JPH08145995A - Ｅｌｉｓａによる血清中胆汁酸類の測定法および肝疾患診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 ＥＬＩＳＡによる血清中胆汁酸類の測定法お
よび肝疾患の診断方法を提供する。 【構成】 胆汁酸の活性エステルを製造し、牛血清アル
ブミン溶液と反応させ、透析し、透析された物を抗原と
してヒト以外の哺乳動物を免疫することにより抗胆汁酸
抗体を作製し、活性エステルを酵素と反応させて酵素標
識胆汁酸を酵素標識抗原として作成し、第二抗体固相化
プレートに測定対象の血清の希釈液と抗胆汁酸抗体液、
酵素標識抗原液を加えて反応させ、さらに基質を加えて
反応させ、吸光度の測定を行ない、同時測定の標準曲線
よりそれぞれの胆汁酸の濃度を求め、およびこれらの酸
の測定値の総和を総胆汁酸濃度とするＥＬＩＳＡによる
血清中胆汁酸の測定法。これらの酸の測定値の総和を総
胆汁酸濃度とし、各胆汁酸の濃度比を算出し、得られた
濃度比を健常者について設定した該濃度比の基準範囲と
比較し肝疾患の診断を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙ
ｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａ
ｓｓａｙ）による血清中胆汁酸類の測定法および該測定
結果に基づいて肝疾患を診断する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】胆汁酸は胆汁の主成分の一つである。肝
細胞においてアセチル−ｃｏＡ（ｃｏｅｍｚｙｍｅ
Ａ）からコレステロールが生成され、さらに一次胆汁酸
（コール酸（ＣＡ）およびケノデオキシコール酸（ＣＤ
ＣＡ））ができる。グリシンあるいはタウリンと抱合し
た一次胆汁酸は腸管内において腸内細菌により７αの脱
水酸化をうけ、二次胆汁酸（デオキシコール酸（ＤＣ
Ａ）およびリトコール酸（ＬＣＡ））が生成される。こ
の時ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）もできる。

【０００３】胆汁酸は腸管内で脂溶性物質の吸収を助け
たのち、そのほとんどが回腸末端から再吸収され門脈を
経て肝臓に戻る閉鎖的な腸肝循環を繰り返している。胆
汁酸の体内プールは約３〜５ｇであり、そのほとんどは
胆のうと腸に存在する。ごく微量の胆汁酸が腸肝循環を
逸脱して血液大循環に洩れ、健常者の早朝空腹時で末梢
血中に約２μｇ／ｍｌほどの微量濃度として存在してい
る。また、血中胆汁酸濃度は食事に伴う日内変動が存在
し早朝空腹時がもっとも低く、朝、昼、夕の食後にそれ
ぞれ上昇する。就寝時に減少して早朝空腹時値にもど
る。

【０００４】胆汁酸と消化器疾患との研究報告では大腸
癌と糞便中胆汁酸（下記文献一覧表の文献１）ー２）参
照）や血中胆汁酸と肝疾患（該一覧表の文献３）参照）
などが多く占めている。特に肝疾患については血清中胆
汁酸が微量にしか存在しないことからＧＬＣ（気ー液ク
ロマトグラフィー）（該一覧表の文献４）参照）やＨＰ
ＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）（該一覧表の文献
５）参照）などの機器分析法が多く用いられて測定され
ている。いずれも分析操作が煩雑で高度な知識と技術を
必要としている。

【０００５】また、一方３α−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤ）を用いた血清胆汁酸の
酵素による測定法が報告（該一覧表の文献６）参照）さ
れ、近年では重要な肝機能検査として日常的に実施され
るようになったが、測定対象は総胆汁酸である。

【０００６】

【発明が解決すべき課題】上述のように、従来は、胆汁
酸によって消化器疾患を調べるには、機器分析法が多く
用いられて測定され、いずれも分析操作が煩雑で高度な
知識と技術を必要としている上、血清胆汁酸の酵素によ
る測定法の測定対象は総胆汁酸である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、下
記のような工程からなる、簡便で多数検査処理可能な血
清胆汁酸分画測定のＥＬＩＳＡ法を確立した：胆汁酸の
活性エステルを製造し、牛血清アルブミン溶液と反応さ
せ、透析し、上記透析された物を抗原としてヒト以外の
哺乳動物を免疫することにより抗胆汁酸抗体を作製し；
上記活性エステルを酵素と反応させて酵素標識胆汁酸を
酵素標識抗原として作成し；第二抗体固相化プレートに
測定対象の血清の希釈液と抗胆汁酸抗体液、酵素標識抗
原液を加えて反応させ、さらに基質を加えて反応させ；
該反応物の吸光度の測定を行ない、同時測定の標準曲線
よりそれぞれの胆汁酸の濃度を求め；およびこれらの酸
の測定値の総和を総胆汁酸濃度とする。

