CN105137081A - 一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测试纸条 - Google Patents

一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，它包括衬板，衬板的一面自上而下依次黏贴吸水纸、检测垫、金标垫1(放大)、金标垫2(检测)和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。所述检测垫为硝酸纤维素膜，该膜自上而下设计1条质控线和3条检测线；所述质控线包被有兔抗鼠IgG；所述检测线包被有吡虫啉包被半抗原-鸡卵清白蛋白偶联物；所述金标垫1(放大)为玻璃纤维素膜，喷涂有亲和素标记的纳米金颗粒；所述金标垫2(检测)为玻璃纤维素膜，喷涂有纳米金标记的抗吡虫啉单克隆抗体，该单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC？NO：C201509的杂交瘤细胞株CH3分泌产生的单克隆抗体。该试纸条对吡虫啉的检测区间为0-5ng/mL(阴性)，5-25ng/mL，25-250ng/mL，250-1000ng/mL以及大于1000ng/mL，可用于叶菜类蔬菜中吡虫啉残留量的半定量快速测定。

Description

一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测试纸条
技术领域
本发明涉及可分泌抗吡虫啉的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体，以及一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条。
背景技术
吡虫啉，1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺，属于新烟碱类杀虫剂，毒性中等，通过作用于昆虫的乙酰胆碱酯酶受体而使害虫麻痹，最终死亡。近年来，吡虫啉已经广泛应用于水稻、棉花、茶树、大豆、烟草等作物上来防治飞虱、蚧壳虫、白粉虱等农业害虫。良好的防治效果使其在农业生产中被大量使用，但是不当使用对环境和人类健康造成较大威胁，因此对农产品中吡虫啉残留的检测十分必要。
目前，对吡虫啉残留检测多采用气相色谱法、高效液相色谱法等方法。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。
化学农药的免疫检测方法具有快速、廉价、简便、特异的优点，便携而有利于进行现场监测，克服了传统检测方法的缺点。免疫金标试纸条时近年来迅速发展的农药快速免疫检测技术。但传统的试纸条因胶体金层析方法的固有局限性而显的灵敏度不够，以及仅用于定性检测，或在仪器的协助下的定量检测。为克服传统试纸条上述不足，该发明在单克隆抗体的基础上，利用金放大增敏技术，建立了针对农产品中吡虫啉残留量半定量检测的试纸条，该试纸条对吡虫啉农药的检测区间为0-5ng/mL(阴性)，5-25ng/mL，25-250ng/mL，250-1000ng/mL以及大于1000ng/mL，可用于叶菜类蔬菜中吡虫啉残留量的现场半定量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种可稳定分泌抗吡虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种基于单克隆抗体的吡虫啉半定量检测金放大试纸条。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
本发明提供提供了杂交瘤细胞株CH3，该细胞株已于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO.C201509。
识别吡虫啉的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCNO.C201509的杂交瘤细胞株CH3分泌产生。
本发明提供的抗吡虫啉纯化抗体来自于BALB/C小鼠腹腔。该小鼠经过液体石蜡预处理后，注射杂交瘤细胞株CH3，并采集该小鼠的腹水，利用辛酸-硫酸铵法进行纯化，收集得到抗吡虫啉单克隆抗体。该单克隆抗体可用于识别吡虫啉农药，对吡虫啉的IC50为0.1ng/mL。
本发明提供一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：它包括衬板，衬板的一面自上而下依次黏贴吸水纸、检测垫、金标垫1(放大)、金标垫2(检测)和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。所述检测垫为硝酸纤维素膜，该膜自上而下设计1条质控线和3条检测线；所述质控线包被有兔抗鼠IgG；所述检测线包被有吡虫啉包被半抗原-鸡卵清白蛋白偶联物；所述金标垫1(放大)为玻璃纤维素膜，喷涂有亲和素标记的纳米金颗粒；所述金标垫2(检测)为玻璃纤维素膜，喷涂有纳米金标记的抗吡虫啉单克隆抗体。
本发明提供的一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：所述3条检测线自上而下分别包被了浓度为0.05，0.08，0.21mg/mL的吡虫啉半抗原-鸡卵清白蛋白偶联物，其在检测垫上的喷涂速度为0.75μl/cm。
