxycholic acid and / or chenodeoxycholic acid / albumin conjugate
  • the substance to be measured includes substances having a plurality of different structures, the substance to be measured in the biological sample can be quantified with high accuracy.
  • FIG. 1 shows a schematic view of a sensor chip included in the kit of the present invention.
  • FIG. 2 shows an exploded view of the sensor chip included in the kit of the present invention.
  • a kit for quantifying a measurement target substance in a biological sample comprises: a fluorescent particle having a first binding substance capable of binding to the measurement target substance; and either the above-mentioned measurement target substance or the above-mentioned first binding substance A substrate provided with a detection region having a second binding substance having heel binding properties, wherein the substance to be measured comprises substances of at least three different structures,
  • the first binding substance is a kit including at least three binding substances having binding properties to each of the at least three different structural substances.
  • the substance to be measured contains substances of at least three different structures, it is possible to bind as a first binding substance to each of the substances of at least three different structures.
  • the substance to be measured contains substances of at least three different structures.
  • at least three types of binding substances it has become possible to quantify substances to be measured in biological samples with high accuracy.
  • a problem of improving the measurement accuracy when quantifying substances having three or more different structures such as bile acid etc. is newly found, and the above-mentioned problems are at least three as the first binding substance.
  • the solution is by using a binding substance.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample possibly containing the substance to be measured, and for example, biological samples, particularly body fluids of animals (eg, humans, dogs, cats, etc.) For example, blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose, or sputum) or excrements (eg, feces), organs, tissues, mucous membranes, skin, etc. can be mentioned.
  • the substance to be measured is not particularly limited as long as it includes substances of at least three different structures, and examples include bile acid, cholesterol, protein and the like.
  • Bile acids are usually associated with glycine and taurine, which are called conjugated bile acids (bile salts).
  • a rapid and convenient method of measuring serum bile acid concentrations in dogs and cats has come to be recognized as a sensitive and specific test that reflects hepatocyte function and enterohepatic circulation.
  • Research on serum bile acids detects hepatobiliary disease that requires a clinically definitive diagnosis, especially in dogs and cats that show high liver enzyme activity with unclear and uninterpretable clinical signs but without jaundice Because of this, the usefulness of serum bile acids has been shown.
  • fasting and postprandial bile acid determination is recommended to increase the diagnostic rate in the diagnosis of congenital portosystemic shunts.
  • bile acid concentration is high, acute hepatitis, chronic liver disease, bile zone, intestinal bacterial overgrowth, portosystemic shunt (PSS), etc. are suspected. On the other hand, when the bile acid concentration is low, intestinal malabsorption is suspected.
  • Such bile acids exist as a collection of slightly structurally different compounds, and specifically, 10 types of compounds exist.
  • bile acids are almost 100% occupied by three taurine conjugates of cholic acid, deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid.
  • the structures of cholic acid, deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid are shown below.
  • the first binding substance used in the present invention is a substance having a binding property to the substance to be measured.
  • an antigen, an antibody, or a complex thereof can be used, but it is not limited thereto.
  • the first binding substance is an antibody.
  • the first binding substance is an antibody
  • an antiserum prepared from serum of an animal immunized with the substance to be measured or an antibody purified from the antiserum as an antibody having binding properties to the substance to be measured A globulin fraction, a monoclonal antibody obtained by cell fusion using spleen cells of an animal immunized with the substance to be measured, or a fragment thereof [eg, F (ab ') 2 , Fab, Fab' or Fv], etc. Can be used. Preparation of these antibodies can be performed by a conventional method.
  • the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody or the like, or a commercially available antibody or an antibody prepared by known methods from animal serum or culture supernatant can be used.
  • the substance to be measured includes substances of at least three different structures, and the first binding substance has a binding property to each of the substances of at least three different structures described above. It contains various types of binding substances.
  • the first binding substance may be a non-conjugate and a conjugate of conjugate bile acid (preferably, specifically recognizing bile acid) anti-bile acid
  • conjugate bile acid preferably, specifically recognizing bile acid
  • anti-cholic acid antibodies, anti-deoxycholic acid antibodies and Anti-kenodeoxycholic acid antibodies can be generated and the above three types of antibodies can be used.
  • a cholic acid-BSA conjugate can be prepared by mixing cholic acid, bovine serum albumin (Bovine Serum Albumin, hereinafter abbreviated as BSA), and a condensing agent to combine the carboxylic acid portion of cholic acid with BSA. .
  • BSA bovine Serum Albumin
  • the conjugate is used as a mouse immunization antigen and immunized several times with the back of the mouse subcutaneously.
  • complete adjuvant (Freund's Complete Adjuvant: FCA) and / or incomplete adjuvant (Freund's Incomplete Adjuvant: FIA) can be appropriately selected and used in combination with the immunizing antigen.
  • a complete adjuvant is a substance that stimulates immunity and is a mixture of paraffin and arasel.
  • the incomplete adjuvant is one in which the killed Mycobacteria or Mycobacterium tuberculosis is added to the complete adjuvant to further enhance the antigenicity. After several immunizations as appropriate for several weeks, the mice are bled and antibody titers are measured.
  • the antigen is administered intraperitoneally when a sufficient rise in antibody titer is observed, and the spleen is removed several days later.
  • myeloma myeloma
  • the fusion cell line thus obtained can be injected into the abdominal cavity of a mouse, and monoclonal antibodies can be produced in ascites fluid by growing ascites-type antibody-producing cells, and these antibodies are recovered.
  • the target antibody can be obtained.
  • fluorescent particle As the fluorescent particles used in the present invention, fluorescent colored particles which can be usually used for immune reaction can be used, for example, fluorescent polymer particles such as fluorescent polystyrene beads, fluorescent glass particles such as fluorescent glass beads, etc. It can be used.
  • the material of the fluorescent particles include polymers using monomers such as styrene, methacrylic acid, glycidyl (meth) acrylate, butadiene, vinyl chloride, vinyl acetate acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, phenyl methacrylate, or butyl methacrylate
  • synthetic polymer powders such as copolymers using two or more types of monomers, and latexes in which these are uniformly suspended are preferable.
  • Other examples include organic polymer powders, inorganic substance powders, microorganisms, blood cells, cell membrane fragments, and liposomes.
  • the material of the latex include polystyrene, styrene-acrylic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, styrene-styrene sulfonic acid
  • examples thereof include salt copolymers, methacrylic acid polymers, acrylic acid polymers, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymers, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymers, and polyvinyl acetate acrylates.
  • the latex a copolymer containing at least styrene as a monomer is preferable, and a copolymer of styrene and acrylic acid or methacrylic acid is particularly preferable.
  • the method for producing the latex is not particularly limited, and can be produced by any polymerization method. However, since it is difficult to immobilize the antibody when the surfactant is present at the time of antibody labeling, it is preferable to prepare the latex by non-emulsifier-free emulsion polymerization, that is, by emulsion polymerization which does not use an emulsifier such as a surfactant.
  • fluorescent latex particles When the latex itself obtained by polymerization is fluorescent, it can be used as fluorescent latex particles as it is.
  • fluorescent latex particles can be produced by adding a fluorescent substance (fluorescent dye or the like) to the latex. That is, fluorescent latex particles can be produced by adding a fluorescent dye to a solution of latex particles containing water and a water-soluble organic solvent and stirring.
  • Liposomes and microcapsules containing a fluorescent dye can also be used as fluorescent particles.
  • the fluorescent coloring is not particularly limited as long as it is emitted when absorbing ultraviolet light etc. and returning to the ground state, and, for example, yellowish green (excitation wavelength 505 nm / emission wavelength 515 nm, the same applies hereinafter) ), Blue (350-356 nm / 415-440 nm), red (535-580 nm / 575-605 nm), orange (540 nm / 560 nm), red / orange (565 nm / 580 nm), crimson (625 nm / 645 nm), dark red ( Fluorescent coloring such as 660 nm / 680 nm) may be used.
  • fluorescent fluorescent particles are available, for example, from Thermo Fisher, and are marketed there under the trade name FluoSpheres®.
  • the average particle size of the fluorescent particles varies depending on the material of the particles, the concentration range for quantifying the substance to be measured, the measuring instrument and the like, but the range of 0.001 to 10 ⁇ m (more preferably 0.001 to 1 ⁇ m) is preferable.
  • the average particle size of the fluorescent particles can be measured by a commercially available particle size distribution analyzer or the like.
  • Particle size distribution measurement methods include optical microscopy, confocal laser microscopy, electron microscopy, atomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, dynamic light scattering, centrifugal sedimentation, electric pulse Measurement methods, chromatography methods, ultrasonic attenuation methods and the like are known, and devices corresponding to the respective principles are commercially available.
  • Nanotrac UPA Nikkiso Co., Ltd.
  • dynamic light scattering particle size distribution analyzer LB-550 Horiba, Ltd.
  • concentrated particle size analyzer as a commercial measuring apparatus using dynamic light scattering FPAR-1000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.), ZETA SIZER Nano series (Malvern Co., Ltd.), etc.
  • d median diameter
  • the three or more binding substances used as the first binding substance are preferably adsorbed to the surface of the individual fluorescent latex particles and used.
  • one fluorescent particle of the fluorescent particles used has the above three types of binding substances.
  • a fluorescent latex particle to which one of the three or more types of binding substances (for example, an anti-cholic acid antibody) is adsorbed, and another one of the three or more types of binding substances (for example, anti-deoxy) A fluorescent latex particle to which cholic acid antibody is adsorbed, and a fluorescent latex particle to which another type (for example, an anti-kenodeoxycholic acid antibody) of the above three or more types of binding substances is adsorbed are prepared respectively.
