CN101495865A

CN101495865A - 口腔流体快速免疫层析检测

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Publication number: CN101495865A
Application number: CNA2005800498092A
Authority: CN
Inventors: 约翰·迈克尔·恩尼斯; 保罗·罗伯特·史密斯; 罗纳德·威廉·明克; 詹姆斯·理查德·乔治; 托比·德沃拉赫·戈特弗里德; 格伦·迈克尔·福德
Original assignee: Calypte Biomedical Corp
Current assignee: Beijing Marr Bio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2009-07-29
Anticipated expiration: 2025-05-20
Also published as: EP1882184A4; US20110003310A1; WO2006122450A8; MX2007014476A; BRPI0520182A2; EP1882184A1; WO2006122450A1; CN101495865B

Abstract

本发明涉及口腔流体快速免疫层析检测。更具体地，本发明涉及与用于检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析试条相分离的口腔流体收集拭子，其基本上由样品垫、偶联物垫、检测区和对照区垫组成，所述垫由至少一种基质材料制成，其中所述偶联物垫位于所述样品垫下游，并且用偶联物在其上划条纹；检测和对照区垫位于偶联物垫下游，其中所述检测区固定有与靶分析物特异性结合的特异性结合试剂；检测区下游的对照区固定有第二捕获试剂。本发明还涉及生产所述试条的方法、通过使用所述试条检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析方法、以及包含此试条的试剂盒。

Description

口腔流体快速免疫层析检测

技术领域

本发明涉及口腔流体快速免疫层析检测。更具体地，本发明涉及用于检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析检测试条，收集口腔流体标本的方法，生产所述试条的方法、通过使用该试条检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析方法、以及含有此试条的试剂盒。

背景技术

人们已经开发了许多定性或定量检测生物体组织和流体中各种分析物的分析方法。当前多数诊断检测是采用血液、尿、粪便、活组织检查或口腔流体。与其它物质相比，收集口腔流体唾液和/或口腔粘膜渗出物用于检测带来相对较少的隐私侵犯，其相对安全，并可相对容易地快速完成。

迄今，为开发用于口腔流体的收集、传送和样品处理的测试条以及为开发基于口腔流体的分析，尤其是对各种抗体和代谢物的分析，人们已付出了很多努力。

例如，WO 88/07680公开了通过复杂的放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫分析法(ELISA)等定性或定量检测人或动物体液(选自唾液、眼泪、精液、尿和脑脊液)中特定IgM、IgG和IgA的存在或其量的方法，所述方法相对难以进行，费时且花费多。

美国专利No.5,103,836公开了一种从口腔收集物质用于检测的方法，其包括以下步骤：将以高渗盐溶液浸透的吸收垫插入口腔，其中高渗溶液的盐在垫中的浓度可以有效地从口腔中回收高浓度的所述物质；从口腔中移除所述垫；保存该垫以随后从垫中取出所收集物质用于ELISA。在本公开文件中公开的吸收垫需要用高渗溶液预处理以提供高浓度的分析物，且再次使用复杂的ELISA来检测分析物。

美国专利No.6,303,081公开了用于从口腔收集和转运水性流体到用于检测的侧向层析试条的检测试条。侧向层析试条置于外罩(housing)内并沿外罩中限定的腔伸展。向所述侧向层析试条提供至少一个检视(inspection)部位以实现在侧向层析试条上所选部位检视测试结果。多孔芯条(wick)材料在一端从所述外罩伸出到外罩外部的收集部位，在另一端与所述侧向层析试条相通。所述多孔芯条材料具有微粒构造，所述微粒吸附水性口腔流体以将该流体从口传送到所述侧向层析试条而基本上没有吸收。该多孔芯条材料容易将口腔流体释放到侧向层析试条。由于该多孔芯条材料的迂回流路，自然防止从侧向层析试条到口腔的反向流动。咬合板(bite plate)与所述外罩相连并可插入患者牙齿间以将多孔芯条定位于口腔中来收集口腔流体。所述咬合板通常通过牙齿咬合力(occlusal force)被保持在适当位置以将多孔芯条定位于口腔空间中。当检测试条在口中时，通过观察侧向层析试条迅速得到检测结果。在美国专利申请No.2002/0192839、美国专利申请No.2002/0155029中均公开了用于一步收集口腔流体以检测和/或定量口腔流体中分析物的改进的检测试条和方法，这些专利或申请的内容均以其整体通过参考并入本文。

尽管通过上述检测试条的分析法具有直接、快速且不需要复杂步骤的优点，但对于检测对象而言，在整个检测过程中都要咬合检测试条是不方便的。此外，对于具有“无效”指示的分析，在无效结果需要重新检测时，或者对于比如HIV这样的常规需要对收集标本进行确认检测的诊断检测而言，对象将不得不一而再再而三地为检测而咬合检测试条。然而，应当指出，在初次收集后长达一小时，口腔粘膜渗出物的收集通常减少口腔组织表面可得的富含IgG的渗出物，这将使随后收集以使用“一站式样品收集器/检测组合”重新检测不够方便，因为检测对象必须等到渗出物水平更高，否则用样品来检测风险可能会有更低的灵敏度(R.Mink，未出版数据)。

发明内容

本发明是谨记现有技术中存在的上述缺点而做出的，本发明的一个目的是提供一种简单、方便且有成本效益的用侧向免疫层析试条的口腔流体收集方法，其适于灵敏和快速地检测口腔流体中分析物。

本发明的另一个目的是提供一种生产所述侧向流免疫层析检测试条的方法。

本发明的另外一个目的是提供一种适于灵敏和快速地检测口腔流体中分析物的灵敏方法。

本发明的另外一个目的是提供用于灵敏和快速地检测口腔流体中分析物的试剂盒。

因此，在第一个方面，本发明提供一种用于检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析检测试条，其基本上由样品垫、偶联物垫、检测区和对照区垫组成，所述垫由至少一种基质材料制成，其中所述偶联物垫位于样品垫的下游且其上用偶联物划条纹，所述检测区和对照区垫位于该偶联物垫的下游且包含检测区和对照区，其中检测区固定有特异性结合试剂，所述特异性结合试剂特异性地与靶分析物结合；且对照区固定有第二捕获试剂。

在此方面的一个实施方案中，待检测分析物选自抗以下抗原的抗体：传染性疾病、激素、生长因子、治疗药物、滥用药物及滥用药物的代谢产物。

在另一个实施方案中，所述基质材料选自无机粉末，比如二氧化硅和氧化铝；玻璃纤维滤纸；天然聚合材料尤其是基于纤维素的材料、层析纸；合成或改性的天然聚合物比如硝酸纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖；以及其组合。