【０００８】本発明の上記測定方法を使用して、健常者
を対象にコール酸，ケノデオキシコール酸，デオキシコ
ール酸およびウルソコール酸（ＣＡ，ＣＤＣＡ，ＤＣＡ
およびＵＤＣＡ）の濃度を測定後ＣＡ／ＣＤＣＡ比，Ｃ
ＤＣＡ／ＤＣＡ比，ＣＡ／ＤＣＡ比とＣＡ＋ＣＤＣＡ／
ＤＣＡ比，ＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ＋ＵＤＣＡ比を求
め、それぞれの基準範囲を設定した。

【０００９】本発明者らは、このような基準範囲を参照
すれば、肝疾患の診断を行うことができることを見い出
し、次のような肝疾患の診断方法を創出した：胆汁酸の
活性エステルを製造し、牛血清アルブミン溶液と反応さ
せ、透析し、上記透析された物を抗原としてヒト以外の
哺乳動物を免疫することにより抗胆汁酸抗体を作製し；
上記活性エステルを酵素と反応させて酵素標識胆汁酸を
酵素標識抗原として作成し；第二抗体固相化プレートに
測定対象の血清の希釈液と抗胆汁酸抗体液、酵素標識抗
原液を加えて反応させ、さらに基質を加えて反応させ；
該反応物の吸光度の測定を行ない、同時測定の標準曲線
よりそれぞれの胆汁酸の濃度を求め；これらの酸の測定
値の総和を総胆汁酸濃度とし、各胆汁酸の濃度比を算出
し；および得られた濃度比を健常者について設定した該
濃度比の基準範囲と比較する。

【００１０】本発明の方法により、急性肝炎（ＡＨ），
慢性肝炎（ＣＨ），肝硬変（ＬＣ）と肝細胞性癌（ＨＣ
Ｃ）などの肝疾患患者を対象に血清中の胆汁酸濃度を測
定後、健常者と同様に各成分の濃度比を求め、得られた
濃度比を健常者について設定した基準範囲と比較し、そ
れぞれの病態との関係を検討し新らしい知見結果を得
た。詳細は以下の実施例に述べる。

【００１１】

【実施例】抗コール酸，抗ケノデオキシコール酸，抗デオキシコー
ル酸，抗ウルソデオキシコール酸の抗血清の作製： 抗ケノデオキシコール酸ー２４−牛血清アルブミンーウ
サギ血清 ： （ａ）ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）（４０ｍｇ）
をジオキサン１．０ｍｌで溶かし、Ｎ−ヒドロキシコハ
ク酸イミド２３ｍｇと１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３８ｍｇを加え
３時間反応させる。

【００１２】（ｂ）この反応液に酢酸エチル４ｍｌと水
４ｍｌを加え胆汁酸を抽出する。水層を除去後酢酸エチ
ル層を酢酸ナトリウムで脱水し、蒸発乾固させて、ケノ
デオキシコール酸活性エステルを得た。

【００１３】（ｃ）次に、乾固物であるケノデオキシコ
ール酸活性エステルを１．０ｍｌのジメチルホルムアミ
ドに溶解後、２５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン溶液（Ｂ
ＳＡ）１０ｍｌにゆっくりと加え１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ
７．０に調整した。

【００１４】（ｄ）３０分間放置し、さらに水に対して
一昼夜透析後、抗原（ＣＤＣＡ活性エステル）を生成す
る。

【００１５】（ｅ）得られた抗原を１回当り１ｍｇをウ
サギに４ケ月にわたり授与して免疫した。ウサギ体内で
抗ケノデオキシコール酸を産生させ、これを採取して抗
ケノデオキシコール酸ー２４−牛血清アルブミンーウサ
ギ血清（以下ＣＤＣＡ抗体）を得た。ＣＤＣＡ抗体を
８，０００倍希釈したものを測定に使用した。

【００１６】抗デオキシコール酸ー２４−牛血清アルブ
ミンーウサギ血清： （ａ）デオキシコール酸（ＤＣＡ）（４０ｍｇ）をジオ
キサン１．０ｍｌで溶かし、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イ
ミド２３ｍｇと１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩３８ｍｇを加え３時間
反応させる。

【００１７】（ｂ）この反応液に酢酸エチル４ｍｌと水
４ｍｌを加え胆汁酸を抽出する。水層を除去後酢酸エチ
ル層を酢酸ナトリウムで脱水し、蒸発乾固させて、デオ
キシコール酸活性エステルを得た。

【００１８】（ｃ）次に、乾固物であるデオキシコール
酸活性エステルを１．０ｍｌのジメチルホルムアミドに
溶解後、２５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン溶液（ＢＳ
Ａ）１０ｍｌにゆっくりと加え１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ
７．０に調整した。