  • An embodiment using a mixture of three fluorescent latex particles is also preferred.
  • an embodiment in which three or more types of binding substances used as the first binding substance are adsorbed on the surface of one fluorescent particle (individual fluorescent particles) is more preferably used.
  • the substance to be measured is a collection of a plurality of different substances, it is preferable to use a fluorescent particle having all binding substances to which the different substances bind.
  • fluorescent particles having all of an anti-cholic acid antibody, an anti-deoxy cholic acid antibody, and an anti-quenodeoxycholic acid antibody can be used. With the above configuration, all the fluorescent particles can interact with all the measurement target substances composed of different substances present in the biological sample. Therefore, it is preferable to bind at least three binding substances to each fluorescent particle.
  • the method for immobilizing the first binding substance on fluorescent particles is described, for example, in the protocol attached to JP-A-2000-206115 or Thermo Fisher's FluoSpheres® polystyrene microspheres F 8813, and the like. Any known method for preparing a reaction reagent can be used. Further, as a principle for immobilizing an antibody as a binding substance on particles, any principle of physical adsorption and chemical bond by covalent bond can be adopted. As a blocking agent for covering the particle surface not coated with antibody after immobilizing the antibody on the particle, known substances such as BSA, skim milk, casein, soybean-derived component, fish-derived component or polyethylene glycol etc. It is possible to use commercially available blocking agents for immunoreactions containing substances or substances having the same properties as the above substances. These blocking agents can be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali or the like, if necessary.
  • components that do not participate in the antigen-antibody reaction preferably proteins, more preferably BSA, BLOCKACE, skimmed milk and casein etc. It is desirable to use a blocking agent to protect the non-conjugated portion of the particle surface.
  • a stabilizer When immobilizing the antigen, antibody or the like on the particles, a stabilizer can be added as necessary.
  • the stabilizing agent is not particularly limited as long as it stabilizes an antigen or an antibody, such as synthetic polymers such as sucrose and polysaccharides or natural polymers, and is exemplified by Immunoassay Stabilizer (Advanced Biotechnologies Inc (ABI)) Commercially available stabilizers of the formula are also usable.
  • the fluorescent particle having the first binding substance is contained in the kit of the present invention, and the embodiment contained in the container which is a part of the kit, for example, the cup is preferred.
  • the substance to be measured in the biological sample and the first binding substance can be bound by injecting the biological sample into a container containing fluorescent particles, mixing and stirring.
  • a substrate in order to achieve highly sensitive measurement, it is preferable to adopt a measurement method for performing surface plasmon fluorescence (SPF) detection described later.
  • a substrate in this case, it is preferable to use a substrate having a metal film on the surface.
  • the metal constituting the metal film is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur.
  • free electronic metals such as gold, silver, copper, aluminum or platinum can be mentioned, and gold is particularly preferable.
  • the detection region described later is the gold film surface.
  • the above metals can be used alone or in combination.
  • an intermediate layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
  • the thickness of the metal film is optional, but for example, it is preferably 1 nm or more and 500 nm or less, and particularly preferably 10 nm or more and 200 nm or less. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium can not be detected sufficiently. Moreover, when providing the intervening layer which consists of chromium etc., it is preferable that the thickness of the intervening layer is 0.1 nm or more and 10 nm or less.
  • the formation of the metal film may be carried out by a conventional method, for example, it can be carried out by a sputtering method, a vapor deposition method, an ion plating method, an electroplating method or an electroless plating method, but a mixture of the substrate material and the metal film
  • a sputtering method for example, it can be carried out by a sputtering method, a vapor deposition method, an ion plating method, an electroplating method or an electroless plating method, but a mixture of the substrate material and the metal film
  • the thickness of the mixed layer of the substrate material and the metal film is not particularly limited as long as sufficient adhesion can be ensured, but 10 nm or less is preferable.
  • the metal film is preferably disposed on the substrate.
  • disposed on the substrate means that the metal film is disposed so as to be in direct contact with the substrate, or the metal film does not come in direct contact with the substrate, but through other layers. Also includes the case where it is placed.
  • the material of the substrate that can be used in the present invention is, for example, optical glass such as BK7 (borosilicate glass), which is a type of general optical glass, or synthetic resin, specifically polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, A material made of a material transparent to laser light such as polycarbonate or cycloolefin polymer can be used.
  • Such a substrate is preferably a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarization and has excellent processability.
  • a substrate in which a gold film is deposited on polymethyl methacrylate (PMMA) can be mentioned.
  • the substrate is provided with a detection region having a second binding substance that has a binding property to either the measurement target substance or the first binding substance.
  • the second binding substance is a substance having a binding property to the substance to be measured or a substance having a binding property to the first binding substance.
  • a substance having a binding property to the substance to be measured can be used as the second binding substance.
  • a substance having binding with the first binding substance can be used as the second binding substance.
  • the determination is preferably performed by a competitive method, and it is preferable to use a substance having a binding property with the first binding substance as the second binding substance.
  • the second binding substance is not particularly limited, but preferred examples include an antigen, an antibody, or a complex thereof, preferably an antigen, and as a second binding substance, a substance to be measured ( It is particularly preferred to use a substance that has binding properties with the first binding substance.
  • the second binding substance may be a substance having at least three different structures which are the measurement target substance, or a substance of the three different types of substances and the carrier. It is preferably a conjugate.
  • the carrier means a substance to which a plurality of molecules of the at least three kinds of substances to be measured can be bound.
  • a preferable second binding substance an embodiment in which a plurality of molecules of the same kind of substance to be measured includes at least three kinds of conjugates bound to a carrier of one molecule. Examples of preferred carriers include proteins and the like, and among them, bovine serum albumin can be mentioned specifically.
  • the second binding substance is cholic acid and / or cholic acid / albumin conjugate, deoxycholic acid and / or deoxycholic acid / albumin conjugate, and chenodeoxycholic acid and / or chenodeoxychol It is preferred to include an acid-albumin conjugate.
  • an embodiment comprising cholic acid conjugate in cholic acid an embodiment wherein cholic acid is substituted with cholic acid conjugate, an embodiment comprising deoxycholic acid conjugate in deoxycholic acid, deoxycholic acid as deoxycholic acid
  • a conjugate-substituted embodiment a chenodeoxycholic acid-containing embodiment with a chenodeoxycholic acid conjugate, or a chenodeoxycholic acid-substituted embodiment with a chenodeoxycholic acid conjugate.
  • cholic acid and / or cholic acid / albumin conjugate it is preferable to contain cholic acid and / or cholic acid / albumin conjugate, deoxycholic acid and / or deoxycholic acid / albumin conjugate, and chenodeoxycholic acid and / or chenodeoxycholic acid / albumin conjugate.
  • the second method for immobilizing a binding substance on a substrate is described in, for example, Tech Notes Vol. All known methods for preparing a general ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reagent as described in 2-12 and the like can be used.
  • surface modification may be performed by arranging a self-assembled monolayer (SAM) or the like on a substrate, and physical adsorption may be performed as a method of immobilizing the second binding substance on the substrate. Any of the methods using and the method using chemical bonding by covalent bonding can be adopted.
  • BSA basic protein
  • blocking agents for immune reaction containing polyethylene glycol etc. and the above substance or a substance having the same property as the above substance can be used.
  • These blocking agents can be subjected to pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali or the like, if necessary.
  • the present invention can provide a test area for detecting the presence or absence of a substance to be measured in a biological sample on a substrate.
  • this test area for example, it is possible to quantify an antigen by capturing an antigen as a measurement target and detecting and quantifying the amount of label bound to the antigen.
  • the antigen can be quantified by a method in which only the label bound to the antigen can not be bound, and only the label not bound to the antigen is captured, and the amount of the label bound to the antigen is calculated.
  • this detection method is referred to as a competitive method, here, a substrate for the competitive method will be described.
  • the test area of the substrate has a site that reacts with all three or more types of binding substances (for example, antibodies) present on the fluorescent particles.
  • an embodiment in which three or more types of antigens present in a biological sample are present on a test area of a substrate is preferred.
  • the antigen and BSA are reacted in the presence of a condensing agent to produce an antigen-BSA conjugate, and the conjugate is adsorbed onto the test area to produce a test area. Therefore, in the test area, BSA conjugates bound to three or more types of antigens co-exist in one area.
  • antigen-BSA conjugates are randomly mixed and arranged on the test area.
  • the antigen-BSA conjugate is dissolved in a buffer solution, spotted on a substrate, allowed to stand for a certain period of time, and then the supernatant is aspirated and allowed to bind to a test area on the substrate by a method such as drying. It is possible.
  • control area In the present invention, in order to minimize the influence of the measurement environment, particularly the measurement temperature, the control area is provided on the substrate, and the information on the test area is standardized by the information on the control area, thereby making the environmental dependency extremely high. It can be kept low.
  • the control area is preferably designed so as to be capable of binding to all the labels regardless of the amount of the substance to be measured present in the biological sample to be used. It is preferable to have an antibody that interacts with all three or more types of antibodies present on the fluorescent particle that is a label.
  • the preferred antibody to be present in the control area has the function of recognizing three or more types of binding substances (for example, antibodies) present on fluorescent particles, and if the antibody is derived from a mouse, it is an anti-mouse antibody Preferably, if the antibody on the fluorescent particle is derived from goat, it is preferably an anti-goat antibody.
  • the antibodies on these control areas can be dissolved in a buffer solution, spotted on a substrate, allowed to stand for a certain period of time, and then attached to the substrate by a method such as suctioning and drying the supernatant. .
  • the fluorescent particle is preferably further modified with a substance having no specific binding property to the substance to be measured or a binding substance.