在另一个实施方案中，样品垫的基质材料为玻璃纤维滤纸；偶联物垫的基质材料为聚酯材料；检测垫和对照垫的基质材料为硝酸纤维素膜。

在另一个实施方案中，偶联物包含与第一捕获试剂偶联的标记物，所述第一捕获试剂捕获口腔流体中内源性抗体。所述标记物选自胶体金颗粒；元素或金属溶胶颗粒，包括硒、银、铁或碳；其它珠状颗粒，包括有色乳胶、脂质体和染料颗粒。优选地，所述标记物为胶体金颗粒。

在另一个实施方案中，所述第一捕获试剂选自：抗IgG、IgM或IgA的抗体，蛋白A，蛋白G和伴刀豆球蛋白A。优选地，所述第一捕获试剂为蛋白A。

在另一个实施方案中，所述特异性结合试剂选自以下的抗原：传染性疾病、激素、生长因子、治疗药物、滥用药物及滥用药物的代谢产物。

在另一个实施方案中，传染性疾病的抗原为代表HIV蛋白免疫决定区的重组或合成肽，所述HIV蛋白尤其是选自HIV-1的gpl20和gp41以及HIV-2的gp36的HIV包膜蛋白。

在另一个实施方案中，第二捕获试剂选自：抗IgG、IgM或IgA的抗体、蛋白A、蛋白G和伴刀豆球蛋白A，其中所述抗IgG的抗体为山羊抗人IgG抗体。

在第二个方面，本发明提供生产权利要求1-17中任一项所定义的侧向流免疫层析检测试条的方法，其包括：a)将偶联物在偶联物垫上划条纹；b)将所述特异性结合试剂固定到检测区和对照区垫的检测区上；c)将第二捕获试剂固定于检测区和对照区垫的对照区上；d)用封闭剂封闭所述每个垫；以及e)对齐所得垫使得相互之间流体连通。

在一个实施方案中，在划条纹之前，偶联物在简单或复合糖溶液中被稳定化，其中所述糖溶液包含蔗糖、海藻糖、锡酸钾以及过氧化氢脲。

在另一个实施方案中，使用生物素/链亲合素连接子将所述特异性结合试剂固定于检测区和对照区上。

在另一个实施方案中，使用生物素/链亲合素连接子将所述特异性结合试剂固定于对照区上。

在另一个实施方案中，所述封闭剂包含非离子型、阳离子型、阴离子和两性离子型的去污剂；糖，包括蔗糖、果糖；或蛋白质，包括牛血清白蛋白、动物全血清、酪蛋白和脱脂奶粉。

在另一个实施方案中，动物全血清为胎牛血清。在另一个实施方案中，动物全血清为选自鹅血清、火鸡血清和鸡血清的鸟类血清。

在第三个方面，本发明提供用于检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析方法，其包括：(a)使用与由权利要求1-17中任一项所定义的侧向流免疫层析测试试条分开的收集器收集口腔流体；(b)将收集器投入一定体积的样品缓冲液中以将口腔流体释放到缓冲液中而得到混合物；(c)将前述权利要求中任一项所定义的侧向流免疫层析测试试条放入所述混合物中；和(d)通过观察对照区信号的存在以确定检测的有效性，并且通过在检测开始后15-60分钟内观察检测区中信号的存在来确定分析物的存在。

在另一个实施方案中，在步骤(a)中的收集器是未处理过的聚酯拭子(swab)，例如Texwipe Large Alpha Swab TX714A。

在另一个实施方案中，样品缓冲液为pH 7.2+/-0.2的磷酸钾缓冲溶液，其还包含0.15M氯化钠、0.1％Triton X-100、15％热灭活鸡血清、30μg/ml亲合素、0.2％Tween 80、0.2％Tetronic T-904以及0.0.285％(活性成分)ProClin 950。

在另一个实施方案中，样品缓冲液的体积为1000μl。

在另一个实施方案中，所述方法还包括在步骤(b)和步骤(c)之间取出混合物试样的步骤，其中所述试样的体积为200μl。

在另一个实施方案中，所述信号为有色线，如微红色(reddish)线。

在另一个实施方案中，在20-45分钟内观察所述信号。

在第四个方面，本发明提供用于检测口腔流体中分析物的试剂盒，其包括至少一种上述侧向流免疫层析检测试条。所述检测试条封闭于干燥容器内。每一试剂盒可任选地包括样品缓冲液、口腔流体收集器、提供所附试条使用指导的包装插页、含有用于对检测试条进行质量检测的阳性和阴性对照的小管(vial)、可用于确定本发明测定何时完成的计时器、和/或生物危险物处理容器。

在本方面的一个优选实施方案中，样品缓冲液为pH 7.2+/-0.2的磷酸钾缓冲溶液，其还包含0.15M氯化钠、0.1％Triton X-100、15％热灭活鸡血清、30μg/ml亲合素、0.2％Tween 80、0.2％Tetronic T-904以及0.0285％(活性成分)ProClin 950。

在另一个实施方案中，收集器是未处理过的聚酯拭子，例如TexwipeLarge Alpha Swab TX714A。

因此，本发明的一个优点是设计的简单性和材料的低成本，这是由于缺少外罩，比如这可见于其它口腔流体快速检测(例如参见美国专利6303081、美国专利申请20020155029和20020192386)以及其它快速侧向流检测(美国专利6,303,081、5,935,864、6,485,982、6,534,320、6,352,862、6,187,598和6,027,943)中。这不仅使得产品制造的成本更低，而且还提供了更低复杂性的制造工艺复杂性，这进一步降低了成本。

本发明的另一个优点在于该分析自身独立于样品收集器(例如在美国专利6303081、美国专利申请20020155029和20020192839以及美国专利5935864中)，这使得使用者在不需另外收集的情况下对标本进行多次检测。这在具有“无效”指示的侧向流免疫层析测定中尤其有利，其中无效的结果需要重新检测，或者对于例如HIV这样常规需要对所收集标本进行确认检测的诊断检测也是尤其有利，因为在初次收集后长达一小时，口腔粘膜渗出物收集通常减少口腔组织表面可用的富含IgG的流出物，使得随后收集以用“一站式样品收集器/检测组合”进行重新检测不够方便。

本发明进一步的优点在于与其它口腔流体检测(例如美国专利6,303,081)相比，所述口腔流体快速免疫层析试条非常紧凑(例如5mm×1mm×75mm)，这使得运输和储存成本降低。

本发明的另一个优点在于所述口腔流体收集方法提供了足够用于其它检测判断比如确证性检测的体积。

本发明进一步的优点在于相比于其它口腔流体检测(例如美国专利6,303,081)而言生产的复杂性降低，因为在侧向流层析试条周围不必配置外罩，这导致材料成本和加工时间均得以降低。