【００１９】（ｄ）３０分間放置し、さらに水に対して
一昼夜透析後、抗原（ＤＣＡ活性エステル）を生成す
る。

【００２０】（ｅ）得られた抗原を１回当り１ｍｇをウ
サギに４ケ月にわたり授与して免疫した。ウサギ体内で
抗デオキシコール酸を産生させ、これを採取して抗デオ
キシコール酸ー２４−牛血清アルブミンーウサギ血清
（以下ＤＣＡ抗体）を得た。ＤＣＡ抗体を２０，０００
倍希釈したものを測定に使用した。

【００２１】抗ウルソデオキシコール酸ー２４−牛血清
アルブミンーウサギ血清： （ａ）ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）（４０ｍ
ｇ）をジオキサン１．０ｍｌで溶かし、Ｎ−ヒドロキシ
コハク酸イミド２３ｍｇと１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３８ｍｇを
加え３時間反応させる。

【００２２】（ｂ）この反応液に酢酸エチル４ｍｌと水
４ｍｌを加え胆汁酸を抽出する。水層を除去後酢酸エチ
ル層を酢酸ナトリウムで脱水し、蒸発乾固させて、ウル
ソデオキシコール酸活性エステルを得た。

【００２３】（ｃ）次に、乾固物であるウルソデオキシ
コール酸活性エステルを１．０ｍｌのジメチルホルムア
ミドに溶解後、２５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン溶液
（ＢＳＡ）１０ｍｌにゆっくりと加え１Ｎ ＮａＯＨで
ｐＨ７．０に調整した。

【００２４】（ｄ）３０分間放置し、さらに水に対して
一昼夜透析後、抗原（ＤＣＡ活性エステル）を生成す
る。

【００２５】（ｅ）得られた抗原を１回当り１ｍｇをウ
サギに４ケ月にわたり授与して免疫した。ウサギ体内で
抗ウルソデオキシコール酸を産生させ、これを採取して
抗ウルソデオキシコール酸ー２４−牛血清アルブミンー
ウサギ血清（以下ＵＤＣＡ抗体）を得た。ＵＤＣＡ抗体
を３０，０００倍希釈したものを測定に使用した。

【００２６】抗コール酸ー２４−牛血清アルブミンーウ
サギ血清：抗コール酸ー２４−牛血清アルブミンーウサ
ギ血清（以下ＣＡ抗体）は以下のように免疫学的寛容を
用いて作製した。

【００２７】（ａ）ＣＤＣＡ活性エステルとＤＣＡ活性
エステル各１５ｍｇをそれぞれ１．０ｍｌのジメチルホ
ルムアミドで溶かし２５ｍｇ／ｍｌポリ−Ｄ−グルタミ
ン酸−Ｄ−リジン溶液４ｍｌにそれぞれ、ゆっくり加え
３０分放置した。

【００２８】（ｂ）水に対して一昼夜透析後、免疫学的
寛容抗原を得た。

【００２９】（ｃ）免疫学的寛容抗原２ｍｇをウサギの
腹腔内に注入し、その３日後より１回当り１ｍｇのＣＡ
−ＢＳＡ抗原を４ケ月にわたりウサギに授与して免疫し
てＣＡ抗体を得た。

【００３０】（ｄ）得られたＣＡ−抗体を１５，０００
倍に希釈して測定に用いた。

【００３１】酵素標識ーＣＡ，酵素標識−ＣＤＣＡ，酵
素標識−ＤＣＡおよび酵素標識−ＵＤＣＡの作製：西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯＤ）２．０ｍｇを
０．４ｍｌの０．１Ｍリン酸塩緩衝剤を加えた生理塩液
（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で溶解する。ＣＡ活性エステル
（ＣＤＣＡ活性エステル，ＤＣ活性エステルおよびＵＤ
ＣＡ活性エステル）各２μｇを４０μｌのジメチルホル
ムアミドで溶解後、ＨＲＰＯＤ−ＰＢＳ溶液にゆっくり
加える。３０分後、ｐＨ７．４ ０．１Ｍ ＰＢＳに対
して一昼夜透析する。得られたＨＲＰＯＤ標識ＣＡ（Ｈ
ＲＰＯＤ−ＣＡ）および他の酵素標準胆汁酸（ＨＲＰＯ
Ｄ−ＣＤＣＡ，ＨＲＰＯＤ−ＤＣＡおよびＨＲＰＯＤ−
ＵＤＣＡ）液は１５０倍に希釈後、測定に用いた。

【００３２】ＥＬＩＳＡによる胆汁酸測定：本法の測定
に用いた試薬、機器は表１に示した。

【００３３】

【表１】 また、測定に用いたすべての検体は早朝空腹時に採血
し、血清分離後−２０℃以下に保存した。図１に示した
手順のように、第二抗体固相化プレートに各５０μｌの
希釈血清液と抗胆汁酸抗体液、酵素標識抗原液を加え２
５℃で４時間反応させ、洗浄、さらに基質を加え２５
℃、３０分反応させ、反応停止液を加えたのち、４９２
ｎｍフィルターで吸光度の測定を行ない、同時測定の標
準曲線よりそれぞれＣＡ，ＣＤＣＡ，ＤＣＡ，ＵＤＣＡ
の値を求めた。また、上記４成分の測定値の総和を総胆
汁酸値（ＴＢＡ）とした。