  • a substance having no specific binding property to the substance to be measured or a binding substance for example, in a competitive method, not only a biological sample which does not contain a substance to be measured but also a biological sample which is positive which contains a substance to be measured exists, which is negative. The solution of the divergence problem is recognized as an issue. Although the cause of such false negative is not clear, it is not desirable to bind naturally due to nonspecific interaction between the fluorescent particle surface not covered with antibody and the detection area (test area) It is believed that the presence of fluorescent particles is one of the causes.
  • the substance present on the test area is the antibody present
  • by binding to both of the substances on the surface of the fluorescent particle it may be detected as negative even when a positive biological sample containing the substance to be measured is measured.
  • blocking with BSA is used to suppress nonspecific adsorption to a solid phase surface (for example, the surface of a fluorescent particle, the surface of a gold film on a substrate).
  • an anti-BSA antibody it may react to crosslink between the BSA on the fluorescent particle and the BSA on the substrate to cause high-value dissociation.
  • a substance which does not have a specific binding property with the substance to be measured for example, bile acid
  • the substance to be measured for example, bile acid
  • the binding substance an antibody which does not bind to bile acid, or a protein (Protein A, Protein G) which is not used in the test area can be used, among which an antibody which does not bind to bile acid Is preferred.
  • an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with an antigen different from bile acid, an immunoglobulin fraction purified from the antiserum, and a cell using spleen cells of the animal immunized with the substance to be measured It is possible to use a monoclonal antibody obtained by fusion, or a fragment thereof [eg, F (ab ') 2 , Fab, Fab' or Fv] or the like. Preparation of these antibodies can be performed by a conventional method. Furthermore, the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody or the like, or a commercially available antibody, or an antibody prepared by known methods from animal serum or culture supernatant may be used. In the present invention, an embodiment in which an anti-CRP (C-reactive protein) antibody is particularly used as a binding substance is preferable.
  • CRP C-reactive protein
  • an antibody that can be used in the present invention is an antibody derived from an organism in which an immune reaction can occur, such as mouse, rat, hamster, goat, rabbit, sheep, cow, chicken, specifically mouse IgG, mouse IgM , Rat IgG, rat IgM, hamster IgG, hamster IgM, rabbit IgG, rabbit IgM, goat IgG, goat IgM, sheep IgG, sheep IgM, bovine IgG, bovine IgM, avian IgY, etc., either polyclonal or monoclonal may be used It is possible.
  • a fragmented antibody is a molecule derived from a complete antibody, having at least one antigen binding site, and specifically, it is Fab, F (ab ') 2 or the like. These fragmented antibodies are molecules obtained by enzyme or chemical treatment or using genetic engineering techniques.
  • a biological sample and a fluorescent particle having a first binding substance capable of binding to a substance to be measured are bound to either the substance to be assayed or the first binding substance.
  • a substance to be measured in a biological sample can be quantified by bringing it into contact with a substrate provided with a detection area having the following and then measuring the fluorescence caused by the fluorescent particle bound to the second binding substance on the detection area .
  • the quantification in the present invention is interpreted as the broadest concept as long as it is the measurement of the amount of the substance to be measured (for example, bile acid).
  • Specific embodiments of the measurement method include competitive method and sandwich method, but the competitive method is preferred.
  • the competitive method As an example of the competitive method, the case of quantifying bile acid will be described below. The same can be applied to the determination of substances other than bile acids.
  • an antigen-antibody antibody is formed on the substrate by anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particles and bile acid on the substrate (ie, bile acid in bile acid / albumin conjugate). A reaction takes place.
  • an antigen-antibody reaction occurs between the bile acid in the biological sample and the anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particle, and the anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particle and the substrate
  • the antigen-antibody reaction with the bile acid of i.e., the bile acid in the bile acid / albumin conjugate
  • anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particles not bound to albumin on the above substrate are removed.
  • the degree of formation of the immune complex on the substrate ie, the complex of the anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particle and the bile acid in the bile acid / albumin conjugate on the substrate
  • the concentration of bile acid in a biological sample can be measured.
  • the measurement form of the fluorescence in the competitive method can adopt either measurement of plate reader measurement or flow measurement, and can be measured, for example, by the following method.
  • a plurality of samples with known bile acid amounts having different bile acid concentrations are prepared, and this sample and anti-bile acid antibody labeled fluorescent particles are mixed in advance.
  • the mixed solution is brought into contact with the region where the bile acid / albumin conjugate is immobilized.
  • the fluorescence signals from the area in which the bile acid-albumin conjugate is immobilized are measured as a plurality of fluorescence signals while the mixture is in contact with the conjugate at specific time intervals.
  • the temporal change (inclination) of the fluorescence amount is determined at each bile acid concentration.
  • This temporal change is plotted as Y axis and bile acid concentration as X axis, and a relational expression of the bile acid concentration with respect to the temporal change of the amount of fluorescence is acquired using an appropriate fitting method such as the least squares method.
  • the amount of bile acid contained in the biological sample can be quantified using the result of the temporal change in the amount of fluorescence using the biological sample to be tested based on the relational expression thus obtained.
  • the determination of the amount of bile acid in a short time. Specifically, it is preferably performed within 10 minutes, more preferably within 8 minutes, and still more preferably within 6 minutes.
  • the sample and the anti-bile acid antibody-labeled fluorescent particles are obtained by using the relationship between the time variation of the fluorescence amount and the bile acid concentration previously obtained using an appropriate fitting method such as the least squares method.
  • the bile acid / albumin conjugate is immobilized, and then the amount of bile acid contained in the biological sample is converted based on the result of the temporal change in the amount of fluorescence using the biological sample to be tested It is preferable to include the time to do it.
  • the substance to be measured can be measured by the following procedure.
  • a biological sample which may contain a substance to be measured and a fluorescent particle having a first binding substance having a binding property to the substance to be measured are brought into contact on a substrate.
  • a binding reaction such as an antigen-antibody reaction
  • the substance to be measured is present in a biological sample, an immune complex formed of the second binding substance bound to the substrate, the substance to be measured, and the fluorescent particle having the first binding substance is formed. Be done.
  • the concentration of the substance to be measured can be measured by detecting the degree of formation of the immune complex as fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity and the concentration of the substance to be measured have a positive correlation.
  • a liquid mixture prepared by mixing a biological sample which may contain a substance to be measured and a fluorescent particle having a first binding substance is applied on a substrate and developed in a flow path.
  • the flow path is not particularly limited as long as it is a passage that allows the biological sample and the fluorescent particle having the first binding substance to flow down to the detection region.
  • a spotting port for spotting a biological sample solution containing a fluorescent particle having a first binding substance, a metal film as a detection area, and a flow path beyond the metal film exist;
  • the sample has a structure that can pass over the metal film.
  • a suction port can be provided on the side of the metal film opposite to the spotting port.
  • the method of detecting fluorescence in the present invention is not particularly limited.
  • a device capable of detecting fluorescence intensity specifically, a microplate reader or fluorescence detection (SPF) by surface plasmon excitation It is preferable to detect the fluorescence intensity using a biosensor or the like.
  • the form of measurement of fluorescence may be plate reader measurement or flow measurement.
  • the fluorescence detection method (SPF method) by surface plasmon excitation can be measured with higher sensitivity than the fluorescence detection method (epi-illumination fluorescence method) by epi-illumination.
  • a surface plasmon fluorescence (SPF) biosensor for example, an optical waveguide formed of a material which transmits excitation light of a predetermined wavelength as described in JP-A-2008-249361, and one of the optical waveguides
  • An optical system in which a metal film formed on the surface, a light source for generating a light beam, and the light beam are passed through an optical waveguide and made incident at an incident angle for generating surface plasmon to the interface between the optical waveguide and the metal film.
  • a sensor including fluorescence detection means for detecting fluorescence generated by being excited by the evanescent wave enhanced by the surface plasmon.
  • the fluorescence detection (SPF) system by surface plasmon excitation using the fluorescent particle of the present invention preferably detects fluorescence from the fluorescent substance depending on the amount of the measurement target substance immobilized on the metal film on the substrate. It is an assay method, which is different from the so-called latex agglutination method in which a change in optical clarity is detected as, for example, turbidity as the reaction progresses in solution.
  • latex agglutination method an antibody-sensitized latex in a latex reagent and an antigen in a biological sample are bound and aggregated by an antibody reaction.
  • This aggregate increases with time, and a method of quantifying the antigen concentration from the change in absorbance per unit time obtained by irradiating the aggregate with near infrared light is the latex aggregation method.
  • the present invention can provide a very simple method for detecting a substance to be measured, as compared with the latex agglutination method.
  • the kit of the present invention is used in a method of measuring a substance to be measured (for example, bile acid etc.), and when the substance to be measured is bile acid, it is a kit for bile acid measurement and diagnosis.
  • a substance to be measured such as bile acid
  • it in carrying out the measurement of a substance to be measured such as bile acid, it includes a sensor chip including a substrate on which a second binding substance such as bile acid / albumin conjugate is immobilized and a member holding fluorescent particles.
  • Various instruments or devices used to measure a substance to be measured such as a surface plasmon excitation device and a fluorescence measurement device, may be included.
  • a sample containing a known amount of the substance to be measured, an instruction manual, etc. may be included as an element of the kit.
  • This activated esterified cholic acid is referred to as a phosphate buffer (hereinafter referred to as PBS) in which 322 mg of bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is one of albumin, is dissolved.
  • BSA bovine serum albumin
  • the reaction solution was added dropwise to an aqueous solution of 65 mL (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After completion of the reaction, the reaction solution was purified by dialysis using 1 L of a solution in which the ratio of acetonitrile (hereinafter referred to as ACN, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) / Water is 1/3. Finally, it was lyophilized to obtain a white solid.
