CN101943699B - 一种检测唾液中hiv抗体的试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测唾液中HIV抗体的试剂条及其制备方法，试剂条包括样品垫、与所述样品垫一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜、与所述玻璃纤维膜另一端紧密相连的硝酸纤维素膜、以及与所述纤维素膜的另一端紧密相连的吸水纸，所述样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸均设置于底板上，所述硝酸纤维素膜包括包被有HIV重组抗原的检测区和包被有羊抗兔抗体的控制区，所述胶体金颗粒标记物包括胶体金颗粒-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物微信号放大系统和胶体金标记兔IgG抗体。本发明采用了生物素-亲和素微信号放大系统，扩大了目标抗体的信号，增加检测灵敏度，避免因信号太弱而出现假阴或者漏检。

Description

一种检测唾液中HIV抗体的试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，尤其涉及一种检测唾液中人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的试纸条及其制备方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，是一种感染人类免疫系统细胞的病毒，该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)。艾滋病是一种至今无有效疗法的致命性传染病。

艾滋病感染者的治疗费用昂贵，美国第一批艾滋病病人医疗费用为15亿美元；我国专家估算每个艾滋病病人直接间接耗费达15万元左右，预计09年我国艾滋病病人耗费达154亿元；其次针对艾滋病的研究投入惊人，美国每年投入艾滋病防治、科研的经费达数10亿美元，中国自2008年启动艾滋病等重大传染病专项，已投入约100亿。艾滋病感染会极大影响人口素质的提高，目前HIV感染者均为在18-45岁阶段，作为社会财富创造者，他们的死亡对社会经济说是无法弥补的，艾滋病病人及其家属的就业、上学、医疗、婚姻、生育问题，都对社会造成了沉重的负担。近年来母婴垂直传播的比率逐年增长，对于不断强化的人口素质问题是很大的影响。针对目前艾滋病感染既没有有效的疫苗预防，又无特效药物治疗，早期诊断HIV感染是预防、控制HIV扩散的有效手段。

目前，检测HIV主要是血液HIV抗体免疫学检测(如酶联法、印迹法、胶体金法、荧光法等)及血液核酸检测。

①传统免疫学方法：包括初筛试验和确认试验。前者最常用的是酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点免疫渗滤/层析试验等，具有较高的灵敏性和实用性；后者最常用的是免疫印迹试验(Western Blot，WB)，具有较高的特异性。20世纪80年代以后，ELISA技术广泛应用于微生物、病毒等的检测中。

②新免疫学检测技术：(1)免疫复合物裂解检测法(ICD)，敏感性仅为90％，不宜单独使用，但在不具备先进仪器的地方有较大应用价值。(2)超敏感酶免疫测定法(UEI)，即双位点免疫复合物转移酶免疫测定，对试剂要求高，需要一定仪器，操作复杂。(3)免疫吸附电镜法(ISEM)，实现了对病毒颗粒的直接特异性检测，灵敏度高，但需昂贵精密仪器，操作复杂。(4)线性免疫酶测定(LIA)和CobasCore HIV，Combi EIA是新近发展起来的第四代HIV检测技术。

③分子生物学方法：RT-PCR检测法、实时荧光PCR检测技术、支链DNA、连接酶酶促链式反应、核酸序列依赖性扩增以及转录介导的扩增等。PCR的过高灵敏度，操作时容易导致污染，假阳性率较高，PCR检测系统将PCR扩增反应和检测限制在单个反应管中进行。实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。但这种新的检测方法依靠手工加样，耗费人力，也存在造成变异的潜在危险。

④基因芯片技术：利用基因芯片对HIV的蛋白酶基因的多态性进行分析。基因芯片技术缩短检测窗口期，加强献血者血液的安全，但耗费高。

中国专利CN20133127Y公开了一种检测HIV抗体的试剂盒，其是利用胶体金标记HIV抗原，利用硝酸纤维素NC膜包被HIV抗原的抗原，根据NC膜C、T线的出现情况，来判定检测结果。然而，该专利公开的试剂盒虽然操作简便，结果易得，但其仍然是利用血液来检测HIV抗体的，使用的是一般的捕获方法，难以实现信号的级联放大。

上述检测方法基本均采用血液检测，需采集患者血清或血浆样本，都存在入侵性或不准确，对患者及操作者均有再次感染的风险，且采血过程属于“有创”过程，不利于HIV检测在家庭、在基层及更广泛人群中推广使用。