附图说明

图1举例说明根据本发明一个优选实施方案的口腔流体快速免疫层析检测的程序，其中图1-1至1-15举例说明检测的步骤。

图2举例说明根据本发明一个优选实施方案，口腔流体快速免疫层析检测的三种可能结果，其中图2A、2B和2C分别代表阴性、阳性和无效的结果。

优选实施方案的描述

通过对以下优选实施方案的详细描述并结合附图，可更好地理解本发明。

在第一个方面，本发明提供一种用于检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析检测试条，其基本上由样品垫、偶联物垫、检测区和对照区垫组成，所述垫由至少一种基质材料制成，其中偶联物垫位于样品区垫的下游，且用偶联物在其上划条纹，所述检测区和对照区垫位于该偶联物垫的下游，并且在检测区固定有与靶分析物特异性结合的特异性结合试剂，在对照区固定有第二捕获试剂。

所述样品垫接收口腔流体样品。样品垫通常由表现出低的靶抗体保留的材料构成。在一些实施方案中，样品垫也可起到机械过滤器的作用，其可捕获任何不需要的颗粒物比如灰尘、碎片、沉淀、粘液或血液。

所述偶联物垫位于样品垫的下游并含有偶联物，所述偶联物包含直接或间接与第一捕获试剂偶联的标记物。

所述检测区位于偶联物垫的下游并含有特异性结合试剂，所述特异性结合试剂特异性地与靶抗体结合，借此，标记的偶联物能被固定于基质。

所述对照区位于流路中检测区的下游。对照区含有第二捕获试剂，所述第二捕获试剂捕获被第一捕获试剂捕获的抗体，且优选地被固定在对照区内以形成对照线，所述对照线浓缩任何被第二捕获试剂结合的标记抗体偶联物。

如本文中所用，术语“口腔流体”指单独或组合发现于口腔内的一种或多种流体。其包括但不限于唾液和口腔粘膜渗出物。应该知道，口腔流体可包括来自多种来源(例如附属腺体腮腺、颌下腺、舌下腺，齿龈粘膜和口腔粘膜)的流体的组合，且术语口腔流体包括来自每一种单独或组合的这些来源的流体。术语唾液指口腔流体的组合，例如通常见于口腔，尤其是在咀嚼后。如本文中所用，术语“口腔粘膜渗出物”指通过血清组分从口腔粘膜空隙向口腔中被动扩散而产生的流体。口腔粘膜渗出物常常形成唾液的一种组分。

如本文中所用，术语“分析物”用于指在特定分析中待检测的部分。通常在本发明分析中检测的分析物包括但不限于抗以下抗原的抗体：传染性疾病、激素、生长因子、治疗药物、滥用药物及滥用药物的代谢产物。特别优选的分析物包括抗传染性疾病的抗原的抗体，所述传染性疾病比如HIV、肝炎等。抗原可以是但不限于比如乙型肝炎抗原，抗体可以是但不限于HIV的抗体、HTLV的抗体、幽门螺杆菌的抗体、肝炎的抗体、麻疹的抗体、腮腺炎的抗体和风疹的抗体。治疗药物和滥用药物或滥用药物的代谢产物可以是但不限于四氢大麻酚、烟碱、乙醇、茶碱、苯妥英、对乙酰氨基酚、锂、安定、去甲替林(nortryptyline)、司可巴比妥、苯巴比妥。激素可以是但不限于睾酮、雌二醇、17-羟基孕酮、孕酮、甲状腺素、促甲状腺激素、促卵泡激素和促黄体生成激素。

如本文中所用，“特异性结合试剂”是与靶分析物特异性结合的试剂，如上所述，所述靶分析物选自以下抗原：传染性疾病、激素、生长因子、治疗药物、滥用药物及滥用药物的代谢产物。

如本文中所用，“抗原”是一种当其被引入哺乳动物或鸟类中时刺激抗体生成的物质。本发明优选的抗原包括人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白质，特别是病毒包膜蛋白HIV-1的gp120和gp41、以及HIV-2的gp36。

如本文中所用，“抗体”指由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一或多个多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε以及μ恒定区基因，以及极大量的免疫球蛋白可变区基因。抗体的轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其进而决定免疫球蛋白的类型分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

已知抗体(也称免疫球蛋白)的基本结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个轻链(约25kD)和一个重链(约50-70kD)。每个链的N端定义一个主要负责抗原识别的约100到110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变区轻链(V_L)和可变区重链(V_H)分别指这些轻链和重链。

抗体可作为完整的免疫球蛋白或作为通过以各种肽酶消化而产生的大量良好表征的片段而存在。因此，例如胃蛋白酶区域产生F(ab’)₂，F(ab’)₂是Fab的二聚体，Fab自身为通过二硫键与V_H-V_H1相连的轻链。F(ab’)₂可在温和条件下被还原以破坏绞链区的二硫键连接从而将F(ab’)₂二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本上是具有铰链区一部分的Fab(关于其它抗体片段的更详细描述参见Fundamental Immunology，W.E.Paul，Ed.，Raven Press，N.Y.，1993)。虽然各种抗体片段是根据完整抗体的消化而定义的，但技术人员将会知晓这样的Fab’片段可通过化学或通过利用重组DNA方法从头合成。因此，如本文中所用术语抗体还包括抗体片段，所述抗体片段通过修饰完整抗体而产生或使用重组DNA方法从头合成。

如本文中所用，术语“基质”指能支持流体流动的不溶性材料。基质材料可为天然来源的和/或合成来源的，吸水的(bibulous)或不吸水的、纤维状的或颗粒状的。本发明的基质可形成为相同材料或不同材料混合物的连续条带，所述不同材料沿着共同条带连续分布，或者不连续分布以形成在条带不同区域具有不同物理或化学性质的区带。作为替代，可由相同或不同的基质材料形成一系列离散的垫，并将用于测定的试剂加到每个垫上。然后可将垫放置成彼此流体连通以形成连续的流路。用于构建本发明基质的材料可为惰性的或可与一种或多种本发明的试剂反应，前提是所述材料在实施本文所述发明中仍是不溶性的。基质材料可选自无机粉末，比如二氧化硅和氧化铝；玻璃纤维滤纸；天然聚合材料特别是基于纤维素的材料比如滤纸、层析纸；合成或改性的天然聚合物比如硝酸纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖；以及其组合。在一个优选的实施方案中，所述基质为硝酸纤维素膜。

在本发明另一个优选的实施方案中，玻璃纤维滤纸用作样品垫的基质，聚酯材料用作偶联物垫的基质，硝酸纤维素膜用作检测区和对照区垫的基质。

“吸水的”(bibulous)指某些吸收性材料在流体流经该材料期间支持差异性不同溶质迁移速率的能力。因此，具有吸水性质的吸收性材料能基于物理和/或化学性质将溶质进行层析分离。

如本文所使用的，术语“标记物”指直接或间接地通过分析物特异性结合伴侣与分析物特异性结合的可检测原子或分子结构。本发明的标记物可以被物理或化学检测。优选的标记物是当结合时对裸眼可见的，以指示阳性检测结果。本发明的标记物选自胶体金颗粒；元素或金属溶胶颗粒，包括硒、银、铁或碳；其它珠状颗粒，包括有色乳胶、脂质体、以及染料颗粒；在本发明一个优选的实施方案中，所述标记物为胶体金颗粒。这些标记物是本领域中所熟知的，并被描述在例如G.FrensNature，241，20-22(1973)和美国专利No.4,313,734中，其公开内容以其整体通过参考引入本文中。