  • ACN acetonitrile
  • the bile acid / BSA ratio of the resulting conjugate is shown in Table 1.
  • HAT medium hyperxanthine aminopterin thymidine medium
  • HAT medium hyperxanthine aminopterin thymidine medium
  • An anti-mouse IgG HRP labeled antibody was used as a secondary antibody against an antibody produced by spleen cells to be measured. IgG indicates immunoglobulin G, and HRP indicates horseradish peroxidase.
  • the dilutions were prepared by limiting dilution of cells in each vial using RPMI 1640 in basal medium containing 10% by mass of FBS. One drop of dilution was pipetted into each well of six 96 well plates. Each well was observed with a microscope to confirm that the cells in each well were single cells. After culturing for 3 weeks, culture supernatants of the grown hybridomas were screened in the same manner as described above by ELISA of antibody measurement system. The top 10 wells with high ELISA signal were selected to complete the preparation of hybridomas. Isotyping kit (manufactured by Roche) was used to determine the subclass of the obtained antibody.
  • Liquid (Concentration: 50 ⁇ g / mL in 50 mmol / L MES) containing conjugate 1, conjugate 2 and conjugate 3 in a content ratio (1: 1: 1 by mass ratio) on the gold film surface of the detection region of this chip
  • a buffer solution pH 6, 150 mmol / L NaCl
  • the solution containing the anti-mouse antibody prepared in (4) (concentration: 50 ⁇ g / mL in 50 mmol / L MES buffer pH 6, 150 mmol / L NaCl) is spotted on the reference area of each substrate and dried. I did.
  • a cleaning solution (0.05 mass% Tween 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, Wako pure) prepared in advance before using the plurality of three types of substrates thus prepared as the flow path of the sensor chip It wash
  • FIG. 1 is a schematic view of the sensor chip 1
  • FIG. 2 is an exploded view of the sensor chip 1.
  • the sensor chip 1 is composed of an upper member 2, an intermediate member 3 and a substrate 4.
  • the upper member 2 is provided with a first container 5 and a second container 6.
  • the first container 5 and the second container 6 are collectively referred to as a container group 7.
  • a flow path 10 is formed in the substrate 4, and a detection area 8 and a reference area 9 are formed on the flow path 10.
  • the increase rate of the fluorescence intensity of each of the detection area and the reference area obtained in each substrate in unit time was determined as a fluorescence signal value, and normalization was performed by dividing the signal value of the detection area by the signal value of the reference area. . Further, a sample with a bile acid concentration of 0 was prepared, and the fluorescence signal value was normalized in the same manner, and the signal value from a sample not containing bile acid was normalized.

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Abstract

本発明の課題は、測定対象物質が、複数の異なる構造を有する物質を含む場合であっても、生体試料中の測定対象物質を高い精度で定量することができるキットを提供することである。本発明によれば、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子；及び上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えた基板：を含む、生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットであって、上記測定対象物質が、少なくとも３種類の異なる構造の物質を含み、上記第一の結合物質が、上記少なくとも３種類の異なる構造の物質の各々に対して結合性を有する、少なくとも３種類の結合物質を含む、測定対象物質を定量するためのキットが提供される。

Description

生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット
　本発明は、生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットに関する。
　生体試料に含まれるタンパク質、酵素又は無機化合物などの測定対象物質を定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する測定対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって測定対象物質の存在を確認する方法である。測定対象物質が蛍光体でない場合、測定対象物質と特異的に結合する物質を蛍光色素で標識した物質を、試料に接触させ、その後上記と同様にして、励起光を照射した際に発する蛍光を検出することにより、測定対象物質の存在を確認することができる。
　上記の蛍光検出法において、検出の感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属膜を設けたセンサチップを用意する。そして、支持体と金属膜との界面に対して支持体における金属膜形成面の反対面側から全反射角以上の角度で励起光を入射させる。この励起光の照射により金属膜に表面プラズモンが発生し、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって蛍光が増強され、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が向上することとなる。表面プラズモン励起による蛍光検出法（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、以下、「ＳＰＦ法」とする）は、落射励起による蛍光検出法（以下、「落射蛍光法」とする）と比較して約１０倍のシグナル増強度が得られ、高感度に測定することができる。
　胆汁酸は、哺乳類の胆汁に存在するステロイド誘導体でコラン酸骨格を有する化合物の総称であり、代表的なものとして、コール酸、デオキシコール酸、及びケノデオキシコール酸が挙げられる。胆汁酸の測定方法として、例えば、特許文献１には、試料中の分析対象物の存在の有無又は量を決定する方法であって、（ａ）該分析対象物を特異的に認識することのできる結合成分を結合させたコロイド状非金属粒子からなる非金属標識組成物と、該試料とを混合し、ついで（ｂ）分析対象物／コロイド状非金属粒子複合体の存在の有無又は量を決定することを特徴とする方法が記載されている。特許文献１に、非金属粒子に結合した結合成分が、抗原、ハプテン及び抗体よりなる群から選ばれたものであることが記載され、分析対象物としてはコール酸、デオキシコール酸、及びケノデオキシコール酸などが例示されている。
特開平１－３５３７２号公報
　上記のとおり、簡易的な測定方法で高感度に測定が可能な方法としては、表面プラズモン励起による蛍光検出法が知られているが、測定対象物質が、複数の異なる構造を有する物質を含む場合、測定精度は十分に満足のいくものではなかった。特に、胆汁酸などのように３種類以上の異なる構造の物質を定量するためには、再現性の高い簡易な測定方法を提供することが望まれている。
　本発明は、測定対象物質が、複数の異なる構造を有する物質を含む場合であっても、生体試料中の測定対象物質を高い精度で定量することができるキットを提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子；及び上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えた基板を有する、生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットにおいて、上記第一の結合物質として、少なくとも３種類の結合物質を使用することによって、上記課題が解決できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子；及び
上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えた基板：
を含む、生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットであって、
上記測定対象物質が、少なくとも３種類の異なる構造の物質を含み、
上記第一の結合物質が、上記少なくとも３種類の異なる構造の物質の各々に対して結合性を有する、少なくとも３種類の結合物質を含む、
測定対象物質を定量するためのキット。
（２）　上記蛍光粒子の個々の蛍光粒子が、上記少なくとも３種類の結合物質を有している、（１）に記載のキット。
（３）　上記第二の結合物質が、上記少なくとも３種類の異なる構造の物質、又は上記３種類の異なる構造の物質とキャリアとの結合体である、（１）又は（２）に記載のキット。
（４）　上記第一の結合物質が、コール酸抗体、デオキシコール酸抗体、及びケノデオキシコール酸抗体を含む、（１）から（３）の何れか一に記載のキット。
（５）　上記第二の結合物質が、コール酸及び／又はコール酸・アルブミン結合体、デオキシコール酸及び／又はデオキシコール酸・アルブミン結合体、並びにケノデオキシコール酸及び／又はケノデオキシコール酸・アルブミン結合体を含む、（１）から（４）の何れか一に記載のキット。
（６）　上記蛍光粒子が、蛍光ラテックス粒子である、（１）から（５）の何れか一に記載のキット。
（７）　上記検出領域が金膜表面である、（１）から（６）の何れか一に記載のキット。
　本発明のキットによれば、測定対象物質が、複数の異なる構造を有する物質を含む場合であっても、生体試料中の測定対象物質を高い精度で定量することができる。
図１は、本発明のキットに含まれるセンサチップの概略図を示す。 図２は、本発明のキットに含まれるセンサチップの分解図を示す。
　以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
［生体試料中の測定対象物質を定量するためのキット］
　本発明による生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットは、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子、及び上記測定対象物質又は上記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えた基板を含み、上記測定対象物質が、少なくとも３種類の異なる構造の物質を含み、
