JP2006325446A - 薬剤に対する感受性を決定する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】bcr−abl融合蛋白質のアミノ酸の変異を核酸レベルで解析する方法として、bcr−abl融合蛋白質のアミノ酸番号255番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を検出する場合、変異部分にプローブを作成し、該プローブと測定したい核酸配列を含む溶液とを混合しプローブと核酸配列のハイブリダイズの様子を解析することで判定できる。また、慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性に影響を及ぼすbcr−abl融合遺伝子の変異型を検出するためのプライマーを設計し、遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅産物が得られたか否かによって慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性を判定する。
【選択図】図1
Description
このような原理によれば、従来法により明確に塩基変異型の検出が行えるように思われるが、実際には、野生型プライマーと変異型プライマーとはわずか1塩基の相違があるのみであり、変異型プライマーを用いて野生型遺伝子を増幅した場合及び野生型プライマーを用いて変異型遺伝子を伸長もしくは増幅した場合にもある程度の反応が起きることが多く、明確な判定が困難となる場合が少なくない。このようなミスマッチな組み合わせにおいて伸長または増幅が起きるか否かは、用いる機器の種類やその他の微妙な条件によって左右され、再現性も低い場合がある。従って、ミスマッチな組み合わせで反応が完全に起こらないようにするためには、反応時の温度条件等を極めて厳密に制御する必要があり、かなり困難な作業になる。
14. プライマーの3’末端から2番目のヌクレオチドが、bcr−abl融合遺伝子の変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする項12または13に記載の方法。
塩基1308番目のC→T(アミノ酸315番目のT→I)
bcr−abl融合蛋白質のアミノ酸の変異を核酸レベルで解析する方法として、プローブを用いる方法、核酸配列を複製または増幅する方法が利用できる。あるいは、これらの方法を組み合わせた方法も利用できる。
[実施例1]
(プライマーの設計)
本発明の処方に従い、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子として知られているbcr−abl融合遺伝子のabl領域にあたるアミノ酸番号315番のスレオニンから他のアミノ酸への変異と、アミノ酸番号255番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異の検出を行うプライマーを配列番号1〜5に従い設計し、薬剤耐性を判定する例とした。選択されたプライマーセットの配列の詳細を表1に示す。表1中「Forward」とはフォワードプライマー、「Reverse」とはリバースプライマー、を意味する。
白血病 細胞株から抽出したトータルRNAをカラム(QIAampRNA Blood Mini Kit; QIAGEN社製)に吸着させ、カラムを洗浄後、吸着したRNAをDEPC水(diethylpyrocarbonate treated distilled and deionized water)で溶出した。RNAの濃度と純度は、吸光度A260nm/A280nmの比で確認した。
(cDNAの調製)
上記で得られたトータルRNA2μgを、500ngのランダムプライマー、200ユニットの逆転写酵素(SuperScript II; GIBCO社製)、40ユニットのRNase阻害剤(GIBCO社)及び1mM dNTPを含む45μlの反応液中で逆転写して調製した。
(PCRの実施)
上記で調製したプラスミドを10倍希釈し、1〜106コピーを有する試料溶液を調製した。調製された各プラスミド溶液2.25μl、フォワードプライマーとリバースプライマー各 5pmoles、および10×PCRmix、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、KOD−plusDNApolymerase、ミリQ水に加えて全量を25μlとした。PCR反応は、最初に94℃で2分、次いで94℃−15秒のデナチュレーション工程、及び65℃−30秒のアニーリング及び68℃−30秒のDNA伸長反応工程を1サイクルとして、これを計40サイクル行うことにより実施した。
(判別)
PCR増幅後、反応液を電気泳動することによって判別を行った。
Claims (32)
- チロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法であって、bcr−abl融合蛋白質のアミノ酸番号255番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を核酸レベルで解析することを特徴とする方法。
- 前記変異をプライマーもしくはプローブを用いて解析することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- プライマーの3’末端から2番目のヌクレオチドが、bcr−abl融合蛋白質のアミノ酸番号255番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を引き起こすヌクレオチドに対応するようにプライマーが設計されていることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- プライマーの3’末端のヌクレオチドが、bcr−abl融合蛋白質のアミノ酸番号255番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を引き起こすヌクレオチドに対応するように設計されていることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- チロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法であって、bcr−abl融合蛋白質のアミノ酸番号315番のスレオニンから他のアミノ酸への変異を核酸レベルで検出するためのプライマーもしくはプローブを用いて解析することを特徴とする慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
- プライマーの3’末端のヌクレオチドが、前記変異を引き起こすヌクレオチドに対応するように設計されていることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記プライマーの3’末端から2番目のヌクレオチドが、前記変異を引き起こすヌクレオチドに対応するように設計されていることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- bcr−abl融合蛋白質のアミノ酸番号244、248、250、252、253、255、311、315、317、343、351、355、359、379、382、387、396からなる群より選択されるアミノ酸の変異をプライマーもしくはプローブを用いてbcr−abl融合遺伝子の変異型を検出し、それに基づきチロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