用在本发明中的“胶体金”指微细金颗粒的溶胶，其能够无限地保持于水性悬液中。

如本文中所使用，“捕获试剂”是特异性地结合到靶抗体的任何分子。本发明的捕获试剂优选地以确定模式固定于基质，典型地为与流路垂直的线。优选的捕获试剂是抗IgG、IgM或IgA的抗体；蛋白A、蛋白G或伴刀豆球蛋白A。

如本文中所使用，本发明的“第一捕获试剂”是与标记物偶联的捕获试剂。优选地，所述第一捕获试剂是抗IgG、IgM或IgA的抗体；蛋白A、蛋白G或伴刀豆球蛋白A。在一个更优选的实施方案中，蛋白A或蛋白G与标记物偶联，形成偶联物。

用在本发明中的“蛋白A”指由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)产生的高度稳定的表面受体，其能与大量物种的免疫球蛋白尤其是IgG的Fc部分相结合(Boyle，M.D.P.and K.J.Reis.Bacterial FcReceptors.Biotechnology 5：697-703，1987)。一个蛋白A分子能同时结合至少2个IgG分子(

，J.，Meloun，B.and Hjelm，H.Protein Ais isolated from Staphylococcus aureus after digestion with lysostaphin.Eur J Biochem 29：572-578，1972)。

用在本发明中的“蛋白G”指来自链球菌的以高亲和力与IgG结合的细胞表面相关蛋白。其具有三个高度同源的IgG结合结构域(参见Lian，et al.，1992.Journal of Mol.Biol.228：1219-1234和Derrick andWigley.1994.Journal of Mol.Biol.243：906-918)。

如本文中所用，“第二捕获试剂”是固定于对照区以捕获被第一捕获试剂所捕获之抗体的捕获试剂。合适的本发明第二捕获试剂是抗IgG、IgM或IgA的抗体、蛋白A、蛋白G或伴刀豆球蛋白A。在一个更优选的实施方案中，所述第二捕获试剂包括来自不同于提供口腔流体之物种的抗IgG抗体。甚至更优选地，此第二捕获试剂是抗人IgG抗体；最优选地，此第二捕获试剂是山羊抗人IgG抗体。

如本文中所用，“流路”指当口腔流体样品经过基质时所经的路线。所述流路优选为单一路线，但可包括几条路线，其中每条路线相对于其它路线而言可以同时、依序或独立地支持液体流动。

“下游”指液体通过基质时远离液体施加点的定向流路。

“上游”指液体通过基质时朝向液体施加点的定向流路。

在第二个方面，本发明提供生产侧向流免疫层析检测试条的方法，其包括：a)将偶联物在偶联物垫上划条纹；b)将特异性结合试剂固定到检测区和对照区垫的检测区并将第二捕获试剂固定到对照区；c)用封闭剂封闭每个垫；和e)对齐所得垫使得相互之间流体连通。

将偶联物在偶联物垫上划条纹

偶联物以下述方式沉积在偶联物垫的基质中：当其与口腔流体样品接触时，其在流体流中很容易迁移。为实现此点，偶联物垫的基质由网状粘合(spun-bonded)的聚酯制成。将偶联物与划条纹溶液一起利用例如接触尖端或气溶胶尖端在垫上划条纹。在划条纹之前，优选将偶联物稳定化。例如，可在20％蔗糖、5％海藻糖和0.1％过氧化氢脲中将偶联物稳定化。

当口腔流体样品流经偶联物垫时，偶联物被溶解并加入通过检测试条的流体流。

将特异性结合试剂固定到检测区

使用本领域技术人员所知的方法，适用于本发明的特异性结合试剂可从任何来源包括天然、化学合成或重组生产而获得。例如，优选的SEQ ID No.1至5的肽部分可使用固相肽合成技术化学合成，或通过可操作性将编码期望肽的核酸连接到表达载体中并在合适宿主中表达所述核酸而进行重组生产。一旦分离，可使用已知技术将所述肽生物素化。

可使用任何本领域技术人员所知的方法将合适的抗原固定到基质，所述方法不破坏抗原对靶抗体的特异性结合。优选地，对于重组蛋白抗原而言，抗原不经进一步修饰而被直接固定到基质上。优选地，使用生物素/链亲合素连接子将合成肽抗原固定到基质上，最优选地，将抗原偶联到生物素并与链亲合素复合，然后将链亲合素偶联到基质。对于吸水性基质，使用本领域技术人员公知的技术，通常在封闭之前将复合物的链亲合素偶联到基质。优选地，在含有至少4∶1比率的链亲合素结合位点等价物对比每一生物素结构的溶液中实现偶联，尽管其它比率比如0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1和5∶1以及所有中间(分数)比率也包括在内，作为本发明的一部分。对于吸水性基质，最终复合物可简单地施加到基质材料并干燥，随后用用合适的封闭剂进行封闭。具有足够高分子量而可以直接与基质结合的合适抗原比如很多重组蛋白不必通过生物素/链亲合素连接子的方法来附着。适用于本发明的示例性抗原肽的氨基酸序列见于SEQ ID No：1至5。

将抗原固定到基质优选以用于浓缩标记抗体偶联物的方式进行，所述抗体偶联物特异性地结合固定化抗原。通过浓缩标记的抗体偶联物，由标记物产生的信号被强化，从而提高灵敏度并尽可能减小获得错误结果的可能性。

将第二捕获试剂固定到对照区上

对照区含有第二捕获试剂，且优选被固定在对照区内以形成浓缩标记物偶联物的对照线。采用已知技术，包括上述用于固定化抗原的技术，将适用于本发明的第二捕获试剂固定到基质。可使用生物素/链亲合素连接子将第二捕获试剂固定到基质，在此情况下，最优选地，如上所述，在将链亲合素偶联到基质之前将第二捕获试剂偶联到生物素并以链亲合素与之符合。优选地，捕获试剂比如山羊抗人IgG F(ab’)₂可不使用生物素/链亲合素连接子而被直接固定到基质上。

将垫用封闭剂封闭

尽管可使用固有吸水性的基质材料制作本发明的垫，但流经本发明检测试条的流体流动优选在本质上为非吸水性的。

通过应用封闭剂，可将吸水性材料转化为表现出非吸水性流动特性的材料。这些封闭剂可为去污剂、糖或蛋白质，其可阻碍产生吸水特性的相互作用力。示例性的蛋白质封闭剂包括牛血清白蛋白自身或其甲基化或琥珀酰化形式，动物全血清(例如马或胎牛血清)，以及其它的血液蛋白。优选的封闭剂是鸟类血清比如鹅或火鸡血清，最优选鸡血清。蛋白封闭剂的其它实例包括酪蛋白和脱脂奶粉。基于去污剂的封闭剂选自非离子型、阳离子型、阴离子型和两性离子型，其选择是基于被封闭基质的性质。Tween 20是用于封闭膜的特别有用的去污剂。可用作封闭剂的示例性的糖包括蔗糖和果糖。