上記第一の結合物質が、上記少なくとも３種類の異なる構造の物質の各々に対して結合性を有する、少なくとも３種類の結合物質を含むキットである。
　本発明においては、測定対象物質が、少なくとも３種類の異なる構造の物質を含む場合であっても、第一の結合物質として、上記少なくとも３種類の異なる構造の物質の各々に対して結合性を有する、少なくとも３種類の結合物質を使用することにより、生体試料中の測定対象物質を高い精度で定量することが可能になった。本発明においては、胆汁酸などのように、３種類以上の異なる構造の物質を定量する際における測定精度を改善するという課題を新たに見出し、上記課題を、第一の結合物質として少なくとも３種類の結合物質を使用することによって解決している。
（生体試料）
　生体試料としては、測定対象物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコなど）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
（測定対象物質）
　測定対象物質としては、少なくとも３種類の異なる構造の物質を含む限り、特に限定されないが、例えば、胆汁酸、コレステロール、タンパク質などが挙げられる。
　胆汁酸の主な役割は、消化管内でミセルの形成を促進し、食物脂肪をより吸収しやすくするものである。肝臓で生合成されたものを一次胆汁酸という。また一部は腸管で微生物による変換を受け、その代謝物は二次胆汁酸と呼ばれる。胆汁酸は、通常グリシンやタウリンと結び付いており、これらは抱合胆汁酸（胆汁酸塩）と呼ばれる。
　イヌ及びネコにおける血清胆汁酸濃度を測定する迅速で簡便な方法は、肝細胞機能及び腸肝門脈循環を反映する高感度で特異的な検査として認識されるようになった。血清胆汁酸に関する研究では、特に、臨床兆候が不明瞭で解釈できない高い肝酵素活性を示しているが黄疸を伴わないイヌとネコにおいて、臨床的に確定診断が必要な肝胆道系疾患を検出するために血清胆汁酸の有用性が示されている。また、先天性門脈体循環シャントの診断において診断率を高めるために空腹時及び食後の胆汁酸定量が勧められている。胆汁酸濃度が、高値の場合は、急性肝炎、慢性肝疾患、胆汁うっ帯、腸内細菌過剰増殖、門脈シャント(ｐｏｒｔｏｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｓｈｕｎｔ、ＰＳＳ) 等が疑われる。一方、胆汁酸濃度が、低値の場合は、腸管吸収不良が疑われる。
　このような胆汁酸は、わずかに構造が異なる化合物の集合体として存在し、具体的には１０種類の化合物が存在する。イヌ及びネコの場合には、胆汁酸としては、 コール酸、デオキシコール酸及びケノデオキシコール酸の３種類のタウリン抱合体でほぼ１００％が占められている。例えば、イヌの血液中の３種類の構造違いの胆汁酸の比率は、平均値で表すと、コール酸タウリン抱合体：デオキシコール酸タウリン抱合体：ケノデオキシコール酸=＝７４％：２０％：６％の割合となる（日本獣医学雑誌、52（2）1990）。コール酸、デオキシコール酸及びケノデオキシコール酸の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（第一の結合物質）
　本発明で用いる第一の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体を使用できるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、測定対象物質と結合性を有する抗体として、例えば、その測定対象物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清又は培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
　本発明においては、測定対象物質が、少なくとも３種類の異なる構造の物質を含み、第一の結合物質は、上記の少なくとも３種類の異なる構造の物質の各々に対して結合性を有する、少なくとも３種類の結合物質を含む。
　例えば、測定対象物質が胆汁酸である場合、第一の結合物質としては、非抱合体及び抱合体の胆汁酸に結合性を有する（好ましくは、胆汁酸を特異的に認識する）抗胆汁酸抗体を使用する。胆汁酸には、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸及び／又はこれらの抱合体が含まれることから、本発明においては、第一の結合物質として、抗コール酸抗体、抗デオキシコール酸抗体及び抗ケノデオキシコール酸抗体を作製し、上記３種類の抗体を使用することができる。
　非抱合体及び抱合体の両方に反応する抗コール酸抗体、抗デオキシコール酸抗体及び抗ケノデオキシコール酸抗体の具体的な作製方法として、例えば抗コール酸抗体の作製方法を例に挙げて以下に説明する。
　コール酸と、牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ、以下ＢＳＡと略す）と、縮合剤を混合し、コール酸のカルボン酸の部分とＢＳＡが結合した、コール酸－ＢＳＡ結合体を作製することができる。結合体をマウス免疫感作抗原として用いて、数回、マウス背部皮下に免疫する。この場合、完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ：ＦＣＡ）、及び／又は不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ：ＦＩＡ）を適宜選択して免疫感作抗原と混合して使用することができる。完全アジュバントとは、免疫を刺激する物質であって、パラフィンとアラセルの混合物である。不完全アジュバントとは、完全アジュバントに死滅したミコバクテリア又は結核菌の死菌を加え、抗原性をさらに増強させたものである。数週間で数回、適宜免疫感作を行った後にマウスから採血し抗体価の測定を実施する。抗体価の十分な上昇が認められた場合に腹腔内に抗原を投与し、数日後に脾臓を摘出する。こうして免疫マウスより摘出した脾臓細胞を、変異株骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合させることで、抗体産生能力を備えた融合細胞を作製することができる。この融合細胞の中から目的とする抗原に対する抗体産生細胞のみを選択し、さらにその細胞株だけを増殖するために限界希釈を行う。希釈後の細胞の培養（クローニング）を行うことができる。このようにして得られる融合細胞株を、マウスの腹腔内に注射して、腹水型の抗体産生細胞を増殖させることによってモノクローナル抗体を腹水中に産生することが可能となり、これらの抗体を回収することで、目的の抗体を入手することができる。
（蛍光粒子）
　本発明で用いる蛍光粒子としては、免疫反応に通常用いられ得る蛍光で着色された粒子を使用することができ、例えば、蛍光ポリスチレンビーズなどの蛍光高分子粒子、蛍光ガラスビーズ等の蛍光ガラス粒子を用いることができる。蛍光粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、又はブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、又は２種以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子粉末があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球、細胞膜片、又はリポソームなどが挙げられる。
　ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、及びポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製は、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合により行うことが好ましい。
　重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水及び水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより製造できる。
　蛍光色素を含有したリポゾ－ムやマイクロカプセル等も蛍光粒子として使用することができる。蛍光発色は、紫外光等を吸収して励起し、基底状態に戻る際に放出されるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、黄緑（励起波長５０５ｎｍ／放出波長５１５ｎｍ、以下同じ）、青（３５０～３５６ｎｍ／４１５～４４０ｎｍ）、赤（５３５～５８０ｎｍ／５７５～６０５ｎｍ）、オレンジ（５４０ｎｍ／５６０ｎｍ）、レッド・オレンジ（５６５ｎｍ／５８０ｎｍ）、クリムゾン（６２５ｎｍ／６４５ｎｍ）、ダークレッド（６６０ｎｍ／６８０ｎｍ）などの蛍光発色が用いられ得る。これらの蛍光を発する蛍光粒子は、例えば、Thermo Fisher社から入手可能であり、同社においてFluoSpheres（登録商標）の商品名で市販されている。
　蛍光粒子の平均粒径は、粒子の材質や測定対象物質を定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、０．００１～１０μｍ（より好ましくは０．００１～１μｍ）の範囲が好ましい。
（平均粒径の測定方法）
　蛍光粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することが可能である。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。
　粒径範囲及び測定の容易さから、本発明においては動的光散乱法を用いることが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ－５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））、ＺＥＴＡ　ＳＩＺＥＲ　Ｎａｎｏ ｓｅｒｉｅｓ（マルバーン社）等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求める。
（蛍光粒子表面の第一の結合物質）
　第一の結合物質として使用される３種類以上の結合物質は、個々の蛍光ラテックス粒子の表面に吸着させて使用することが好ましい。この態様では、使用する蛍光粒子の一つの蛍光粒子が、上記３種類の結合物質を有することになる。あるいは、上記３種類以上の結合物質のうちの１種（例えば、抗コール酸抗体）を吸着させた蛍光ラテックス粒子と、上記３種類以上の結合物質のうちの別の１種（例えば、抗デオキシコール酸抗体）を吸着させた蛍光ラテックス粒子と、上記３種類以上の結合物質のうちのさらに別の１種（例えば、抗ケノデオキシコール酸抗体）を吸着させた蛍光ラテックス粒子とをそれぞれ作製し、上記３種の蛍光ラテックス粒子の混合物を使用する態様も好ましい。
　本発明では、第一の結合物質として使用される３種類以上の結合物質を、一つの蛍光粒子（個々の蛍光粒子）の表面に吸着させて使用する態様がより好ましい。測定対象物質が、複数の異なる物質の集合体である場合には、それぞれの異なる物質が結合する結合物質をすべて有する蛍光粒子を使用することが好ましい。本発明の一態様として、測定対象物質が胆汁酸である場合には、抗コール酸抗体、抗デオキシコール酸抗体、及び抗ケノデオキシコール酸抗体の全てを有する蛍光粒子を使用することができる。上記の構成とすることによって、全ての蛍光粒子が、生体試料中に存在する異なる物質から構成される測定対象物質すべてと相互作用することが可能となる。従って、各々の蛍光粒子には、少なくとも３種の結合物質を結合させることが好ましい。
（第一の結合物質による蛍光粒子の修飾）
　第一の結合物質を蛍光粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００－２０６１１５号公報やThermo Fisher社FluoSpheres（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤としては、公知の物質、例えば、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
　抗体を粒子に固定化する具体的な方法を、以下に例示する。粒子の固形分濃度が０．１～１０質量％になるよう分散させた液に、０．０１～２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した抗体溶液を添加して、混合する。温度４～５０℃の条件下で５分間～４８時間撹拌を継続する。次いで遠心分離その他の方法により粒子と溶液を分離して、溶液に含まれている、粒子に結合しなかった抗体を十分に除去する。その後、粒子を緩衝液にて洗浄する操作を０～１０回繰り返す。粒子と抗体とを混合して、粒子に抗体を結合させる操作を実施した後に、抗原抗体反応に関与しない成分、好ましくはタンパク質、より好ましくはＢＳＡ、ブロックエース（登録商標）、スキムミルク及びカゼインなどのブロッキング剤を使用して粒子表面の抗体が結合していない部分を保護することが望ましい。
　抗原や抗体等を粒子に固定化する際に、安定化剤を必要に応じて添加可能である。安定化剤とは、ショ糖や多糖類などの合成高分子あるいは天然高分子など、抗原や抗体を安定化するものであれば特に制限されず、Immunoassay Stabilizer（Advanced Biotechnologies Inc （ABI社））などの市販の安定化剤も使用可能である。
　第一の結合物質を有する蛍光粒子は本発明のキットに含まれており、キットの一部である容器、たとえばカップに含まれている態様が好ましい。この場合、生体試料を、蛍光粒子を含む容器に注入して混合、攪拌することにより、生体試料中の測定対象物質と第一の結合物質とを結合させることができる。
（基板）
　本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、又は白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜表面となる。上記の金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であることが好ましい。