近年关于艾滋病的研究表明，HIV感染者的口腔液体含有HIV抗体，其通过口腔粘膜毛细血管渗透到口腔。唾液检测与血液检测一样，遵循同样的筛查和确诊步骤，在采血不实用或不安全的情况下，口腔检测有非侵入性采集样本的优点。

专利申请号为CN101368954A所公开的利用唾液检测HIV的试剂，采用的是渗滤法，配件多，包括长条形的检测盒，圆柱状的集液滤器、柱塞、采样杯、刻度吸管、酸酸缓冲液试剂以及抗人IgG胶体金复合物试剂，操作比胶体金法复杂，不利于一般家庭和个人的自检和推广。

专利申请号为CN101539575A公开了一种检测唾液HIV抗体的方法，其是采取双抗原夹心原理，首先用纯化的重组HIV-1/2抗原在纤维膜上捕获唾液里的抗原，然后在T线用抗人IgG抗体捕获。但是唾液里抗体含量比血液含量少很多，用一般的捕获方法难以实现信号的级联放大，从而会影响灵敏度。

如上所述，利用唾液检测HIV抗体的方法具有安全无痛、且快速简便的优点，然而，与此同时，研究发现唾液中HIV抗体浓度极低，约为血液的HIV抗体浓度的1/100-1/1000，且水分多、含有降解HIV抗体蛋白的蛋白酶等物质，成分复杂，极易导致假阳。因此采用唾液检测HIV抗体，需要解决的问题即是HIV抗体浓度低，导致检测结果不明显，检测难度大的问题。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的唾液HIV抗体浓度低、检测结果不明显的缺陷，而提供一种新的检测唾液中人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的试纸条。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种检测唾液中HIV抗体的试纸条，包括样品垫、与所述样品垫一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜、与所述玻璃纤维膜另一端紧密相连的硝酸纤维素膜、以及与所述纤维素膜的另一端紧密相连的吸水纸，所述样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸均设置于底板上，所述硝酸纤维素膜包括包被有HIV重组抗原的检测区和包被有羊抗兔抗体的控制区，所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记兔IgG抗体，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物。

优选地，所述胶体金颗粒-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物的用量为0.65-0.9μg/cm²；所述胶体金标记兔IgG抗体的用量为0.25-0.45μg/cm²；所述HIV重组抗原为gp41(3.00mg/ml)和gp36(3.5mg/ml)，混合的包被浓度为0.8mg/ml-1.5mg/ml，所述HIV重组抗原的用量为0.054-0.08μg/mm；所述羊抗兔抗体为羊抗兔IgG抗体，所述羊抗兔抗体的浓度为4mg/ml，所述羊抗兔抗体的用量为0.09-0.22μg/mm。

本发明还提供了一种检测唾液中HIV抗体的试剂卡，包括上述试剂条。

本发明还提供了上述试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)按常规方法制备鼠抗人IgG抗体、HIV重组抗原gp41和gp36、以及胶体金标记兔IgG抗体；

(2)制备微信号放大系统

a、制备胶体金标记亲和素

将待标记亲和素预先在0.005mol/L pH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，然后4℃ 100 000g离心1h，以0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金液的pH值至9～10，标记亲和素以形成胶体金标记亲和素；

b、按常规方法制备生物素化抗人IgG抗体

c、完成微信号放大系统

将步骤a得到的胶体金标记亲和素和步骤b得到的生物素化抗人IgG抗体连接，得到胶体金-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物，经过洗涤处理后，即得微信号放大系统；

(3)按稀释参数25cm²/ml～35cm²/ml，将步骤(2)的胶体金-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物、以及步骤(1)的胶体金标记兔IgG抗体喷洒到玻璃纤维膜上，干燥12个小时以上，备用；

(4)用包被缓冲液稀释HIV重组抗原，使其浓度为0.8mg/ml～1.5mg/ml，按膜液量0.16μl/mm～0.2μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥12个小时以上，备用；用包被缓冲液稀释羊抗兔抗体，使其浓度为1.0mg/ml～2.0mg/ml，按膜液量0.18μl/mm～0.22μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥12个小时以上，备用；