可通过用有效浓度的封闭剂溶液处理所述垫以去除不希望的表面反应性来施加封闭剂。一般而言，此处理采用封闭溶液在约室温下进行数分钟到数小时，所述封闭溶液比如1-20mg/ml蛋白质的蛋白质溶液。所得涂敷材料然后通过空气干燥、冻干或其它干燥方法被永久地吸附到表面。

使用固有吸水性但可转变为非吸水流动特性的基质对于固定特异性结合试剂和第二捕获试剂尤其有用。例如，可在施加封闭剂之前将第二捕获试剂施加到基质并可在原位固定。一旦第二捕获试剂已被固定到基质，然后可施加封闭剂。

例如，在操作本发明期间，将本发明的封闭剂以足以阻止靶抗体与基质材料间相互作用的量施加到样品垫。用于样品垫的一种特别有利的封闭剂是鸟类血清，更优选鸡血清。在一个优选的实施方案中，样品垫用含有以下成分的溶液浸透：聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、鸟类血清、硼酸盐和/或碳酸盐缓冲液(约0.5M)、以及Triton X-100或Tween-20去污剂。对由玻璃纤维材料制成的样品垫，最优选的样品封闭缓冲液由以下组成：40％鸡血清(热灭活并无菌过滤)、0.25M碳酸氢钾、0.05M磷酸氢二钾、0.1％Tween 80、100mM锡酸钾以及0.2％过氧化氢脲，其pH在8.2到8.5。将垫压缩以除去过量的缓冲液并将垫在30℃干燥过夜。此方法的一个优点是样品垫的可湿性和毛细作用增加。

封闭缓冲液的组成和pH随垫的材料类型而变化。例如，通过将由聚酯材料制成的偶联物垫浸入含有以下成分的缓冲液中而将其封闭：聚乙烯吡咯烷酮、鸡血清、牛血清白蛋白、0.1％过氧化氢脲、100mM锡酸钾以及碳酸钾和/或硼酸盐缓冲剂。然后将偶联物垫在50℃并强迫通风干燥120分钟，然后环境温度下空气干燥过夜。对于由硝酸纤维素膜制成的检测区和对照区垫而言，最优选的样品封闭缓冲液组成是：在pH 7.8+/-0.1缓冲的钾盐溶液中的0.15％牛血清白蛋白、0.075Tween 20。

在第三个方面，本发明提供用于检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析方法，其包括：(a)用与侧向流免疫层析检测试条分开的收集器收集口腔流体；(b)将收集器投入一定体积的样品缓冲液中以将口腔流体释放到缓冲液中而得到混合物；(c)将如上所述的侧向流免疫层析检测试条置于混合物中约15-60分钟；(d)通过观察对照区信号的存在来确定检测的有效性，并通过观察检测区信号的存在来确定分析物的存在。

上述方法的原理见于以下。口腔流体被基质通过毛细作用带走并沿测定检测试条向上迁移。其将偶联物再水化，比如试条上微红色的蛋白A-胶体金试剂，并且样品中的IgG与偶联物结合而形成IgG/偶联物复合物。所述IgG/偶联物复合物继续沿试条向上迁移，并首先到达检测试条上含有特异性结合试剂的检测区，其中所述特异性结合试剂能特异性地与靶分析物结合，并且复合物被固定于检测区并出现信号，例如微红色的有色线。这指示反应性或阳性结果。检测区中没有信号指示样品不含有靶分析物并构成非反应性或阴性结果。IgG/偶联物复合物继续沿测定试条向上迁移直到其到达对照区。对照区含有第二捕获试剂，例如固定于测定检测试条的线中的山羊抗人F(ab’)₂IgG片段。剩余的IgG/偶联物复合物与固定化F(ab’)₂片段结合，并出现信号，例如微红色的有色线。此信号的出现是测试正常工作且含有IgG的证据。无论样品对于靶分析物而言是反应性的还是非反应性的，在进行所有的有效检测期间都将有信号在对照区出现。样品继续经过对照区迁移进入最终的吸收垫，其帮助拉动IgG/偶联物复合物通过试条并清除任何背景颜色。

在此方面，可用于本测试的样品收集器能从口腔收集口腔粘膜渗出物，已知所述口腔粘膜渗出物具有其它产品(例如参见美国专利No.5,103,836)所需的更高的诊断性IgG。事实上，在一个优选的实施方案中，用于本测定的收集器是现成的未处理的聚酯拭子，即Texwipe LargeAlpha Swab，TX714A(Texwipe Inc.，Upper Saddle River NJ)。

在此方面的一个实施方案中，用于稀释口腔流体的样品缓冲液为以pH 7.2+/-0.2磷酸钾缓冲的0.15M氯化钠、0.1％Triton X-100、15％热灭活鸡血清、30μg/ml亲合素、0.2％Tween 80、0.2％Tetronic T-904和0.0285％(活性成分)ProClin 950。用于稀释口腔流体的样品缓冲液的体积是1000μl。

在另一个优选的实施方案中，此方法还包括在步骤(b)和步骤(c)之间取出混合物试样(aliquot)的步骤。在一个具体实施方案中，所述试样的体积为200μl。

当正确操作时，第二捕获试剂将继续结合所有标记的抗体偶联物，直至未结合的标记抗体偶联物被消耗殆尽，或第二捕获试剂被饱和。因为甚至来自健康哺乳动物的口腔流体样品含有内源性IgG，且与标记物偶联的标记试剂的摩尔量优选超过固定化抗原的摩尔量，标记的抗体偶联物应该总是可用于结合第二捕获试剂，在对照线产生信号。因此，检测不到对照线的信号指示或者缺乏足够量的人IgG以产生可见线，或者检测试条有缺陷，或者试条操作不当。

典型地，在所述检测试条插入口腔流体之后15至60分钟之间可观察到标记物信号，更优选地在15至45分钟之间，最优选地在15至30分钟之间。在检测开始之后早于15分钟或迟于60分钟读取检测结果可能给出错误的结果。通过如上所述的有色标记物产生的信号通常能不经进一步处理而直接从检测试条检测到。荧光标记物可能需要荧光计进行检测。在本领域技术人员所熟知的方法中，使用银盐溶液可增强由金属溶胶标记物产生的信号。与之相似，当使用酶时，标记物必须与酶标记物的底物接触，以产生可检测产物。因此，这些增强方法偏离了采用有色颗粒标记物和溶胶进行的常规一步法测定，因为在检测标记物之前基质必需与显像液(银盐或底物溶液)进行接触。