　金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、又は無電解めっき法等によって行うことができるが、基板材質と金属膜との混合層を設けて、金属膜の密着性を良くするためには、スパッタ法により金属膜を作製することが好ましい。この場合、基板材質と金属膜との混合層の厚さは十分な密着性が確保できれば特に制限はないが、１０ｎｍ以下が好ましい。
　金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板の材質としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、又はシクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
　ＳＰＦ検出のための基板の好ましい態様としては、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)に金膜を蒸着した基板などを挙げることができる。
　基板は、測定対象物質又は第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えている。
（第二の結合物質）
　第二の結合物質は、測定対象物質と結合性を有する物質であるか、又は第一の結合物質と結合性を有する物質である。定量をサンドイッチアッセイ法で行う場合には、第二の結合物質として、測定対象物質と結合性を有する物質を使用することができる。定量を競合法で行う場合には、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することができる。本発明においては、定量を競合法で行うことが好ましく、第二の結合物質として、第一の結合物質と結合性を有する物質を使用することが好ましい。
　第二の結合物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、又はこれらの複合体が挙げられるが、好ましくは、抗原であり、第二の結合物質として、測定対象物質（これは、第一の結合物質と結合性を有する物質である）を使用することが特に好ましい。
　第二の結合物質として測定対象物質を使用する場合には、第二の結合物質が、測定対象物質である少なくとも３種類の異なる構造の物質、又は上記３種類の異なる構造の物質とキャリアとの結合体であることが好ましい。キャリアとは、上記少なくとも３種類の測定対象物質の複数の分子が結合可能な物質を意味する。ここで、好ましい第二の結合物質としては、同種の測定対象物質の複数の分子が、一分子のキャリアに結合した少なくとも３種類の結合体を含む態様である。好ましいキャリアの一例としては、タンパク質などが挙げられ、その中でも具体的には、ウシ血清アルブミンを挙げることができる。
　測定対象物質が胆汁酸である場合、第二の結合物質は、コール酸及び／又はコール酸・アルブミン結合体、デオキシコール酸及び／又はデオキシコール酸・アルブミン結合体、並びにケノデオキシコール酸及び／又はケノデオキシコール酸・アルブミン結合体を含むことが好ましい。あるいは、上記の態様において、コール酸にコール酸抱合体を含む態様、コール酸をコール酸抱合体で置換した態様、デオキシコール酸にデオキシコール酸抱合体を含む態様、デオキシコール酸をデオキシコール酸抱合体で置換した態様、ケノデオキシコール酸にケノデオキシコール酸抱合体を含む態様、あるいはケノデオキシコール酸をケノデオキシコール酸抱合体で置換した態様、とすることも好ましい。特に、コール酸及び／又はコール酸・アルブミン結合体、デオキシコール酸及び／又はデオキシコール酸・アルブミン結合体、並びにケノデオキシコール酸及び／又はケノデオキシコール酸・アルブミン結合体を含むことが好ましい。
（第二の結合物質を基板に固定化する方法）
　第二の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ　Ｎｏｔｅｓ　Ｖｏｌ．２－１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Self-Assembled Monolayer）などを配することによる表面修飾を施しても良く、第二の結合物質を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、及び共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。第二の結合物質を基板に固定させた後に、第二の結合物質が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（検出領域＜テストエリア＞）
　本発明は、基板上に生体試料中の測定対象物質の有無を検出するテストエリアを設けることができる。このテストエリアでは、例えば測定対象物質である抗原を捕まえて、抗原に結合した標識の量を検出し定量することで、抗原を定量することが可能となる。あるいは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原の結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。この検出方法は競合法と呼ばれているが、ここでは、競合法に関する基板について説明する。
　基板のテストエリアには、蛍光粒子上に存在する３種類以上の結合物質（例えば抗体）すべてと反応するサイトを有することが好ましい。本発明の好ましい一態様としては、生体試料中に存在する３種類以上の抗原を、基板のテストエリア上に有する態様が好ましい。この場合、抗原とＢＳＡを縮合剤の存在下で反応させて、抗原・ＢＳＡ結合体を作製し、この結合体をテストエリア上に吸着させることでテストエリアを作製することが可能となる。従って、テストエリア上には、３種類以上の抗原と結合したＢＳＡ結合体が、一つのエリアに共存する態様となる。この場合、テストエリア上には、３種類の抗原・ＢＳＡ結合体をランダムに混合した状態で配置されていることが好ましい。抗原・ＢＳＡ結合体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板上のテストエリアに結合させることが可能である。
（参照領域＜コントロールエリア＞）
　本発明では、測定環境、特に測定温度の影響を極力抑えるために、基板上にコントロールエリアを有し、テストエリアの情報を、コントロールエリアの情報で規格化することによって、環境依存性を非常に低く抑えることが可能となる。コントロールエリアとしては、使用する生体試料の中に存在する測定対象物質の量に依存せず、すべての標識と結合することが可能なように設計されていることが好ましい。標識である蛍光粒子上に存在する３種類以上の抗体すべてに相互作用する抗体を有することが好ましい。このように設計することによって、テストエリアの情報をコントロールエリアの情報で規格化することにより、例えば、低温環境で、生体試料の流れや、反応速度が影響を受けた場合でも、規格化によってその影響をキャンセルして、常に精度よく、測定環境に影響されない結果を得ることが可能になる。
　コントロールエリアに存在させる好ましい抗体としては、蛍光粒子上に存在する３種類以上の結合物質（例えば、抗体）を認識する機能をもち、その抗体がマウス由来であれば、抗マウス抗体であることが好ましく、蛍光粒子上の抗体が、ヤギ由来であれば、抗ヤギ抗体であることが好ましい。これらコントロールエリア上の抗体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板に結合させることが可能である。
（非特異吸着防止物質）
　本発明の試薬キットは、好ましくは、さらに、測定対象物質と特異的な結合性を有しない物質、あるいは結合物質により蛍光粒子を修飾することが好ましい。例えば、競合法において、測定対象物質を含まない陰性となる生体試料だけでなく、測定対象物質を含む陽性となる生体試料に対しても反応して陰性となる生体試料が存在しており、高値乖離の問題の解決が課題として認識されている。このような擬陰性を示す原因は明確にはなっていないが、抗体に覆われていない蛍光粒子表面と、検出領域（テストエリア）との非特異的な相互作用により、本来結合してほしくない蛍光粒子が存在することが原因の一つではないかと考えられている。また、テストエリア上に存在する物質と同じ物質が蛍光粒子表面上に存在する場合にも、遊離した抗体などが生体試料中に存在する場合には、その抗体が、テストエリア上に存在する物質と、蛍光粒子表面上の物質のどちらにも結合することで、測定対象物質を含む陽性となる生体試料を測定した場合においても陰性として検出される場合がある。一般的に、固相表面（例えば蛍光粒子表面、基板の金膜表面）、への非特異吸着抑制のためにＢＳＡでのブロッキングが用いられているが、ある特定の生体試料中にＢＳＡに反応する抗ＢＳＡ抗体が存在する場合には、蛍光粒子上のＢＳＡと基板上のＢＳＡとの間で架橋するように反応し、高値乖離を起こす場合がある。従って、好ましい結合物質としては、測定対象物質（例えば胆汁酸）と特異的な結合性を有さない物質であって、上記のような擬陰性を示す原因物質に結合しない物質を使用することが好ましい。結合物質としては、胆汁酸と結合性を有しない抗体、あるいはテストエリアに使用しないタンパク質（Protein A、Protein G）などを使用することができるが、その中で胆汁酸と結合性を有しない抗体が好ましい。具体的には、胆汁酸とは異なる抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その測定対象物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることが可能である。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。本発明では、結合物質として、特に抗ＣＲＰ（C反応性蛋白）抗体を使用する態様が好ましい。
（抗体）
　本発明において、抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナル又はモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
（測定方法）
　本発明によれば、生体試料、及び測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子を、測定対象物質又は第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えた基板に接触させ、次いで検出領域上の第二の結合物質に結合した蛍光粒子に起因する蛍光を測定することによって、生体試料中の測定対象物質を定量することができる。
　本発明における定量は、測定対象物質（例えば、胆汁酸）の量の測定である限り、最も広い概念として解釈される。測定方法の具体的な実施態様としては、競合法及びサンドイッチ法が挙げられるが、競合法が好ましい。
　競合法の一例として、胆汁酸を定量する場合を以下に説明する。胆汁酸以外の物質を定量する場合も、同様に実施することができる。
　競合法では、先ず、胆汁酸／アルブミン比が７以上１４以下である胆汁酸・アルブミン結合体が固定化されている胆汁酸免疫測定用基板に、胆汁酸を含む生体試料及び抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子を接触させる。その生体試料中に胆汁酸が存在しない場合には、抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子と、基板上の胆汁酸（即ち、胆汁酸・アルブミン結合体中の胆汁酸）とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中に胆汁酸が存在する場合には、生体試料中の胆汁酸と抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子との間で抗原抗体反応が起こり、抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子と、基板上の胆汁酸（即ち、胆汁酸・アルブミン結合体中の胆汁酸）との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、上記の基板上のアルブミンに結合しなかった抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子を除去する。次いで基板上の免疫複合体（即ち、抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子と、基板上の胆汁酸・アルブミン結合体中の胆汁酸との複合体）の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、生体試料中の胆汁酸の濃度などを測定することができる。
　競合法における蛍光の測定形態は、プレートリーダー測定、あるいはフロー測定のいずれかの測定を採用することが可能であり、例えば、以下の方法により測定することができる。予め、胆汁酸濃度が異なる胆汁酸量既知の試料を複数用意し、この試料及び抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子を予め混合する。この混合液を、胆汁酸・アルブミン結合体が固定化されている領域に接触させる。胆汁酸・アルブミン結合体が固定化されている領域からの蛍光信号を、特定の時間間隔で混合液が結合体に接触している間、複数の蛍光信号として測定する。この複数の蛍光信号から、各胆汁酸濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、胆汁酸濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する胆汁酸濃度の関係式を取得する。このように取得した関係式に基づき、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を用いて、生体試料に含まれる胆汁酸量を定量することができる。