(5)将样品垫、步骤(3)的玻璃纤维膜、步骤(4)的硝酸纤维素膜、吸水纸按序粘贴于底板上，即得。

为了解决信号扩大不足和操作复杂的问题，本发明基于固相免疫层析原理，采用功能性彩色微球技术(采用胶体金颗粒标记)及微信号放大技术(亲和素-生物素体系)检测唾液中的HIV抗体。若唾液样品中含有HIV抗体，经玻璃纤维膜上的微信号放大系统将信号放大，使HIV抗体与胶体金颗粒标记物结合，形成复合物，并扩散到硝酸纤维素膜上进一步层析，当遇到包被在硝酸纤维素膜上检测区(T线)处的配对抗原时，复合物则又和包被抗原结合，被捕获在包被处，当被捕获的复合物达到一定数量时，则形成肉眼可见的T线，说明样品中含有HIV抗体，若不出现，说明样品为阴性或含量低于试纸条的最低检测限。控制区(C线)作为试纸条的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明在现有检测试纸条的基础上，采用了生物素-亲和素微信号放大系统，因而，在检测唾液中HIV抗体的过程中，扩大了目标抗体的信号，增加检测灵敏度，避免因信号太弱而出现假阴或者漏检；

(2)本发明的试纸条具有操作安全(无放射物污染)、简便(简单操作一步完成)、适合单人/份检测(放免、酶免不适合单人/份或少量样品检测)和快速(15分钟左右即可有结果)等优点，可实现对HIV抗体现场和家庭自检；

(3)本发明的试纸条可以在牙龈处取样，成分多为口腔粘膜毛细血管渗透物，来源更加直接，水分和杂质较少，干扰物少，HIV抗体的含量比重增加。

附图说明

图1为本发明的检测唾液中HIV抗体的试纸条的结构示意图；

图2为利用本发明试纸条检测HIV抗体的阳性结果示意图；

图3为利用本发明试纸条检测HIV抗体的阴性结果示意图；

图4为本发明实施例1的使用方法示意图；

图5为本发明实施例1的测试结果示意图；

图6为本发明实施例2的取样示意图；

图7为本发明实施例2的滴样示意图；

附图标记：1.样品垫；2.玻璃纤维膜；3.硝酸纤维素膜；4.吸水纸；5.检测区；6.控制区；7.底板。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1 本发明检测唾液中HIV抗体的试纸条

如图1所示，为本发明所述的一种检测唾液中HIV抗体的试纸条。包括样品垫1、与所述样品垫1一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜2、与所述玻璃纤维膜2另一端紧密相连的硝酸纤维素膜3、以及与所述纤维素膜3的另一端紧密相连的吸水纸4，所述样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4均粘贴于底板7上，所述样品垫1为玻璃纤维膜，所述硝酸纤维素膜3包括包被有HIV重组抗原gp41和gp36的检测区5和包被有羊抗兔IgG抗体的控制区6，所述玻璃纤维膜2上的胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金颗粒-兔IgG抗体，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-生物素-亲和素-抗人IgG抗体复合物。

本发明的试剂条，所述胶体金颗粒-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物在玻璃纤维膜2上的用量为0.7μg/cm²；胶体金标记兔IgG抗体在玻璃纤维膜2上的用量为0.35μg/cm²；HIV重组抗原为gp41(原始浓度为3.00mg/ml)和gp36(原始浓度为3.5mg/ml)，包被到硝酸纤维膜3的检测区5时的浓度为1.2mg/ml，包被用量为0.07μg/mm；羊抗兔IgG抗体的浓度为4mg/ml，羊抗兔IgG抗体包被在控制区时的用量为0.15μg/mm。

实施例2 本发明试纸条的制备方法

在本发明中采用胶体金颗粒标记。其中胶体金颗粒的颗粒直径大小为纳米级(30～50nm)，胶体颗粒的吸附机理是利用它在碱性条件下带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷集团，靠静电吸引而结合形成免疫诊断试剂。检测唾液中人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的试纸条的制备步骤如下：

1.制备抗人IgG抗体

利用常规方法从人细胞质中分离IgG，利用人IgG免疫小鼠，人IgG免疫的小鼠与骨髓瘤细胞融合后，用ELISA方法鉴别，鉴别出来的杂交瘤在腹水中培养，筛选阳性克隆，分离纯化鼠抗人IgG抗体。ELISA鉴定抗人IgG抗体的活性和效价，纯化备用。

2、制备重组抗原gp41和gp36

确定HIV目的基因后，利用常规方法构建目标蛋白表达载体，经过表达、筛选、鉴定、纯化后保存待用。gp41的原始浓度为3.00mg/ml，gp36的原始浓度为3.5mg/ml。

3、制备微信号放大系统

a、制备胶体金标记亲和素：将待标记亲和素预先在0.005mol/L pH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后4℃ 100 000g离心1h，去除聚合物；以0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金液的pH值至9～10，标记亲和素以形成胶体金标记亲和素；

b、制备生物素化抗人IgG抗体：先用6-氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，再使其与抗人IgG抗体结合，然后在碳二亚胺的作用下将其与N-羟基丁二酰胺进行缩和，生成长臂生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS)，即为生物素化抗人IgG抗体。通过透析除去游离生物素。

c、完成微信号放大系统的：将步骤a得到的胶体金标记亲和素和步骤b得到的生物素化抗人IgG抗体直接混合，连接得到胶体金-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物，经过洗涤、离心处理后，即得微信号放大系统。