【００３４】対象は健常者３０７名，１８才〜６９才、
平均年齢４３．３才（男子１８７名，平均年齢４４．６
才，女子１２０名，平均年齢４１．３才）であり、肝疾
患患者は表２に示した肝疾患患者の急性肝炎６例，慢性
肝炎１３例，肝硬変１３例および肝細胞性癌５例であっ
た。なお有意差検定はｔ−テストにて行なった。

【００３５】

【表２】 結果：本法ＥＬＩＳＡ法におけるＣＡ，ＣＤＣＡ，ＤＣ
ＡとＵＤＣＡの標準曲線を図２に示した。図２はＥＬＩ
ＳＡ法の典型的な標準曲線を示している。二重測定値も
満足する結果であった。

【００３６】表３

【表３】 には胆汁酸と抗体との交叉反応が示してあり、ＣＡ−抗
体，ＣＤＣＡ−抗体，ＤＣＡ−抗体とＵＤＣＡ−抗体そ
れぞれの各胆汁酸との交叉率を示した。ＣＡ−抗体につ
いては遊離−ＣＡ１００％に比してグリシンとタウリン
複合体でそれぞれ１６４％，２１０％の交叉率、同様に
ＣＤＣＡでは１．５〜３．５％であった。また二次胆汁
酸のＤＣＡでは２．０〜４．１％でありリトコール酸
（ＬＣＡ）では０．１％であった。

【００３７】ＣＤＣＡ−抗体については、遊離ーＣＤＣ
Ａ１００％に比してグリシンとタウリン複合体でそれぞ
れ１７８％，１８３％の交叉率であった。ＣＡに対して
は０．４〜０．９％を認めＤＣＡ，ＬＣＡとＵＤＣＡに
対しては０．１％以下であった。

【００３８】ＤＣＡ−抗体については、遊離−ＤＣＡ１
００％に比してグリシンとタウリン複合体でそれぞれ１
８４％，１９２％の交叉率であった。同様にＣＡに対し
ては４．９％以下、ＣＤＣＡに対しては０．８％以下、
ＬＣＡでは３．２％以下であった。

【００３９】ＵＤＣＡ−抗体については、遊離−ＵＤＣ
Ａ１００％に比してグリシンとタウリン複合体でそれぞ
れ１１１％，１４６％の交叉率を認め他の成分に対して
は０．２％あるいはそれ以下の交叉率であった。

【００４０】一次胆汁酸のＣＤＣＡ−抗体と二次胆汁酸
のＤＣＡとの交叉率は０．１％以下であり、同様にＣＡ
−抗体とは４．１％以下であった。また二次胆汁酸のＤ
ＣＡ−抗体と一次胆汁酸のＣＤＣＡとは０．８％以下、
ＣＡとは４．９％以下と低率の交叉率であることから、
この各胆汁酸抗体についてはほぼ満足するものであっ
た。

【００４１】下記表４には、濃度の異なった患者試料Ｉ
とIIの同時再現性と経日再現性の結果を示した。

【００４２】

【表４】 同時再現性では濃度差に関係なく同傾向の再現性が認め
られ、ＵＤＣＡで最も良好で次いでＣＡであった。また
経日再現性についても同傾向が認められ、ほぼ満足する
結果であった。

【００４３】血清胆汁酸の保存による影響では−２０
℃，４℃，２５℃の各保存条件下について、濃度の異な
った患者試料Ｉ，IIを用いて実施した。ＤＣＡとＵＤＣ
Ａの試料IIにおいて若干の定価傾向が認められたが１４
日間内であればいずれの条件下でも比較的安定であるこ
とを表５に示した。

【００４４】

【表５】 表６には健常者における胆汁酸レベルの基準値範囲の設
定が示されている。健常者３０７名の血清各胆汁酸測定
値の度数分布については図３に示され、また各胆汁酸測
定値より求めたＣＡ／ＣＤＣＡ比，ＣＤＣＡ／ＤＣＡ
比，ＣＡ／ＤＣＡ比，ＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比とＣＡ
＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ＋ＵＤＣＡ比の度数分布については
図４に示した。いずれの度数分布もガウス分布を示さ
ず、対数正規分布が認められたので、測定値を正規化
後、平均±２ＳＤを求めて表６に示した。