在一个最优选的实施方案中，本发明提供一种检测试条，其含有代表HIV-1 gp41和HIV-2 gp36包膜蛋白之免疫决定区的重组蛋白质或合成肽，以及山羊抗人IgG F(ab’)₂片段抗体捕获程序性对照，它们分别固定到检测区和对照区的硝酸纤维素膜上。

图1举例说明根据本发明的一个优选实施方案的口腔流体快速免疫层析检测的程序，其中图1-1到1-15举例说明检测的步骤。为进行测试，以聚酯拭子擦拭对象的上下齿龈，然后将所述拭子置于试管中约1000μl口腔流体样品缓冲液(pH 7.2+/-0.2磷酸钾缓冲的0.15M氯化钠、0.1％Triton X-100、15％热灭活鸡血清、30μg/ml亲合素、0.2％Tween 80、0.2％Tetronic T-904以及0.0285％(活性成分)ProClin 950)中并在试管中混合。压出拭子中的流体并弃掉，将200μl此标本混合物转移到洁净试管以进行测定。将测定试条竖直地放入含有200μl标本混合物的试管中。当稀释的标本沿测定试条向上迁移时，其使试条上微红色蛋白A-胶体金试剂再水化，且标本中IgG与蛋白A/胶体金颗粒结合而形成IgG/偶联物复合物。所述IgG/偶联物复合物继续沿试条向上迁移，首先到达测定试条的检测区(所述检测区含有能与抗HIV抗体结合的HIV抗原)并被固定于检测区的抗原线上且出现微红色的有色线。这指示反应性或阳性结果。线的强度并不与标本中存在的抗体量成比例。检测区中缺少有色线指示标本不含有抗HIV抗体。IgG/偶联物复合物继续沿测定试条向上迁移直到其到达对照区。对照区含有固定于测定试条上线中的山羊抗人F(ab’)₂IgG片段抗体。剩余的IgG/偶联物复合物与固定化F(ab’)₂片段结合，且出现微红色的有色线。对照线的出现是检测运行正常且含有IgG的证据。无论样品对HIV-1或HIV-2的抗体是反应性的还是非反应性的，在进行所有有效的检测期间微红色对照线都将在对照区出现。标本继续迁移经过对照区进入最终的吸收垫，所述吸收垫帮助拉动IgG/偶联物复合物通过试条并清除任何背景颜色。在将测定试条引入稀释标本中20分钟但不超过45分钟之后，对结果进行解释。在检测开始之后早于20分钟或迟于45分钟读取检测结果可能给出错误的结果。剩余的稀释样品可用于其它检测，比如确证性试验。

图2举例说明根据本发明的一种优选实施方案的口腔流体快速免疫层析检测的三种可能的结果，其中图2A、2B和2C分别代表阴性、阳性和无效的结果。

图2A显示非反应性结果，其中仅在对照区出现单一线，提示在口腔流体样品中缺少活性抗HIV-1或抗HIV-2抗体。此检测结果被解释为HIV抗体阴性。

图2B显示反应性结果，其中检测线和对照线均出现，即在检测试条上两线分别出现在检测区和对照区。这些线中一条可比另一条更深。反应性结果意味着已经在口腔流体样品中检测到抗HIV-1/2抗体。此检测结果被解释为初步的HIV抗体阳性。

图2C显示无效结果，其中在对照区没有对照线。即使在检测区出现检测线，结果也是无效的。无效测试应采用新的检测试条进行重复测试。

上述实施方案可以以替代方式进行设计，其包括金溶胶之外替代性标记物。例如，其它标记物包括但不限于元素或金属溶胶比如硒、银、铁或碳，其它的珠状颗粒比如有色乳胶、脂质体、以及染色颗粒。能特异性捕获口腔流体样品中抗体的其它第一捕获试剂包括但不限于抗IgM或IgA的抗体；蛋白G，或伴刀豆球蛋白A。第二捕获试剂也可配制成包括但不限于替代配体，比如蛋白A或蛋白G。

在第四个方面，本发明提供用于检测口腔流体分析物的试剂盒，其包括上述的一次性使用的侧向流免疫层析检测试条。检测试条封闭于干燥的容器中。每个试剂盒可任选地包括样品缓冲液、口腔流体收集器、提供所附检测试条使用说明的包装插页、装有用于对检测试条进行质量检验的阳性和阴性对照的小管、可用于确定本发明的测定何时完成的计时器、和/或生物危险品处理容器。

在此方面的一个优选实施方案中，样品缓冲液为pH 7.2+/-0.2磷酸钾缓冲的溶液，其还含有0.15M氯化钠、0.1％Triton X-100、15％热灭活鸡血清、30μg/ml亲合素、0.2％Tween 80、0.2％Tetronic T-904以及0.0285％(活性成分)ProClin 950。

尽管为清楚和便于理解，已通过举例说明和实例的方式详细地描述了上述发明，但对本领域的普通技术人员来说显而易见，根据本发明的教导，可对其做出各种变化和修改而不违背所附权利要求的精神和范围。

除了通过检测口腔流体中HIV抗体来诊断HIV以外，本发明可容易地配置用于许多病症的诊断，这些病症需要对口腔流体中的分析物进行免疫检测。特别容易使用本发明的概念用于性传播疾病检测，比如梅毒抗体和肝炎病毒抗体。

实施例

以下实施例将举例说明本发明而非对其进行限制。

实施例1：免疫层析检测试条的生产

在本实施例中提供了用于快速HIV-1/2口腔流体抗体检测的检测试条，其中使用玻璃纤维材料作为样品垫的基质，使用聚酯材料作为偶联物垫的基质，使用硝酸纤维素膜作为检测和对照垫的基质。

将1英寸的S&S S-33玻璃纤维材料用封闭缓冲液浸泡，所述封闭缓冲液由以下组成：40％正常鸡血清(热灭活)、0.25M碳酸氢钾、0.05M磷酸氢二钾、0.1％Tween 80、100mM锡酸钾和0.2％过氧化氢脲，其pH在8.2至8.5，于室温下(15-30℃)在低湿度房间里干燥8小时，然后在干燥容器中于50℃过夜，并干燥保存。

通过使用气溶胶尖端将蛋白A金偶联物在垫上划条纹，从聚酯膜制备偶联物垫。在划条纹之前，将偶联物在20％蔗糖、5％海藻糖、100mM锡酸钾以及0.1％过氧化脲中稳定化。然后将所述垫浸入含有聚乙烯吡咯烷酮、鸡血清、牛血清白蛋白以及碳酸盐缓冲剂的缓冲液中并在50℃使用强制通风干燥50分钟。

HIV抗原可偶联到检测区垫，其包括使用链亲和素/生物素连接子。为了划条纹，分别以300ng/试条和0.15ng/试条将合成的HIV-1肽和合成的HIV-2肽(例如SEQ ID No：1至5)施加于检测垫。由1.2mg/mlHIV-1、0.06mg/ml HIV-2、4.36mg/ml亲合素和0.05％异丙醇组成的溶液被用于在检测垫上划条纹。将1mg/ml山羊抗人IgG Fc F(ab)2施加于对照垫。