4、胶体金标记兔IgG抗体

在pH6.5～7.0范围内，兔IgG与胶体金颗粒蛋白(最低用量为8.0μg/ml)标记形成胶体金标记兔IgG抗体(蛋白探针)。

5、将胶体金-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物、以及胶体金标记兔IgG抗体喷洒到玻璃纤维膜2上，稀释参数(稀释参数是每ml溶液喷洒多少面积的工艺参数)为25cm²/ml～35cm²/ml，并在温度20～40℃，湿度10％-30％，将玻璃纤维膜2干燥12个小时以上，备用。

6、用包被缓冲液(主要成分是磷酸缓冲液、蔗糖)稀释HIV重组抗原，使其浓度为1.0mg/ml，按膜液量0.18μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3上，其中硝酸纤维素膜3孔径为5.0μm～12.0μm，置于20～40℃，湿度10％～30％条件下烘干处理12个小时以上，备用；用包被缓冲液稀释羊抗兔IgG抗体，使其浓度为1.5mg/ml，按膜液量0.20μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3上，置于20～40℃，湿度10％～30％条件下烘干处理12个小时以上，封袋，备用；

7、将样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4依序粘贴于底板7上，即得本发明所述的试纸条。

本发明所述的检测唾液中人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体的试纸条经过包装可以直接使用，或者安装到试剂盒里，配合小滴管，充当试剂卡使用。

实施例3 利用实施例1中的试纸条检测唾液中HIV抗体的方法

本实施例利用实施例1的试纸条对唾液样本中的HIV抗体进行检测。为了便于使用，在玻璃纤维膜2上粘贴有指示箭头和液面标志(MAX标志线)。

包括以下步骤：

(1)采集唾液样品后，加入1ml样品处理液(0.02MPBS+0.05％Tween-20+1％BSA，pH7.4±0.2)处理即可用于测试。常温下，样本应在采集后1小时内进行处理。如样本处理后无法及时进行检测，应将处理后的样本置于2～8℃冷藏，且样本应在处理后12小时内测试完毕。

(2)将试纸条按箭头朝下的方向把样品垫1插入经处理的唾液样本溶液中(液面不应超过MAX标志线)(图4)，20秒后取出平放；由于毛细管作用，样品将沿着试纸条向玻璃纤维素膜2和硝酸纤维素膜3移动，待样品完全通过玻璃纤维素膜2以及硝酸纤维素膜3，结果开始显示；

(3)15分钟后观察显示结果(30分钟后显示的结果无效)，判读并记录检测结果(图5)，若硝酸纤维素膜3的检测区5出现一条肉眼可见的深色线(T线)，即表明样品中含有大量HIV抗体，即说明受检验者的肌体已经被病毒感染(阳性，请同时参考图2)；若硝酸纤维素膜3的检测区5未出现一条肉眼可见的深色线，即表明样品中未含有大量的HIV抗体，说明受检验者未被病毒感染(阴性，请同时参考图3)；当样品通过硝酸纤维素膜3的检测区5移动至控制区6时，无论样品中有没有HIV抗体，控制区6都会有一条深色线(C线)；若控制区6无色线出现，说明试纸条已经过期或操作有误；

(4)测试结束后，将使用后的试纸条、样本提取管和口腔取样器按生物医疗废弃物进行处理。

结果

采用中国药品生物制品检定所HIV抗体参考品(唾液快速试剂)检定HIV患者，结果如表1。表1结果表明，使用实施例1的试剂条检测唾液HIV抗体的灵敏度为100％，特异性达到99.9％以上。

                         表1

实施例4 利用包含实施例1试纸条的测试卡检测唾液中HIV抗体的方法

利用包含实施例1试纸条的测试卡来检测唾液中HIV抗体，其是将实施例1的试纸条固定在有加样孔和检测孔的检测试剂盒中，将试纸条的样品垫对准加样孔，将检测区5和控制区6对准检测孔。将测试卡平放于台面上，并在检测孔的位置标记检测区5的T线和控制区6的C线位置。

用吸管吸取经处理的样本溶液垂直滴加4滴(约80μl)于加样孔中(图7、8)，即滴加到样品垫1上。15分钟后观察显示结果，30分钟后显示的结果无效。结果判读方法与实施例3相同。