【００４５】

【表６】 表６には、血清中の総胆汁酸（ＴＢＡ）と各分画測定胆
汁酸成分濃度が示されているが、ＴＢＡは前述の如く各
分画測定値の総和とした。男性＝１８７名、女性＝１２
０名合計３０７名の健常者より得られた基準値範囲２．
９３（１．２９〜６．６５μｍｏｌ／ｌ）（平均±２Ｓ
Ｄ）に対して、表７に示した患者群では、急性肝炎の急
性段階が２９３．３±１４８．２μｍｏｌ／ｌ（平均±
ＳＤ），回復期段階が１４．６±１４．６μｍｏｌ／
ｌ，慢性肝炎が２９．３±１６．３μｍｏｌ／ｌ，肝硬
変が７１．２±５８．６μｍｏｌ／ｌ，肝細胞性癌が５
２．５±３５．４μｍｏｌ／ｌといずれも健常者に比し
てＰ＜０．０１と有意に高値を示した。特に急性肝炎の
急性段階，肝硬変および肝細胞性癌は著明であった。

【００４６】

【表７】 各分画測定成分では図５に示したように、いずれの肝疾
患群とも健常者群に比してＰ＜０．０１と有意に高値傾
向を示したが疾患群間では有意な差は認められなかっ
た。また、肝疾患患者３７症例中の各分画胆汁酸ではＣ
Ａが３３例（８９．２％），ＣＤＣＡが３４例（９１．
９％），ＤＣＡが３５例（９４．６％）とＵＤＣＡが３
６例（９７．３％）と基準値を逸脱した異常高値傾向を
認めた。

【００４７】分画測定成分値から求められた比について
の検討：ＣＡ／ＣＤＣＡ比について この比は、図６に示したようにほとんどの症例が基準値
範囲内であった。また慢性肝炎と肝硬変では基準下限値
より低値を示す症例がそれぞれ４例ずつ認められた。さ
らに肝硬変の１３症例中１０例（７６．９％）はＣＡ／
ＣＤＣＡ比が１．０以下であった。

【００４８】健常者より得られた基準値は１．１６
（０．６４〜２．１９）（平均±２ＳＤ）であり各肝疾
患群（平均±ＳＤ）では、急性肝炎の急性段階が１．２
６±０．８６、回復期段階が１．２３±０．４４，慢性
肝炎が０．８９±０．５２，肝硬変が０．９０±０．４
２と肝細胞性癌が１．００±０．２５であった。肝疾患
群間では有意差は認められなかったが健常者群に比して
肝硬変群がＰ＜０．０５の有意差が認められた。

【００４９】ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比について この比は、基準値４．６４（１．８７〜１１．５６），
（平均±２ＳＤ）であり、各肝疾患群（平均±ＳＤ）で
は、急性肝炎の急性段階が１０．９±２．６，慢性肝炎
が１８．６±２３．２，肝硬変が１７．８±１０．７，
肝細胞性癌が２５．１±１０．４と健常者群に比してＰ
＜０．０１と有意な高値傾向が認められた。

【００５０】一方、ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比を各疾患群別に
基準上限値を逸脱した異常症例の出現率でみると、急性
肝炎が６症例中１例（１６．７％）、慢性肝炎が１３症
例中６例（４６．１％）、肝硬変が１３症例中１０例
（７６．９％）と肝細胞性癌が５症例中５例（１００
％）の各異常症例が認められた。このことは疾患群間に
著明な有意差は認められなかったが重症度の進展に伴っ
た異常症例の出現率であり、各疾患群の重症度の差異を
反映しているものと考える。

【００５１】ＣＡ／ＤＣＡ比について この比は、基準値５．３８（１．８２〜１５．９０）
（平均±２ＳＤ）であり、各肝疾患群（平均±ＳＤ）で
は、急性肝炎の急性期段階が１２．０±６．１，回復期
段階が５．４±４．４，慢性肝炎が１５．５±１３．
９，肝硬変が１５．０±９．２と肝細胞性癌が２４．１
±８．７であった。急性肝炎の回復期段階を除いた肝疾
患群は健常者に比してＰ＜０．０１と有意に高値を示し
たが、疾患群間では有意差は認められなかった。

【００５２】ＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比について この比は基準値１０．３６（４．０９〜２６．２２）
（平均±２ＤＳ）であり、各肝疾患群（平均±ＳＤ）で
は、急性肝炎の急性段階が２２．９±４．６，回復期段
階が９．９±７．１，慢性肝炎が３４．２±３５．３，
肝硬変が３１．９±１８．０，肝細胞性癌が４９．２±
１８．０であった。健常者に比して、慢性肝炎，肝硬変
と肝細胞性癌症例ともＰ＜０．０１と有意に高値を示し
た。また基準上限値を逸脱した症例数では慢性肝炎が１
３症例中６例（４６．２％），肝硬変が１３症例中７例
（５３．９％），肝細胞性癌が５症例中４例（８０．０
％）と異常高値症例を認めたがＣＤＣＡ／ＤＣＡ比ほど
著明ではなかった。