对于使用重组HIV-1/重组HIV-2的检测试条而言，将在0.001％Tween 80、5％蔗糖和2％甲醇中的0.4-0.7μg/试条的gp41蛋白和0.04-0.08μg/试条的gp36蛋白施加于检测区，并将在5％蔗糖、2％甲醇和0.01M碳酸钾pH 8.4中的0.175μg/试条的山羊抗人IgG F(ab’)₂施加于对照区。

将如上处理的检测区和对照区用封闭剂封闭，所述封闭剂由在pH7.8+/-0.1磷酸钾缓冲液中的0.15％牛血清白蛋白、0.075％Tween 20组成。然后将所得垫对齐以使之相互流体连通，使得偶联物垫位于样品垫的下游；检测和对照区垫位于偶联物垫的下游，以使对照区位于检测区的下游。

实施例2：口腔流体快速免疫层析检测

提供使用本发明试条的口腔流体快速免疫层析检测，如图1-1至图1-15所示。首先，通过轻轻地倒转瓶子约3次来混合样品缓冲液(以pH 7.2+/-0.2磷酸钾缓冲的0.15M氯化钠、0.1％Triton X-100、15％热灭活鸡血清、30μg/ml亲合素、0.2％Tween 80、0.2％Tetronic T-904和0.0285％(活性成分)ProClin 950)。从瓶子取下瓶盖(图1-1)并将缓冲液充填到滴管中至刻线(图1-2)。将滴管的全部内容物分配至试管中(图1-3)。然后取下一支由包所提供的洁净拭子。抓住拭子手柄。避免触及拭子的织物端。随后，施加适当压力并轻柔地以拭子织物端来回地擦拭上齿龈线。在口的一角开始轻柔而缓慢地擦拭直至到达口的另一角(图1-4)，然后沿上齿龈线擦拭返回出发点(约5-6秒)(图1-5)。然后转动拭子以使用拭子的另一侧擦拭下齿龈(图1-6)。使用拭子的另一侧轻柔而缓慢地来回擦拭下齿龈线。在口的一角开始(图1-7)，在口的另一角结束，然后沿下齿龈线擦拭返回出发处(约5-6秒)(图8)。立即将拭子放于盛有样品缓冲液的管中(图1-9)。

紧握拭子手柄。将拭子往复插入样品缓冲液管中6-8次，靠住管壁摩擦拭子的两侧(图1-10)。从管中取出拭子(图1-11)。样品现在已准备好用于检测。转移200μl此样品到空试管。将使用以下的测定试条检测此试样。如果要对样品进行多于一个检测试条的检测，可将多个200μl试样转移到单个空试管。打开装有测定试条的罐。从罐中取出一个测定试条并立刻重新盖好罐。避免用手触及试条中央的膜表面。将测定试条置于含有200μl稀释标本的管中，使测定试条上的箭头指向下(图1-12)。将计时器设定为20分钟，或记录将测定试条加至样品的时间(图1-13)。20分钟以后读取检测结果(图1-14)。然后将试条、管和拭子弃于生物危险品废物容器中(图1-15)。

实施例3：确定试剂盒的灵敏度、特异性和准确度

在本实施例中测定口腔流体检测的灵敏度、特异性和准确度。在泰国曼谷的泰国红十字会匿名HIV诊所(Thai Red Cross AnonymousHIV Clinic)进行口腔流体HIV侧向检测的外部验证试验，试验开始于2004年4月，完成于2004年6月。986名前往泰国红十字会的匿名HIV诊所并且当前未接受逆转录病毒治疗的对象接受自愿HIV抗体检测和咨询。采用对象的顺序检测进行本研究，事先不知道结果。此外，37名已知阳性且接受抗逆转录病毒治疗(ARV)的对象也接受自愿的HIV抗体检测和咨询。给予对象机会以自愿同意提供额外样品由这些试验进行检测。

在匿名HIV诊所中使用的参考方法是用于初步筛选的OrgenicsRapid HIV-1/-2 Blood Test，Doublecheck^TM II。使用Bio-RadGenScreen^TM HIV-1/2 Version 2 ELISA和/或Fujirebio

-HIV(HIV-1 only)Particle Agglutination Test确认本检测的反应性标本。

灵敏度表示为以参比检测的阳性数除以快速口腔流体检测的阳性数所得的百分数。特异性表示为以参比检测的阴性数除以快速口腔流体检测的阴性数所得的百分数。准确度表示为对象总数除以快速口腔流体检测和参比检测间结果一致的数目所得的百分数。结果见于下表。

表1.快速HIV-1/2口腔流体检测-重组HIV-1/合成HIV-2肽

表2.快速HIV-1/2口腔流体检测-合成HIV-1/合成HIV-2肽

序列表

<110>北京克利普特生物医药科技有限公司

<120>口腔流体快速免疫层析检测

<130>OP050003P

<160>5

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>39

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：生物素化的单赖氨酸

连接子HIV-1(gp41肽)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝生物素化的Lys

<220>

<221>二硫化物

<222>(20)..(26)

<400>1

Xaa Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly

1 5 10 15

Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp

20 25 30

Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile

35

<210>2

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：生物素化的

HIV-1 gp120肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝生物素化的Lys

<400>2

Xaa Thr Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val

1 5 10 15

Val Gln Arg Glu Lys Arg

20

<210>3

<211>35

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：生物素化的单赖氨酸

连接子HIV-2(gp36肽)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝生物素化的Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(35)

<223>Xaa＝丝氨酰胺

<220>

<221>二硫化物

<222>(20)..(26)

<400>3

Xaa Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu Asn

1 5 10 15

Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Val Pro Trp Val

20 25 30

Asn Asp Xaa

35

<210>4

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：生物素化的双赖氨酸

连接子HIV-1(gp41肽)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝生物素化的Lys

<220>

<221>二硫化物

<222>(21)..(27)

<400>4

Xaa Lys Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu

1 5 10 15

Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro

20 25 30

Trp Asn Ala Ser Gly Lys Leu Ile

35 40

<210>5

<211>37

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：生物素化的双赖氨酸

连接子HIV-2(gp36肽)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa＝生物素化的Lys

<220>

<221>MOD_RES

<222>(37)

<223>Xaa＝丝氨酰胺

<220>

<221>二硫化物

<222>(21)..(27)

<400>5

Xaa Lys Val Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu

1 5 10 15

Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro

20 25 30

Trp Val Asn Asp Xaa

35

Claims

1.一种用于检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析检测试条，其基本上由样品垫、偶联物垫、检测区和对照区垫组成，所述垫由至少一种基质材料制成，其中

