CN112342306A

CN112342306A - 用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物组合物以及试剂盒

Info

Publication number: CN112342306A
Application number: CN201910732898.4A
Authority: CN
Inventors: 孟祥珠
Original assignee: Shenyang Xiangban Technology Co ltd
Current assignee: Shenyang Xiangban Technology Co ltd
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2021-02-09

Abstract

本发明公开了一种用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物组合物以及试剂盒。本发明提供了一种特异引物组，由如下四个引物对组成：H2引物对、H3引物对、H4引物对和H5引物对；8条引物依次如序列表的序列3至序列12所示。本发明还保护一种引物组合，包括所述特异引物组和H48引物对，H48引物对的两条引物分别如序列表的序列11所示和序列表的序列12所示。本发明提供的引物组合具有高灵敏度和高准确度的优点，且操作简便、易于掌握，能够准确、有效地判断是否存在幽门螺杆菌感染以及是否存在东亚型幽门螺杆菌感染。

Description

用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物组合物以及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物组合物以及试剂盒。

背景技术

幽门螺旋杆菌(H.Pylori)是世界上最常见的病原体之一。流行病学研究表明幽门螺杆菌感染了世界范围内一半以上的人口。幽门螺旋杆菌在我国人群中的感染率高达60％，其中城市为50％，农村为68.8％，每年新感染病例超过1200万人。幽门螺旋杆菌是引起消化性溃疡和慢性活动性胃炎的主要病因，也是世界卫生组织于2012年认定其为胃癌第一类致癌原。及时地诊断并根除幽门螺旋杆菌是治愈胃病的前提。

细胞毒素相关基因(cytotoxin associated geneA,cagA)是幽门螺杆菌中重要的毒力基因，编码表达细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin associated protein A,CagA)，是幽门螺杆菌产生细胞毒性的重要效应蛋白，其与严重的胃炎、萎缩(atrophy)、异型增生(dysplasia)及胃腺癌有更高的相关性。cagA基因具有多态性，这种多态性可导致检测方法的敏感性差异，造成假阳性和假阴性结果的出现。

在临床应用方面，幽门螺杆菌的检查方法主要为经典的PCR方法，一般只用1对或2对引物进行PCR扩增。一方面，幽门螺旋杆菌的DNA突变性非常高，存在大量的变异，具有高度不一致性，单一引物PCR常常不能检测到DNA突变的菌种，很容易造成假阴性的结果。另一方面，只用一对PCR引物会有很高的概率与其他菌种或生物体的DNA片段具有同源性，而导致假阳性结果(例如目前常用的16S亚基序列虽具有保守性比较高的优点，但是它的特异性相对较低，因为所有的细菌核糖体中均有16S亚基序列，虽然在胃酸这一强腐蚀性的液体中能存活的细菌大多为幽门螺旋杆菌，但是在取样和DNA提取的过程中若发生细菌污染，则会影响检测结果，造成假阳性)。因此，现有方法的临床敏感性不是十分理想。

幽门螺杆菌分为西方型和东亚型，其中东亚型又称东亚高危型。东亚型的幽门螺杆菌毒力更高，更容易引起胃病的发展以及胃癌的发生。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物组合物以及试剂盒。

本发明提供了一种特异引物组(HP引物组)，由如下四个引物对组成：H2引物对、H3引物对、H4引物对和H5引物对；

H2引物对由引物H2-F和引物H2-R组成；引物H2-F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；引物H2-R为序列表的序列4所示的单链DNA分子；

H3引物对由引物H3-F和引物H3-R组成；引物H3-F为序列表的序列5所示的单链DNA分子；引物H3-R为序列表的序列6所示的单链DNA分子；

H4引物对由引物H4-F和引物H4-R组成；引物H4-F为序列表的序列7所示的单链DNA分子；引物H4-R为序列表的序列8所示的单链DNA分子；

H5引物对由引物H5-F和引物h5-R组成；引物H5-F为序列表的序列9所示的单链DNA分子；引物H5-R为序列表的序列10所示的单链DNA分子。

本发明还提供了一种引物组合，包括所述特异引物组和H48引物对；H48引物对由引物H48-F与引物H48-R组成；引物H48-F为序列表的序列11所示的单链DNA分子；引物H48-R为序列表的序列12所示的单链DNA分子。