　この胆汁酸量の定量は、短時間で行うことが好ましい。具体的には、１０分以内に行われることが好ましく、８分以内がより好ましく、更には６分以内で行われることが好ましい。この定量時間には、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて予め取得した蛍光量の時間変化量と胆汁酸濃度との関係式を利用して、試料及び抗胆汁酸抗体標識蛍光粒子を、胆汁酸・アルブミン結合体が固定化されている検出領域に接触させてから、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を基に生体試料に含まれる胆汁酸量を換算する時間が含まれることが好ましい。
　サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により測定対象物質を測定することができる。測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子とを、基板上で接触させる。生体試料に測定対象物質が存在する場合には、測定対象物質と蛍光粒子と基板との間で結合反応（抗原抗体反応など）が生じる。その結果、生体試料中に測定対象物質が存在する場合には、基板に結合した第二の結合物質と、測定対象物質と、第一の結合物質を有する蛍光粒子とからなる免疫複合体が形成される。サンドイッチ法では、第二の結合物質と、測定対象物質と、第一の結合物質を有する蛍光粒子との反応が終了した後、上記免疫複合体を形成しなかった、第一の結合物質を有する蛍光粒子を除去し、洗浄する。次いで免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、測定対象物質の濃度などを測定することができる。なお、蛍光強度と測定対象物質の濃度は、正の相関関係がある。
（流路）
　本発明の好ましい態様においては、測定対象物質を含む可能性のある生体試料と、第一の結合物質を有する蛍光粒子とを混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、第一の結合物質を有する蛍光粒子とを、検出領域まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、第一の結合物質を有する蛍光粒子を含む生体試料液を点着する点着口、検出領域としての金属膜、及び金属膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
（表面プラズモン蛍光測定）
　本発明における蛍光の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
　表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８－２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
　本発明の蛍光粒子を用いた表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、好ましくは、基板上の金属膜上に固定化された測定対象物質の量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を、例えば濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法では、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと生体試料中の抗原が、抗体反応により結合し、凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方式が、ラテックス凝集法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な測定対象物質の検出方法を提供できる。
（キットの他の要素）
　本発明のキットは、測定対象物質（例えば、胆汁酸など）を測定する方法に用いられるものであり、測定対象物質が胆汁酸である場合には、胆汁酸測定診断用のキットである。本発明において、胆汁酸などの測定対象物質の測定を実施するに当たり、胆汁酸・アルブミン結合体などの第二の結合物質を固定した基板と蛍光粒子を保持した部材を含むセンサチップを含むものであるが、表面プラズモン励起装置、及び蛍光測定デバイスなどの、測定対象物質の測定に使用される各種の器材又は装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量の測定対象物質を含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（１）胆汁酸・ウシ血清アルブミン結合体の調製
（１－１）コール酸・ウシ血清アルブミン結合体の調製
　超脱水ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと記す。和光純薬工業（株）社製）１．２ｍＬにコール酸（和光純薬工業（株）社製）５０ｍｇ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳと記す。和光純薬工業（株）社製）６７ｍｇ、及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下、ＥＤＣと記す。和光純薬（株）社製）１１０ｍｇを加えて混合し、コール酸を活性エステル化した。この活性エステル化したコール酸を、アルブミンの１種であるウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す。和光純薬工業（株）社製）３２２ｍｇを溶解したリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと記す。和光純薬工業（株）社製）６５ｍＬの水溶液に滴下し反応させた。反応終了後、反応溶液をアセトニトリル（以下、ＡＣＮと記す。和光純薬工業（株）社製）／水の比率が１／３の溶液１Ｌを用いて透析により精製した。最後に、凍結乾燥し、白色の固体を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（１－２）デオキシコール酸-ＢＳＡ結合体の調製
　超脱水ＤＭＦ１．２ｍＬにデオキシコール酸（和光純薬工業(株)社製）５０ｍｇ、ＮＨＳ　６７ｍｇ、及びＥＤＣ　１１０ｍｇを加えて混合し、デオキシコール酸を活性エステル化した。この活性エステル化したデオキシコール酸を、ＢＳＡ　３２２ ｍｇを溶解したＰＢＳ　６５ｍＬの水溶液に滴下し反応させた。反応終了後、反応溶液をＡＣＮ／水の比率が１／３の溶液　１Ｌを用いて透析により精製した。最後に、凍結乾燥し、白色の固体を得た。
（１－３）ケノデオキシコール酸-ＢＳＡ結合体の調製
　超脱水ＤＭＦ１．２ｍＬにケノデオキシコール酸（和光純薬工業(株)社製）５０ｍｇ、ＮＨＳ　６７ｍｇ、及びＥＤＣ　１１０ｍｇを加えて混合し、ケノデオキシコール酸を活性エステル化した。この活性エステル化したケノデオキシコール酸を、ＢＳＡ　３２２ ｍｇを溶解したＰＢＳ　６５ｍＬの水溶液に滴下し反応させた。反応終了後、反応溶液をＡＣＮ／水の比率が１／３の溶液　１Ｌを用いて透析により精製した。最後に、凍結乾燥し、白色の固体を得た。
（２）ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）による胆汁酸／ＢＳＡ標識モル比（結合体の胆汁酸／アルブミン比）の測定
（測定手順）
　（１－１）から（１－３）で調製した結合体を０．１質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：ＡＣＮの比率が２／１の溶液に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。この溶液１μＬと、マトリックス（ＳＡ；シナピン酸（和光純薬工業(株)社製））４μＬとを混合し、金プレート上に１μＬとして４点を点着した。自然乾燥した後に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ装置（Applied Bio Systems社品 Voyager）に金プレートを挿入し、１スポットごとに積算９００ショットを行い質量情報となるデータを取得（Ｎ＝４）した。このデータを用いて、胆汁酸・ＢＳＡ結合体に対応するピークの、ピーク強度の最大の値の５０％強度での分子量中心値をＢＳＡ結合体のピークとして採用し、このピーク値から垂直に降ろした位置を胆汁酸・ＢＳＡ結合体の分子量と見なして、Ｎ＝４の平均値を取り、（胆汁酸・ＢＳＡ結合体の分子量－ｎａtｉｖｅ ＢＳＡの分子量）/胆汁酸の分子量（例えば、コール酸の場合４０８－１８＝３９０）でＢＳＡに対する胆汁酸の結合数を計算した。得られた結合体の胆汁酸／ＢＳＡ比を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（３）コール酸に対する抗体、デオキシコール酸に対する抗体、又はケノデオキシコール酸に対する抗体を産生するハイブリドーマの作製、並びに抗体産生
（３－１）免疫原
　上記で作製したコール酸－ＢＳＡ結合体、デオキシコール酸－ＢＳＡ結合体及びケノデオキシコール酸－ＢＳＡ結合体の各々２ｍｇずつを、マウス免疫感作の免疫原として使用した。
（３－２）ハイブリドーマの調製
　マウス免疫感作の免疫原として、コール酸－ＢＳＡ結合体を使用した。
　初回の免疫を１００μg/匹の量とし、２回目以降の免疫を５０μg/匹の量とし、コール酸－ＢＳＡ結合体を、マウス背部皮下に投与して免疫を行った。免疫においては、完全アジュバント（ＦＣＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＦＩＡ）と混合したエマルジョンを投与した。２週間隔で４回免疫を行った。別途、３回目、４回目の免疫の翌週に採血を行い、採血清１００μＬを用いてＥＬＩＳＡ測定にて抗体価の測定を行った。抗体価が目的の値であることを確認し、４回目の免疫から２週間後の免疫を最終免疫として、抗原である結合体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、和光純薬工業（株）社製、ｐＨ７．１～７．３）１ｍＬで希釈溶解し、マウスの腹腔内に投与する形で行った。投与の３日後にマウスの脾臓を摘出した。
　マウスより摘出した脾臓細胞と変異株骨髄腫細胞（ミエローマ：Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１）を、７：１の細胞数の割合で混合した後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加し、遠心分離後に培地（ＲＰＭＩ－１６４０（ロズウェルパーク記念研究所培地：Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ）＋１０質量％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ））に浮遊させた。この浮遊した脾臓細胞を、細胞数として１．０×１０ｅｘｐ５（ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）となるように、９６ｗｅｌｌプレートに播種した。翌日、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地）を添加し、増殖したハイブリドーマの培養上清を抗体測定系のＥＬＩＳＡでスクリーニングを行った。測定用抗原であるコール酸－ＢＳＡ結合体を５００ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡのカップに添加して静置して、カップの底に測定用抗原を固定化し、上澄み液を除去する。測定対象となる脾臓細胞が産生した抗体に対する二次抗体として抗マウスＩｇＧ　ＨＲＰ標識抗体を用いた。ＩｇＧはイムノグロブリンＧを示し、ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシダーゼを示す。ＥＬＩＳＡの結果から陽性であったウェルを２４ウェルプレートを用いて培養し、培養上清を各１ｍＬ採取した。再度、同じ抗体測定系のＥＬＩＳＡで二次スクリーニングを行った。細胞融合時の同一ウェル中で、ＥＬＩＳＡシグナルの高い上位の６ウェルを選択してバイアル瓶に入れた。
　それぞれのバイアル中の細胞を、１０質量％のＦＢＳを含む基礎培地ＲＰＭＩ１６４０を用いて限界希釈して希釈物を調製した。６個の９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに希釈物１滴ずつピペットで添加した。それぞれのウェルを顕微鏡で観察し、それぞれのウェル中の細胞がシングルセルであることを確認した。３週間培養した後、上記と同様にして、増殖したハイブリドーマの培養上清を抗体測定系のＥＬＩＳＡでスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡシグナルの高い上位の１０ウェルを選択し、ハイブリドーマの調製を終了した。得られた抗体のサブクラスの決定は、Isotyping kit（ロッシュ社製）を用いた。
（３－３）マウス腹水法による抗体の産生
　選択した１０ウェルの細胞を、さらに同様にＥＬＩＳＡスクリーニングを行って、シグナルの高かった上位１ウェルの細胞についてマウス腹水法（マウス２匹を使用）により抗体を作製した。得られた抗体を、抗コール酸抗体-1と称する。
（３－４）デオキシコール酸に対する抗体、及びケノデオキシコール酸に対する抗体の調製
　デオキシコール酸に対する抗体、及びケノデオキシコール酸に対する抗体の調製も、上記と同様に行った。得られた抗体をそれぞれ、抗デオキシコール酸抗体-1及び抗ケノデオキシコール酸抗体-1と称する。
（３－５）抗体のサブクラスと抗体産生量
　上記で調製した抗体のサブクラスと抗体産生量を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（４）抗マウス抗体の作製