所述偶联物垫位于所述样品垫的下游，并且用偶联物在其上划条纹；

所述检测区和对照区垫位于偶联物垫的下游，且含有检测区和对照区，其中

所述检测区固定有特异性结合靶分析物的特异性结合试剂；且

所述对照区固定有第二捕获试剂。

2.根据权利要求1的检测试条，其中所述待检测的分析物选自抗以下之抗原的抗体：传染性疾病、激素、生长因子、治疗药物、滥用药物及滥用药物的代谢产物。

3.根据权利要求1的检测试条，其中所述基质材料选自无机粉末，比如二氧化硅和氧化铝；玻璃纤维滤纸；天然聚合材料尤其是基于纤维素的材料、层析纸；合成或改性的天然聚合物比如硝酸纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖；以及其组合。

4.根据权利要求3的检测试条，其中所述用于样品垫的基质材料是玻璃纤维滤纸。

5.根据权利要求3的检测试条，其中所述用于偶联物垫的基质材料是聚酯材料。

6.根据权利要求3的检测试条，其中所述用于检测垫和对照垫的基质材料是硝酸纤维素膜。

7.根据权利要求1的检测试条，其中所述偶联物包含与第一捕获试剂偶联的标记物，所述第一捕获试剂捕获口腔流体的内源性抗体。

8.根据权利要求7的检测试条，其中所述标记物选自胶体金颗粒；元素或金属溶胶颗粒，包括硒、银、铁或碳；其它珠状颗粒，包括有色乳胶、脂质体和染料颗粒。

9.根据权利要求7或8的检测试条，其中所述标记物是胶体金颗粒。

10.根据权利要求7的检测试条，其中所述第一捕获试剂选自抗IgG、IgM或IgA的抗体，蛋白A，蛋白G和伴刀豆球蛋白A。

11.根据权利要求8的检测试条，其中所述第一捕获试剂是蛋白A。

12.根据权利要求1的检测试条，其中所述特异性结合试剂选自以下的抗原：传染性疾病、激素、生长因子、治疗药物、滥用药物及滥用药物的代谢产物。

13.根据权利要求12的检测试条，其中所述传染性疾病的抗原是代表HIV蛋白免疫决定区的重组或合成肽。

14.根据权利要求13的检测试条，其中所述HIV蛋白是HIV包膜蛋白。

15.根据权利要求14的检测试条，其中所述HIV包膜蛋白选自HIV-1的gpl20和gp41以及HIV-2的gp36。

16.根据权利要求1的检测试条，其中所述第二捕获试剂选自抗IgG、IgM或IgA的抗体，蛋白A，蛋白G和伴刀豆球蛋白A。

17.根据权利要求16的检测试条，其中所述抗IgG抗体是山羊抗人IgG抗体。

18.生产由权利要求1-17中任一项所定义之侧向流免疫层析检测试条的方法，其包括：

a)将所述偶联物在所述偶联物垫上划条纹；

b)将所述特异性结合试剂固定到所述检测区和对照区垫的检测区上；

c)将所述第二捕获试剂固定到所述检测区和对照区垫的对照区上；

d)用封闭剂封闭每个垫；和

e)对齐所得垫使之相互流体连通。

19.根据权利要求18的方法，其中所述偶联物在划条纹之前在简单或复合糖溶液中被稳定化。

20.根据权利要求19的方法，其中所述糖溶液含有蔗糖、海藻糖、锡酸钾和过氧化氢脲。

21.根据权利要求18的方法，其中使用生物素/链亲合素连接子将所述特异性结合试剂固定到检测区上。

22.根据权利要求18的方法，其中使用生物素/链亲合素连接子将所述特异性结合试剂固定到对照区上。

23.根据权利要求18的方法，其中所述封闭剂含有非离子型、阳离子型、阴离子型和两性离子型的去污剂；糖，包括蔗糖、果糖；或蛋白质，包括牛血清白蛋白、动物全血清、酪蛋白和脱脂奶粉。

24.根据权利要求19的方法，其中所述动物全血清为胎牛血清。

25.根据权利要求19的方法，其中所述动物全血清为鸟类血清。

26.根据权利要求21的方法，其中所述鸟类血清选自鹅血清、火鸡血清和鸡血清。

27.检测口腔流体中分析物的侧向流免疫层析方法，其包括：

(a)使用与由权利要求1-17中任一项所定义之侧向流免疫层析测试试条分开的收集器收集口腔流体；

(b)将收集器投入一定体积的样品缓冲液中以将口腔流体释放到缓冲液中而得到混合物；

(c)将前述权利要求中任一项所定义之侧向流免疫层析测试试条放入混合物中；和

(d)在检测开始的15-60分钟内，通过观察对照区信号的存在来确定检测的有效性，并通过观察检测区信号的存在来确定分析物的存在。

28.根据权利要求27的方法，其中步骤(a)中的收集器是未处理的聚酯拭子。

29.根据权利要求28的方法，其中所述拭子为Texwipe Large AlphaSwab TX714A。

30.根据权利要求27的方法，其中所述样品缓冲液是pH 7.2+/-0.2磷酸钾缓冲溶液。

31.根据权利要求30的方法，其中所述溶液还含有0.15M氯化钠、0.1％ Triton X-100、15％热灭活鸡血清、30μg/ml亲合素、0.2％ Tween80、0.2％ Tetronic T-904以及0.0285％(活性成分)ProClin 950。

32.根据权利要求27的方法，其中所述样品缓冲液的体积为1000μl。

33.根据权利要求27的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)和步骤(c)之间取出混合物之试样的步骤。

34.根据权利要求33的方法，其中所述试样的体积为200μl。

35.根据权利要求27的方法，其中所述信号是有色线。

36.根据权利要求35的方法，其中所述有色线是微红色线。

37.根据权利要求27的方法，其中在20-45分钟内观察所述信号。

38.用于检测口腔流体中分析物的试剂盒，其包含至少一个由权利要求1-17中任一项所定义的侧向流免疫层析检测试条。

39.根据权利要求38的试剂盒，其中所述检测试条被封闭于干燥的容器中。

40.根据权利要求38的试剂盒，其中所述试剂盒还包含样品缓冲液、和至少一个用于收集口腔流体的收集器。

41.根据权利要求40的试剂盒，其中所述样品缓冲液是pH 7.2+/-0.2的磷酸钾缓冲溶液。

42.根据权利要求41的试剂盒，其中所述溶液还含有0.15M氯化钠、0.1％Triton X-100、15％热灭活鸡血清、30μg/ml亲合素、0.2％Tween 80、0.2％Tetronic T-904以及0.0285％(活性成分)ProClin 950。

43.根据权利要求40的试剂盒，其中所述收集器是未处理的聚酯拭子。

44.根据权利要求43的试剂盒，其中所述拭子为Texwipe LargeAlpha Swab TX714A。

45.根据权利要求38至44中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含装有用于对检测试条进行质量检验之阳性和阴性对照的小管。