所述引物组合还包括H1引物对；H1引物对由引物H1-F与引物H1-R组成；引物H1-F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；引物H1-R为序列表的序列2所示的单链DNA分子。

本发明还保护所述特异引物组或以上任一所述引物组合的应用，为如下(g1)或(g2)或(g3)或(g4)或(g5)或(g6)或(g7)或(g8)或(g9)或(g10)或(g11)或(g12)：

(g1)制备用于检测受试者是否感染幽门螺杆菌的试剂盒；

(g2)制备用于检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌的试剂盒；

(g3)制备用于鉴定幽门螺杆菌的试剂盒；

(g4)制备用于检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；

(g5)制备用于检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；

(g6)制备用于鉴定东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；

(g7)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；

(g8)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；

(g9)鉴定幽门螺杆菌；

(g10)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；

(g11)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；

(g12)鉴定东亚型幽门螺杆菌。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物组或以上任一所述引物组合；所述试剂盒的功能为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)或(h5)或(h6)：

(h1)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；

(h2)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；

(h3)鉴定幽门螺杆菌；

(h4)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；

(h5)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；

(h6)鉴定东亚型幽门螺杆菌。

所述试剂盒中，HP引物组作为一个独立包装，H48引物对作为一个独立包装，H1引物对作为一个独立包装。

本发明还保护一种试剂盒，包括PCR预混液A；PCR预混液A中，引物H2-F的浓度为1/9μM、引物H2-R的浓度为1/9μM、引物H3-F的浓度为1/9μM、引物H3-R的浓度为1/9μM、引物H4-F的浓度为1/6μM、引物H4-R的浓度为1/6μM、引物H5-F的浓度为1/18μM、引物H5-R的浓度为1/18μM。

所述试剂盒还包括PCR预混液C；PCR预混液C中，引物H48-F的浓度为4/9μM、引物H48-R的浓度为4/9μM。

所述试剂盒还包括PCR预混液B；PCR预混液B中，引物H1-F的浓度为4/9μM、引物H1-R的浓度为4/9μM。

PCR预混液A：25％(体积百分含量)市售预混液1、20％(体积百分含量)市售预混液2、HP引物组中的每条引物，余量为水。

PCR预混液B：25％(体积百分含量)市售预混液1、20％(体积百分含量)市售预混液2、H1引物对中的每条引物，余量为水。

PCR预混液C：25％(体积百分含量)市售预混液1、20％(体积百分含量)市售预混液2、H48引物对中的每条引物，余量为水。

所述试剂盒还包括标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4和标准品质粒H5；标准品质粒H2具有序列表的序列14所示的DNA分子；标准品质粒H3具有序列表的序列15所示的DNA分子；标准品质粒H4具有序列表的序列16所示的DNA分子；标准品质粒H5具有序列表的序列17所示的DNA分子。

所述试剂盒还包括标准品质粒H48；标准品质粒H48具有序列表的序列18所示的DNA分子。

所述试剂盒还包括标准品质粒H1；标准品质粒H1具有序列表的序列13所示的DNA分子。

将序列表的序列13所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H1。

将序列表的序列14所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H2。

将序列表的序列15所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H3。

将序列表的序列16所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H4。

将序列表的序列17所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H5。

将序列表的序列18所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒H48。

本发明提供的特异引物组通过多个基因位点的同时检测，能够克服幽门螺杆菌基因组DNA高度不一致的问题，特异性强、灵敏度高，能够简便、快速、准确地检测待测样品是否存在幽门螺杆菌的感染以及是否存在东亚型幽门螺杆菌感染，避免基因突变造成的结果假阴性，能够极大的提高检出率。