　マウス由来のグロブリン（LAMPIRE Biological Laboratories社製,カタログ番号7404302,Mouse Gamma Globulin Salt Fractionation, 500mg）を準備し、完全アジュバント（ＦＣＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＦＩＡ）と混合したエマルジョンを投与する方法で、ヤギへ免疫感作（皮下免疫）を２週間隔で４回免疫を行った。その後、ＥＬＩＳＡ測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、Protein Aカラム（Thermo scientific社製　Pierce ProteinA Columns, カタログ番号20356）により精製し、目的の抗マウス抗体を取得した。
（５）抗ＣＲＰ抗体の作製
　市販のヒトＣＲＰ（北山ラベス（株）社製）を準備し、完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合したエマルジョンを初回投与し、２～４回目の免疫には不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合したエマルジョンを投与する方法で、マウスへ免疫感作（皮下免疫）を２週間隔で４回免疫を行った。その後、ＥＬＩＳＡ測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、ProteinAカラム（Thermo scientific社製　Pierce ProteinA Columns, カタログ番号20356）により精製し、目的の抗ＣＲＰ抗体-1を取得した。
（６）抗胆汁酸抗体で標識した蛍光粒子の調製
（６－１）３種の抗胆汁酸抗体を吸着させた蛍光粒子１の調製
　３種の抗胆汁酸抗体で標識した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）３５７μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ６．０）２８２μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗コール酸抗体-1 （上記で作製したもの）５．３μＬ、５ｍｇ／ｍＬの抗デオキシコール酸抗体-1（上記で作製したもの）５．３μＬと、５ｍｇ／ｍＬの抗ケノデオキシコール酸抗体－１（上記で作製したもの）６．９μＬ、及び、５ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰ抗体-1（ダミー）（上記で作製したもの）７５．５μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液７．５μＬを加え、室温で１．５時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液３７．５μＬを添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。ｒｐｍは回毎分(revolution per minute)を示し、１ｒｐｍ＝１min-1 である。その後、上清を取り除き、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、３種の抗胆汁酸抗体と抗ＣＲＰ抗体が結合した蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
（６－２）抗コール酸抗体のみを吸着させた蛍光粒子２の調製
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）３５７μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）２８２μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗コール酸モノクローナル抗体-1（上記で作製したもの）２０１μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液７．５μＬを加え、室温で１．５時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液３７．５μＬを添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後、上清を取り除き、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗コール酸抗体１種を結合させた蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
（６－３）抗デオキシコール酸抗体のみを吸着させた蛍光粒子３の調製
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）３５７μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）２８２μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗デオキシコール酸モノクローナル抗体-1（上記で作製したもの）２０１μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液７．５μＬを加え、室温で１．５時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液３７．５μＬを添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗デオキシコール酸抗体１種を結合させた蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
（６－４）抗ケノデオキシコール酸抗体のみを吸着させた蛍光粒子４の調製
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、平均粒径２００ｎｍ）３５７μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）２８２μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗ケノデオキシコール酸モノクローナル抗体（上記で作製したもの）２０１μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ水溶液７．５μＬを加え、室温で１．５時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液３７．５μＬを添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後、上清を取り除き、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）７５０μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗ケノデオキシコール酸抗体１種を結合させた蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
（７）基板の作製
　ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の基体（三菱レイヨン（株）社製、アクリペット（登録商標）ＶＨ）を用意した。マグネトロンスパッタ法により、検出領域と参照領域の２箇所に、それぞれ厚さ４５ｎｍの金膜を片面に幅４ｍｍ、長さ３ｍｍとなるように作製し、これを、基板を構成するためのチップとして使用した。このチップの検出領域の金膜面上に、結合体１、結合体２及び結合体３を含有比率（質量比で１：１：１）で含む液（濃度：５０μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ緩衝液　ｐＨ６，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を点着し、乾燥させ、３種の結合体を固定化した基板１を複数作製した。また、それぞれの基板の参照領域には、（４）で作製した抗マウス抗体を含む液（濃度：５０μｇ／ｍＬ　ｉｎ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ緩衝液　ｐＨ６，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）を点着して、乾燥させた。
　このように調製した３種類の複数の基板をセンサチップの流路として使用する前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４））３００μＬを用いて３回繰り返し洗浄した。
（８）流路型センサチップの作製
　特開２０１０－１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、流路型センサチップを作製した。その概略図を図１、図２に示した。図１は、センサチップ１の概略図であり、図２は、センサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３及び基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５及び第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５及び第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８及び参照領域９が形成されている。
（９）大型機（既存の胆汁酸測定試薬）での測定
　免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機である日立自動分析装置7170により、取り扱い説明書に従い、胆汁酸の量が既知である試料の測定を行い、胆汁酸の測定値を得た。
（１０）蛍光粒子を用いた胆汁酸の免疫測定
　（９）で測定した胆汁酸の量が既知である試料を、（６－１）で調製した３種の胆汁酸抗体を吸着させた蛍光粒子１を含むカップにおいて予め１０分間攪拌しながら混合した。次に、（７）で作製した基板１を封入した流路型センサチップにそれぞれ点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液を１０μＬ／分の速度で流下させ、胆汁酸・ＢＳＡ結合体を固定した金膜面上に接触させてから１．５分間継続して蛍光強度を測定した。各基板において得られた検出領域と参照領域のそれぞれの蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求め、検出領域のシグナル値を参照領域のシグナル値で除することで規格化を行った。また、胆汁酸濃度０の試料を用意して同様にして蛍光シグナル値の規格化を行い、胆汁酸を含まない試料からのシグナル値の規格化を行った。
（１１）検量線の作成
　（１０）で求めた、胆汁酸の量が既知である試料の規格化した蛍光シグナル値と、（９）で求めた大型機での測定値を対応つけることで、（１－１）から（１－３）で調製した、胆汁酸・ＢＳＡ結合体－１～３を用いた基板に対して、それぞれ検量線を作成した。
（１２）胆汁酸の量が未知である試料の測定結果
　北山ラベス（株）からイヌの血清１～４を入手し、表３に示すような蛍光粒子と基板の組み合わせでそれぞれ実験を行い、（１１）で作成した検量線を使用して胆汁酸の測定値を得た。また、上記血清１～４について、大型機を用いて胆汁酸の測定値を求めた。
　大型機の測定値を基準にして、その値からどれだけ測定値が乖離したかを以下の計算式で計算し、結果を表３にまとめた。
大型機との乖離幅％の計算式
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表３の結果から、蛍光粒子が、３種の異なる抗体が混合して存在する蛍光粒子である場合、測定対象物質である胆汁酸を正確に測定可能なことがわかり、本発明の効果が確認された。
　１　センサチップ
　２　上部部材
　３　中間部材
　４　基板
　５　第一の容器
　６　第二の容器
　７　容器群
　８　検出領域
　９　参照領域
　１０　流路

Claims (7)

  1. 測定対象物質と結合性を有する第一の結合物質を有する蛍光粒子；及び
    前記測定対象物質又は前記第一の結合物質の何れかと結合性を有する第二の結合物質を有する検出領域を備えた基板：
    を含む、生体試料中の測定対象物質を定量するためのキットであって、
    前記測定対象物質が、少なくとも３種類の異なる構造の物質を含み、
    前記第一の結合物質が、前記少なくとも３種類の異なる構造の物質の各々に対して結合性を有する、少なくとも３種類の結合物質を含む、
    測定対象物質を定量するためのキット。
  2. 前記蛍光粒子の個々の蛍光粒子が、前記少なくとも３種類の結合物質を有している、請求項１に記載のキット。
  3. 前記第二の結合物質が、前記少なくとも３種類の異なる構造の物質、又は前記３種類の異なる構造の物質とキャリアとの結合体である、請求項１又は２に記載のキット。
  4. 前記第一の結合物質が、コール酸抗体、デオキシコール酸抗体、及びケノデオキシコール酸抗体を含む、請求項１から３の何れか一項に記載のキット。
  5. 前記第二の結合物質が、コール酸及び／又はコール酸・アルブミン結合体、デオキシコール酸及び／又はデオキシコール酸・アルブミン結合体、並びにケノデオキシコール酸及び／又はケノデオキシコール酸・アルブミン結合体を含む、請求項１から４の何れか一項に記載のキット。
  6. 前記蛍光粒子が、蛍光ラテックス粒子である、請求項１から５の何れか一項に記載のキット。
  7. 前記検出領域が金膜表面である、請求項１から６の何れか一項に記載のキット。
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