本发明提供的一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：所述的金标垫1(放大)上喷涂有亲和素标记的纳米金颗粒，纳米金颗粒大小为40nm，亲和素的浓度为0.46mg/mL，在金标垫1(放大)上喷涂的速度为7.2μl/cm。
本发明提供的一种基于单抗抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，可用于叶菜类蔬菜中吡虫啉残留量的半定量在线检测，该试纸条对吡虫啉农药的检测区间为：0-5ng/mL(阴性)，5-25ng/mL，25-250ng/mL，250-1000ng/mL以及大于1000ng/mL。
本发明提供的一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，可用于叶菜类蔬菜中吡虫啉残留的在线半定量检测，其稳定性较好，操作方便。在添加回收及田间残留实验中，本发明提供的试纸条检测结果与仪器分析(HPLC)检测结果相一致。
有益效果
(1)本发明提供的基于单克隆抗体的吡虫啉检测试纸条，利用生物素-亲和素亲和力强以及纳米金颗粒的信号增大效应，可大大提高检测灵敏度，与使用相同抗体的传统试纸条相比，灵敏度可提高10倍。
(2)本发明提供的基于单克隆抗体的吡虫啉检测试纸条，可实现叶菜类蔬菜的在线半定量检测，操作简便，携带方便，可摆脱对仪器的依赖。
附图：
图1：本发明提供的金放大试纸条与传统试纸条的效果比较图，其中椭圆形代表的是可视检测限，圆柱方框代表的是完全消线的吡虫啉浓度。
图2：本发明提供的金放大试纸条对吡虫啉的半定量检测效果图，其中可视检测限为5ng/mL，对吡虫啉的检测区间可划分为0-5ng/mL(阴性)，5-25ng/mL，25-250ng/mL，250-1000ng/mL以及大于1000ng/mL。
图3：本发明提供的金放大试纸条对田间叶菜类蔬菜上吡虫啉残留量的检测效果
具体实施方式
实施例1：纳米标签的合成
1.抗吡虫啉单克隆抗体-生物素标签的合成
将抗吡虫啉单克隆抗体在碳酸盐缓冲液(0.05M，包含15mMNa2CO3，35mMNaHCO3，pH＝9.6)中透析4小时。将5mg/mL抗体与分子数20倍于抗体的生物素二甲亚砜溶液混合。将混合液在室温下搅拌6小时，稳定后在0.01MPBS缓冲液中进行透析。透析液即为抗吡虫啉抗体-生物素标签，保存于4℃下待用。
2.纳米金-抗体-生物素标签的合成
用0.2M的K2CO3调整纳米金溶液的pH值至9.0；利用盐沉淀方法确定纳米金与抗吡虫啉抗体-生物素标签的分子数比例。在快速搅拌胶体金的同时，按照特定比例逐滴加入抗吡虫啉抗体-生物素标签，并在室温下孵育1小时。孵育后，反应液加入10％的BSA溶液(BSA终浓度为1％)，并持续搅拌5分钟。搅拌停止后，继续在室温下孵育1小时。孵育后，将反应液在10,000g的转速下离心25分钟，沉淀物用硼酸缓冲液(包含0.01M硼酸，2％BSA，3％蔗糖，0.02％叠氮化钠)。
实施例2：试纸条的组装
一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：它包括衬板，衬板的一面自上而下依次黏贴吸水纸、检测垫、金标垫1(放大)、金标垫2(检测)和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。所述检测垫为硝酸纤维素膜，该膜自上而下设计1条质控线和3条检测线；所述质控线包被有兔抗鼠IgG；所述检测线包被有吡虫啉包被半抗原-鸡卵清白蛋白偶联物；所述金标垫1(放大)为玻璃纤维素膜，喷涂有亲和素标记的纳米金颗粒；所述金标垫2(检测)为玻璃纤维素膜，喷涂有纳米金标记的抗吡虫啉单克隆抗体。
上述吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：所述3条检测线自上而下分别包被了浓度为0.05，0.08，0.21mg/mL的吡虫啉半抗原-鸡卵清白蛋白偶联物，其在检测垫上的喷涂速度为0.75μl/cm。
上述基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：所述的金标垫1(放大)上喷涂有亲和素标记的纳米金颗粒，纳米金颗粒大小为40nm，亲和素的浓度为0.46mg/mL，在金标垫1(放大)上喷涂的速度为7.2μl/cm。
实施例3：试纸条对吡虫啉农药的检测区间确定
将吡虫啉农药配成梯度浓度的5％甲醇dPBST溶液：0，2，5，10，25，125，250，500，1000和2000ng/mL。将配成的梯度浓度的吡虫啉溶液作为层析液滴入样品的上样区，层析10分钟后进行试纸条检测区域的颜色观察。通过检测线上颜色的有无及深浅，可得到该试纸条对吡虫啉的检测区间为：0-5ng/mL(阴性)，5-25ng/mL，25-250ng/mL，250-1000ng/mL以及大于1000ng/mL。
实施例4：试纸条在叶菜类蔬菜中田间吡虫啉残留检测的应用
1.田间施药与采样
将市售吡虫啉可湿性粉剂(1.7％)用水稀释后，喷洒到小青菜田间。农药喷洒后，分别于撒药后2小时、1天、2天、3天、5天、7天、10天和14天田间采样，并经样品处理后在试纸条上进行检测。检测结果与HPLC分析结果进行比较。
2.样品处理
将小青菜样品(5g)切碎后，加入8mL甲醇-水(70∶30，v/v)溶液，搅拌5分钟后室温下静止30分钟。静止后，将混合液转移至滤纸上，并进行过滤萃取。滤液转移至10mL容量瓶中并定容至10mL。定容液用层析工作液稀释后即可用试纸条进行检测。同时，所有在试纸条上检测样品均用HPLC进行验证。
检测结果表明，试纸条检测数据与HPLC数据相一致。