应用本发明提供的试剂盒检测或辅助检测幽门螺杆菌，具有高灵敏度和高准确度的优点，且操作简便、易于掌握，能够准确、有效地判断是否存在幽门螺杆菌感染以及是否存在东亚型幽门螺杆菌感染。

附图说明

图1为实施例1的步骤一的结果。

图2为实施例1的步骤二的结果(检测单独引物对的扩增效果)。

图3为实施例1的步骤二的结果(检测多重引物组的扩增效果)。

图4为实施例3的步骤一的结果。

图5为实施例7的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

市售预混液1：TB

Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)；http://www.takarabiomed.com.cn/ProductShow.aspx？m＝20141215102926123157&productID＝20141227082641313454。

市售预混液2：TB

Premix DimerEraser^TM(Perfect Real Time)；http://www.takarabiomed.com.cn/ProductShow.aspx？m＝20141215102926123157&productID＝20141227084317280521。

实施例1、引物的筛选

一、cagA引物对的筛选

由于cagA基因具有多态性，因此设计针对东亚型幽门螺杆菌cagA基因的特异区中的多个靶区段的多个引物对。示例性的，部分引物对序列如下：

引物对1：

F：TCTAATTAAGGGAAGAATACTCCAATAA；

R：TCGCGATCGGGTGTTGATTTTA。

引物对2：

F：GATCAGGCAAGCTTTTGATG；

R：CTAAAAGATTGTTTGGCAGA。

引物对3：

F：TCTAATTAAGGGAAGAATACTCCAATAA；

R：CTGTAGAAGATTGTTTGGCAGA。

引物对4：

F：GATAACAGGCAAGCTTTTGATG；

R：TCGCGATCGGGTGTTGATTTTA。

引物对5：

F：GATAACAGGCAAGCTTTTGAAG；

R：CTGCAAAAGATTGTTTGGGA。

引物对6：

F：GATAACAGGCAAGCTTTTGAAG；

R：TCGTCGATCGGGTGTTGATTA。

引物对7：

F3：GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG；

R：CTGCAAAAGATTGTTTGGGA。

引物对8：

F：GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG；

R：TCGGATCGATCGGGTGTTGATTA。

引物对9：

F：AGGCATGATAAAGTTGAT；

R：AAAGGTCCGCCGAGATCAT。

引物对10：

F：ACCCTAGTCGGTAATGGG；

R：TGCCCTACACCACCCAAA。

引物对11：

F：AAAAATCCGACTCAATC；

R：GCTTTAGCTGATACCGC。

引物对12：

F：AAAGGAGTGGGCGGTTTCA；

R：CCTGCTTGATTTGCCTCATCA。

引物对13：

F：ACCCTAGTCAGTAATGGG；

R：GCAATTTTGTTAATCCGGTC。

引物对14：

F：GCATCAGCAGGTAAAGGAGT；

R：GTTTTAGCTTCTGACACTGC。

引物对15：

F：AGGCATGATAAAGATGAT；

R：CCTGCTTGATTTTCATCA。

引物对16、

F(序列表的序列11)：GCATCAGCAGGTAAAGGAGT；

R(序列表的序列12)：CCTGCTTGATTTGCCTCATCA。

18例临床样本：样本为通过胃镜获取的患者的胃部组织或黏液，均已由医院确诊为幽门螺杆菌阳性。患者均为知情同意的志愿者。

1、将18例临床样本等质量混合，然后提取总DNA。

2、以步骤1得到的DNA为模板，分别采用各个引物对进行PCR扩增。

反应体系组成(10μl)：1μl模板溶液(DNA含量为5-20ng)、2.5μl市售预混液1、2μl市售预混液2、每条引物，余量为水。反应体系中，引物F的浓度为0.4μM、引物R的浓度为0.4μM。

PCR扩增程序：

第一步：94℃2min；

第二步：94℃1min，63-59℃(第一个循环为63℃，每个循环降低1℃)40s，72℃30s，5个循环；

第三步：94℃20s，58℃20s，72℃25s，35个循环；72℃收集SYBR荧光信号。

结果见图1。引物对16的扩增效果显著优于其他引物对。由于模板DNA提取自混合临床样本，引物对扩增效果越高，意味着其靶序列越多，也就是说其可以实现扩增的cagA基因多态类型越多。