【００５３】ＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ＋ＵＤＣＡ比につ
いて この比は、基準値８．３４（３．７４〜１８．５７）
（平均±２ＳＤ）であり、各肝疾患群（平均±ＳＤ）で
は、急性肝炎の急性段階が１５．３±５．５，回復期段
階が５．９±３．６，慢性肝炎が１１．８±９４，肝硬
変が１６．０±９．３，肝細胞性癌が１９．８±５．９
であった。健常者に比して、肝硬変と肝細胞性癌ではＰ
＜０．０１と有意に高値を示したが疾患群間では有意差
が認められなかった。

【００５４】近年の我国の慢性肝炎の６０〜７０％はＣ
型肝炎ウイルスにより、２０〜３０％はＢ型肝炎ウイル
スにより生じている。また、慢性肝炎患者の１０〜２０
％は肝硬変に移行し、その半数以上は肝細胞性癌を発症
しているものと考えられている。

【００５５】著者らは、血清胆汁酸ＣＡ，ＣＤＣＡ，Ｄ
ＣＡとＵＤＣＡの分画測定を目的としたＥＬＩＳＡ法を
確立し健常者を対象に各分画成分の基準値設定を行っ
た。また、得られた測定値よりＣＡ／ＣＤＣＡ比，ＣＤ
ＣＡ／ＤＣＡ比，ＣＡ／ＤＣＡ比，ＣＡ＋ＣＤＣＡ／Ｄ
ＣＡ比とＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ＋ＵＤＣＡ比を求め基
準値設定を行ったのち、肝機能障害の病態による差異を
知る可能性を検討した。

【００５６】血清ＴＢＡ測定の利点は、軽症肝障害の場
合、異常検出率は必ずしも充分ではないが異常高値には
偽陰性はあっても偽陽性はない点である。したがって異
常高値例では必ず肝障害が存在する。

【００５７】著者らの今回の肝疾患患者の検討でも、ほ
とんどの症例においてＴＢＡと各分画成分ともに基準範
囲を逸脱した高値傾向が認められた。このことは肝障害
が存在すればＴＢＡの組成成分であるＣＡ，ＣＤＣＡ，
ＤＣＡとＵＤＣＡなどの異常上昇があり結果としてＴＢ
Ａの高値傾向を示すという血清胆汁酸の動態が明らかに
なった。しかし、分画測定胆汁酸とＴＢＡの高値傾向は
各肝疾患において重なり合っているので病型を診断する
ことは困難である。

【００５８】一方、急激な肝細胞の破壊は、肝の胆汁酸
の摂取または胆汁中への排泄障害を生じ血清ＴＢＡが上
昇すると考えられている（該一覧表の文献７）参照）。
また肝硬変についてもＴＢＡの上昇が認められている。

【００５９】本発明者らの研究でも急性肝炎の急性段階
ではＣＡ，ＣＤＣＡ，ＤＣＡとＵＤＣＡが異常上昇を示
し、結果としてＴＢＡの異常高値傾向が認められた。ま
た肝硬変においても同様に異常高値傾向が認められた
が、これは肝実質障害に加えて、肝内外の短絡路の発達
により再吸収された胆汁酸が大循環に流入するものと考
える。また、肝硬変ではＣＡ／ＣＤＣＡ比は１より小さ
いことが多いと報告されており、著者らの結果も同様な
傾向を認めた。しかし肝硬変にかぎらず急性肝炎，慢性
肝炎と肝細胞性癌においても多くの症例が健常者の基準
値範囲にあり差異が認められなかった。アベ（Ａｂｅ）
らも（該一覧表の文献８）参照）このＣＡ／ＣＤＣＡ比
では劇症肝炎（ＦＨ），肝硬変と健常者との間に有意差
が認められずまた、ＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ＋ＵＤＣＡ
比については、肝硬変に比してＦＨで有意に高値を示し
たと報告している。その理由として一次胆汁酸の絶対的
な増加と胆汁中への排出障害による二次胆汁酸の合成障
害が肝硬変より激しく起こるための変化によると述べて
いる。本発明者らのＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ＋ＵＤＣＡ
比の結果では慢性肝炎より肝硬変，肝硬変より肝細胞性
癌と重症度の進展に伴った症例で高値傾向を認めたが明
確な有意差は認められなかった。

【００６０】一方 血清胆汁酸成分の測定値の平均値が
各肝疾患群間に関係なく共通して近似を示した成分では
急性肝炎のＡＳ症例を除くと、二次胆汁酸のＤＣＡが最
も近似した値であった。この二次胆汁酸ＤＣＡと一次胆
汁酸（ＣＡとＤＣＡ）の比、すなわちＣＡ／ＣＤＣＡ
比，ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比とＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比を
それぞれ求めて肝障害の実質差異による比較検討を行っ
た。

【００６１】急性肝炎では各分画成分およびＴＢＡとも
異常高値傾向を示した。成分比では、そのいずれもが、
ほとんどの症例について健常者の基準値範囲内にあるこ
とが認められた。特に急性肝炎の急性段階における血清
胆汁酸動態の特徴は、各分画成分やその総和のＴＢＡで
は異常な高値を示したが、成分比では急性肝炎の回復期
段階とともに基準値内に存在することである。