Claims (7)

1.一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：它包括衬板，衬板的一面自上而下依次黏贴吸水纸、检测垫、金标垫1(放大)、金标垫2(检测)和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。所述检测垫为硝酸纤维素膜，该膜自上而下设计1条质控线和3条检测线；所述质控线包被有兔抗鼠IgG；所述检测线包被有吡虫啉包被半抗原-鸡卵清白蛋白偶联物；所述金标垫1(放大)为玻璃纤维素膜，喷涂有亲和素标记的纳米金颗粒；所述金标垫2(检测)为玻璃纤维素膜，喷涂有纳米金标记的抗吡虫啉单克隆抗体，该单克隆抗体为由保藏编号为CCTCCNO：C201509的杂交瘤细胞株CH3分泌产生的单克隆抗体。
2.权利要求1所述一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：所述3条检测线自上而下分别包被了浓度为0.05，0.08，0.21mg/mL的吡虫啉半抗原-鸡卵清白蛋白偶联物，其在检测垫上的喷涂速度为0.75μl/cm。
3.权利要求1所述一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：所述的金标垫1(放大)上喷涂有亲和素标记的纳米金颗粒，纳米金颗粒大小为40nm，亲和素的浓度为0.46mg/mL，在金标垫1(放大)上喷涂的速度为7.2μl/cm。
4.权利要求1所述一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：所述的金标垫2(检测)上喷涂有纳米金标记的抗吡虫啉单克隆抗体，纳米金颗粒大小为40nm，单克隆抗体的浓度为0.56mg/mL，在金标垫2(检测)上喷涂的速度为6.6μl/cm，单克隆抗体上标记生物素。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征是：由保藏编号为CCTCCNO：C201509的杂交瘤细胞株CH3分泌。
6.根据权利要求1所述的一种基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，其特征在于：所述的试纸条对吡虫啉农药的检测区间为0-5ng/mL(阴性)，5-25ng/mL，25-250ng/mL，250-1000ng/mL以及大于1000ng/mL。
7.产生权利要求5所述的分泌抗吡虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株CH3，于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201509。
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