- bcr−abl融合蛋白質のアミノ酸番号244、248、250、252、253、255、311、315、317、343、351、355、359、379、382、387、396からなる群より選択されるアミノ酸の変異をプライマーの3’末端より2番目の塩基に対応している該プライマーを用いてbcr−abl融合遺伝子の変異型を検出し、それに基づきチロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
- 配列番号1−5に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも15塩基を含んだ少なくとも一つをプライマーもしくはプローブとして用いてbcr−abl融合遺伝子の変異型を検出し、それに基づきチロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
- 配列番号1に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも15塩基を含んだ少なくとも一つをbcr−abl融合遺伝子の野生型および変異型の共通のプライマーとして用いることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 配列番号2及び4に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも15塩基を含んだ少なくとも一つを、bcr−abl融合遺伝子の野生型のプライマーもしくはプローブとして用いることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 配列番号3及び5に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも15塩基を含んだ少なくとも一つを、bcr−abl融合遺伝子の変異型のプライマーもしくはプローブとして用いることを特徴とする請求項10に記載の方法
- プライマーの3’末端から2番目のヌクレオチドが、bcr−abl融合遺伝子の変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする請求項12または13に記載の方法。
- プライマーの3’末端のヌクレオチドが、bcr−abl融合遺伝子の変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする請求項12または13に記載の方法。
- プライマーの3’末端より3番目から5’末端までの塩基に、相補的でないヌクレオチドが少なくとも1つ含まれることを特徴とする請求項3,7,9及び14のいずれかに記載の方法。
- プライマーが、予めビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、放射線物質、発光団よりなる群から選ばれたいずれかにより標識されていることを特徴とする請求項2〜16のいずれかに記載の方法。
- 請求項2〜17のいずれかに記載のプライマーを利用して遺伝子増幅法を行い、遺伝子増幅産物が得られたか否かによって慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性を判定する方法。
- 遺伝子増幅法を行うに先立って、標的となるbcr−abl融合遺伝子を含む試料を予め制限酵素処理を行うことを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記遺伝子増幅法が、PCR、NASBA、LCR、SDA、RCRおよびTMAよりなる群から選ばれるということを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記遺伝子増幅法がPCRであり、該PCRに用いられるDNAポリメラーゼが二本鎖DNAの3’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼがピロコッカス・エスピーKOD1株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム由来であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 電気泳動、ハイブリダイゼーション法、5’ヌクレオチダーゼ活性を利用した標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法、インターカーレーターを用いた蛍光検出法からなる群より選ばれる方法をもちいて、遺伝子増幅産物が得られたか否かを分析することを特徴とする請求項18〜22のいずれかに記載の方法。
- ハイブリダイゼーション法、5’ヌクレオチダーゼ活性を利用した標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法、インターカーレーターを用いた蛍光検出法からなる群より選ばれる方法を用いてbcr−abl融合蛋白質のアミノ酸番号255番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を核酸レベルで解析することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも10倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する請求項1〜24のいずれかに記載の方法。
- 対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも100倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する請求項1〜24のいずれかに記載の方法。
- 対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも1000倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する請求項1〜24のいずれかに記載の方法。
- 対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも10000倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する請求項1〜24のいずれかに記載の方法。
- 請求項2〜17のいずれかに記載の1対のプライマー(フォワードプライマーとリバースプライマー)と、DNAポリメラーゼと、ヌクレオチドとを含むことを特徴とする慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性を判定するための試薬キット。
- 請求項29記載のDNAポリメラーゼが二本鎖DNAの3’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする試薬キット。
- DNAポリメラーゼがピロコッカス・エスピーKOD1株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム由来であることを特徴とする請求項29または30に記載の試薬キット。
- さらに制限酵素を含むことを特徴とする請求項29〜31のいずれかに記載の試薬キット。
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