【００６２】また、慢性肝炎については各分画成分およ
びＴＢＡとも異常高値傾向が認められたが、成分比では
ＣＡ／ＤＣＡ比，ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比とＣＡ＋ＣＤＣＡ
／ＤＣＡ比とも１３例中７例（５３．９％）が基準値内
にあり、６例が基準上限値を逸脱した高値を認めた。

【００６３】肝硬変では、いずれの分画成分とも異常高
値を示し特にＣＤＣＡの著明な増加に伴ったＴＢＡの異
常高値傾向が認められた。この理由として、肝硬変では
１２α−ヒドロキシラーゼの障害によりＣＡはその影響
を受けるがＣＤＣＡの合成は副経路（該一覧表の文献
９）参照）が存在するのであまり影響をうけないものと
考える。また、基準値範囲を逸脱した成分比の異常高値
傾向はＣＤＣＡ／ＤＣＡ比（７６．９％）が最も著明で
あり、次いでＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比（５３．９
％），ＣＡ／ＤＣＡ比（３８．５％）の順であった。

【００６４】一方、肝細胞性癌についてはＤＣＡの１例
を除いて、すべての分画成分が異常高値傾向を示し、Ｔ
ＢＡも同様な傾向であった。成分比では、ＣＤＣＡ／Ｄ
ＣＡ比が全症例（１００％）とも基準値を逸脱した異常
高値傾向を認めた。

【００６５】特にＣＤＣＡ／ＤＣＡ比については慢性肝
炎より肝硬変あるいは肝細胞性癌と重症度の進展に伴っ
て基準値を逸脱した異常高値症例の出現率が著明である
ことから肝障害の重症度の質的差異を反映しているもの
と考えられる。

【００６６】またＣＤＣＡ／ＤＣＡ比ほど著明ではない
がＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比についても同様な傾向が認
められた。

【００６７】

【発明の効果】上記の所見から、肝疾患の診断と予後の
予測に血清胆汁酸の分画測定と各胆汁酸濃度比、特にＣ
ＤＣＡ／ＤＣＡ比およびＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比、を
求める本発明の方法は、総胆汁酸濃度のみの測定による
評価法より、胆汁酸の量的、質的変化を詳細に知ること
が可能である。また、肝臓はその代償能，予備能が大き
いので重症度の診断を確実に行うことは臨床的に大変重
要である。よって、肝疾患時の重症度の鑑別法の指標と
して、本発明の方法を用いることは臨床的に大変有用で
ある。今後、さらに臨床症例データを集積することによ
り、より正確で緻密な診断に応用することが可能であ
る。

【００６８】文献一覧表 １） Ｋａｎｏ Ｍ，Ｗａｄａ Ｈ，Ｍａｔｓｕｍｏｔ
ｏ Ｍ，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｋ，Ｋａｍａｎｏ Ｔ，Ｍ
ｏｔｅｇｉ Ｋ，Ｏｇｕｃｈｉ Ｋ ａｎｄ ｋａｎｏ
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ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｃ
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ｌｅ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉ
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ｓｕｋａｄａ Ｋ，Ｈｉｒｏｓｅ Ａ，Ｈｏｓｈｉｎｏ
Ｍ，Ｈａｙａｋａｗａ Ｔ，ＹｏｋｏｃｈｉＭ，Ｍｉ
ｙａｊｉ Ｍ，Ｉｔｏ Ｍ．ａｎｄ Ｔａｋｅｕｃｈｉ
Ｔ：ｓｅｒｕｍｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉ
ｔｉｏｎ ｉｎ ｆｕｌｍｉｎａｎｔｈｅｐａｔｉｔｉ
ｓ．ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｗｉｏｈ
ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｎａｇｏｙａ Ｍｅ
ｄ Ｊ，２９：６３−７１（１９８４） ８） Ａｂｅ Ｋ，Ｙｏｓｈｉｂａ Ｍ ａｎｄ Ｓｕ
ｇａｔａ Ｆ：ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａ
ｍｃｅ ｏｆ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ
ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａ
ｔｉｅｎｔｓ ｗｉｏｈ ｆｕｌｍｉｎａｎｔ ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉ
ｓ．Ｊ ｓｈｏｗａ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ，５３：２５
−３０（１９９３）（ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ，Ｅｎｇ
ｌｉｓｈ ａｂｒｔａｃｔ） ９） Ａｙａｋｉ Ｙ ａｎｄ Ｙａｍａｓａｋｉ
Ｋ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｎｖｅｒ−ｓｉｏｎ ｏｆ
７α−ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒａｌｔｏ
ｓｏｍｅ ｎａｔｕｒａｌ Ｃ₂₄−ｂｉｌｅ ａｃｉｄ
ｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｔｏ ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ ｂ
ｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６８：３４
１−３４６（１９７０）