Claims (9)

1.一种检测唾液中HIV抗体的试纸条，其特征在于，包括样品垫(1)、与所述样品垫(1)一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜(2)、与所述玻璃纤维膜(2)另一端紧密相连的硝酸纤维素膜(3)、以及与所述纤维素膜(3)的另一端紧密相连的吸水纸(4)，所述样品垫(1)、玻璃纤维膜(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸(4)均设置于底板(7)上，所述硝酸纤维素膜(3)包括包被有HIV重组抗原的检测区(5)和包被有羊抗兔抗体的控制区(6)，所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记兔IgG抗体，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物，所述微信号放大系统是通过如下方法制备得到的：

a、制备胶体金标记亲和素

将待标记亲和素预先在0.005mol/L pH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，然后4℃100000g离心1h，以0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金液的pH值至9～10，标记亲和素以形成胶体金标记亲和素；

b、制备生物素化抗人IgG抗体

先用6-氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，再使其与抗人IgG抗体结合，然后在碳二亚胺的作用下将其与N-羟基丁二酰胺进行缩和，生成长臂生物素N-羟基丁二酰亚胺酯，即为生物素化抗人IgG抗体，透析除去游离生物素；

c、完成微信号放大系统

将步骤a得到的胶体金标记亲和素和步骤b得到的生物素化抗人IgG抗体连接，得到胶体金-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物，经过洗涤处理后，即得微信号放大系统。

2.根据权利要求1所述的检测唾液中HIV抗体的试纸条，其特征在于，所述胶体金颗粒-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物的用量为0.65-0.9μg/cm²。

3.根据权利要求1所述的检测唾液中HIV抗体的试纸条，其特征在于，所述胶体金标记兔IgG抗体的用量为0.25-0.45μg/cm²。

4.根据权利要求1所述的检测唾液中HIV抗体的试纸条，其特征在于，所述HIV重组抗原为gp41和gp36，所述HIV重组抗原的用量为0.054-0.08μg/mm。

5.根据权利要求1所述的检测唾液中HIV抗体的试纸条，其特征在于，所述羊抗兔抗体为羊抗兔IgG抗体，所述羊抗兔抗体的浓度为4mg/ml，所述羊抗兔抗体的用量为0.09-0.22μg/mm。

6.一种检测唾液中HIV抗体的试剂卡，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的试纸条。

7.一种制备权利要求1所述的检测唾液中HIV抗体的试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)按常规方法制备抗人IgG抗体、HIV重组抗原、以及胶体金标记兔IgG抗体；

(2)制备微信号放大系统

a、制备胶体金标记亲和素

将待标记亲和素预先在0.005mol/L pH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，然后4℃100000g离心1h，以0.1mol/L K₂CO₃或0.1mol/L HCl调节胶体金液的pH值至9～10，标记亲和素以形成胶体金标记亲和素；

b、制备生物素化抗人IgG抗体

先用6-氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，再使其与抗人IgG抗体结合，然后在碳二亚胺的作用下将其与N-羟基丁二酰胺进行缩和，生成长臂生物素N-羟基丁二酰亚胺酯，即为生物素化抗人IgG抗体，透析除去游离生物素；

c、完成微信号放大系统

将步骤a得到的胶体金标记亲和素和步骤b得到的生物素化抗人IgG抗体连接，得到胶体金-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物，经过洗涤处理后，即得微信号放大系统；

(3)按稀释参数20cm²/ml～40cm²/ml，将步骤(2)的胶体金-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物、以及步骤(1)的胶体金标记兔IgG抗体喷洒到玻璃纤维膜上，干燥12个小时以上，备用；

(4)用包被缓冲液稀释HIV重组抗原，使其浓度为0.8mg/ml～1.5mg/ml，按膜液量0.16μl/mm～0.2μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥12个小时以上，备用；用包被缓冲液稀释羊抗兔抗体，使其浓度为1.0mg/ml～2.0mg/ml，按膜液量0.18μl/mm～0.22μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥12个小时以上，备用；

(5)将样品垫、步骤(3)的玻璃纤维膜、步骤(4)的硝酸纤维素膜、吸水纸按序粘贴于底板上，即得。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中胶体金-亲和素-生物素-抗人IgG抗体复合物的用量为0.65-0.9μg/cm²，所述胶体金标记兔IgG抗体的用量为0.25-0.45μg/cm²。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中HIV重组抗原的用量为0.054-0.08μg/mm；所述羊抗兔抗体的浓度为4mg/ml，用量为0.09-0.22μg/mm。

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