【図面の簡単な説明】

【図１】本法ＥＬＩＳＡ法におけるＣＡ，ＣＤＣＡ，Ｄ
ＣＡおよびＵＤＣＡの測定手順を示す図式である。

【図２】本法ＥＬＩＳＡ法におけるＣＡ，ＣＤＣＡ，Ｄ
ＣＡおよびＵＤＣＡの標準曲線を示すグラフである。

【図３】健常者３０７名のＣＡ，ＣＤＣＡ，ＤＣＡおよ
びＵＤＣＡの血清各胆汁酸測定値の度数分布および対数
正規分布を示すグラフである。

【図４】各胆汁酸測定値より求めたＣＡ／ＣＤＣＡ比，
ＣＤＣＡ／ＤＣＡ比，ＣＡ／ＤＣＡ比，ＣＡ＋ＣＤＣＡ
／ＤＣＡ比とＣＡ＋ＣＤＣＡ／ＤＣＡ＋ＵＤＣＡ比の度
数分布および対数正規分布を示すグラフである。

【図５】各種肝疾患の患者毎の血清中の各胆汁酸濃度を
示すグラフである。

【図６】各種肝疾患の患者毎の血清中の各胆汁酸濃度比
を示すグラフである。

【符号の説明】

図４ないし６において、ＣＡはコール酸，ＣＤＣＡはケ
ノデオキシコール酸，ＤＣＡはデオキシコール酸、ＵＤ
ＣＡはウルソコール酸をそれぞれ示し；図５および６に
おいて、Ｍは平均、ＴＢＡはＣＡ，ＣＤＣＡ，ＤＣＡお
よびＵＤＣＡを合計した総胆汁酸、ＡＨは急性肝炎、Ａ
Ｓは急性段階、ＣＳは回復期段階、ＣＨは慢性肝炎、Ｌ
Ｃは肝硬変、ＨＣＣは肝細胞性癌をそれぞれ示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 胆汁酸の活性エステルを製造し、牛血清
   アルブミン溶液と反応させ、透析し、上記透析された物
   を抗原としてヒト以外の哺乳動物を免疫することにより
   抗胆汁酸抗体を作製し；上記活性エステルを酵素と反応
   させて酵素標識胆汁酸を酵素標識抗原として作成し；第
   二抗体固相化プレートに測定対象の血清の希釈液と抗胆
   汁酸抗体液、酵素標識抗原液を加えて反応させ、さらに
   基質を加えて反応させ；該反応物の吸光度の測定を行な
   い、同時測定の標準曲線よりそれぞれの胆汁酸の濃度を
   求め；およびこれらの酸の測定値の総和を総胆汁酸濃度
   とすることからなる、ＥＬＩＳＡによる血清中胆汁酸の
   測定法。
2. 【請求項２】 胆汁酸がコール酸，ケノデオキシコール
   酸，デオキシコール酸またはウルソコール酸である請求
   項１の方法。
3. 【請求項３】 酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼで、
   基質がｏ−フェニレンジアミンであり、免疫される哺乳
   動物がウサギである請求項２の方法。
4. 【請求項４】 第二抗体固相化プレートが抗−ウサギＩ
   ｇＧＥＬＩＳＡプレートで、４９２ｎｍフィルターを使
   用して測定する請求項２の方法。
5. 【請求項５】 胆汁酸の活性エステルを製造し、牛血清
   アルブミン溶液と反応させ、透析し、上記透析された物
   を抗原としてヒト以外の哺乳動物を免疫することにより
   抗胆汁酸抗体を作製し；上記活性エステルを酵素と反応
   させて酵素標識胆汁酸を酵素標識抗原として作成し；第
   二抗体固相化プレートに測定対象の血清の希釈液と抗胆
   汁酸抗体液、酵素標識抗原液を加えて反応させ、さらに
   基質を加えて反応させ；該反応物の吸光度の測定を行な
   い、同時測定の標準曲線よりそれぞれの胆汁酸の濃度を
   求め；これらの酸の測定値の総和を総胆汁酸濃度とし、
   各胆汁酸の濃度比を算出し；および得られた濃度比を健
   常者について設定した該濃度比の基準範囲と比較するこ
   とからなる肝疾患の診断方法。
6. 【請求項６】 胆汁酸がコール酸，ケノデオキシコール
   酸，デオキシコール酸またはウルソコール酸である請求
   項５の方法。
7. 【請求項７】 酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼで、
   基質がｏ−フェニレンジアミンであり、免疫される哺乳
   動物がウサギである請求項６の方法。
8. 【請求項８】 第二抗体固相化プレートが抗−ウサギＩ
   ｇＧＥＬＩＳＡプレートで、４９２ｎｍフィルターを使
   用して測定する請求項６の方法。
9. 【請求項９】 肝疾患が急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変ま
   たは肝細胞性癌である請求項５の方法。