3、分别提取18例临床样本的DNA。

4、分别以步骤3提取的各个DNA为模板，分别采用各个引物对进行PCR扩增。

反应体系组成以及PCR扩增程序同步骤2。

对于18例临床样本来说，引物对1的检出率为0，引物对2的检出率为5.6％，引物对3的检出率为5.6％，引物对4的检出率为0，引物对5的检出率为0，引物对6的检出率为11.1％，引物对7的检出率为0，引物对8的检出率为0，引物对9的检出率为0，引物对10的检出率为5.6％，引物对11的检出率为0，引物对12的检出率为0，引物对13的检出率为0，引物对14的检出率为0，引物对15的检出率为0，引物对16的检出率为83.3％。

结果表明，引物对16可以鉴定东亚型幽门螺杆菌cagA基因的特异区最多的突变形式。

二、HP引物组的筛选

引物对H2：

F(序列表的序列3)：GTGGAAAAAGGCGGTATCGGTCAA；

R(序列表的序列4)：CATGCCTTTATCGCCTTTTCTCCA。

引物对H3：

F(序列表的序列5)：AATCGCAGGGGTGGGCATAGG；

R(序列表的序列6)：TGAGGGGTAAAGCAGGGGTGAAAC。

引物对H4：

F(序列表的序列7)：CCTTGAGCGCGGTTTGATTCTTG；

R(序列表的序列8)：GTGGTGGCTTTGTTAGTGGGATGC。

引物对H5：

F(序列表的序列9)：AGAGCCTGCTGGTGGGGATTG；

R(序列表的序列10)：AAGCCTTGTATGTCGGTGGTGGTA。

引物对U235：

F：GGTTGAAATAGGCACACAATTC；

R：CTTCCCCAGTCTCTAATCCTACC。

引物对S279：

F：GAGCGGAAGTCCTAGTC；

R：GATGATATGCCCAATAGC。

模板为幽门螺杆菌基因组DNA(ATCC，43504D-5^TM)。

1、检测单独引物对的扩增效果

取模板，分别采用各个引物对进行PCR扩增。

反应体系组成和PCR扩增程序同步骤一的2。

部分结果见图2。扩增效率最高的为引物对H2、引物对H3、引物对H4、引物对H5、引物对U235和引物对S279，其他引物对扩增效果不好。

2、检测多重引物组的扩增效果

(1)取模板，采用多重引物组(由引物对H2、引物对H3、引物对H4、引物对H5、引物对U235和引物对S279，共12条引物组成)进行PCR扩增。

反应体系组成和PCR扩增程序同步骤一的2。反应体系中，6种引物F的浓度均为0.4μM、6种引物R的浓度均为0.4μM。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。引物之间存在相互干扰。

(2)取模板，采用多重引物组(由引物对H2、引物对H3、引物对H4和引物对H5，共8条引物组成)进行PCR扩增。

反应体系组成和PCR扩增程序同步骤一的2。反应体系中，4种引物F的浓度均为0.4μM、4种引物R的浓度均为0.4μM。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。多重扩增效果非常好。

实施例2、引物以及标准品质粒的制备

一、引物的制备

分别制备以下各条引物(均为单链DNA分子)：

H1-F(序列表的序列1)：5’-GGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTC-3’；

H1-R(序列表的序列2)：5’-CCCAGGGCCTCACCACCAAC-3’；

H2-F(序列表的序列3)：5’-GTGGAAAAAGGCGGTATCGGTCAA-3’；

H2-R(序列表的序列4)：5’-CATGCCTTTATCGCCTTTTCTCCA-3’；

H3-F(序列表的序列5)：5’-AATCGCAGGGGTGGGCATAGG-3’；

H3-R(序列表的序列6)：5’-TGAGGGGTAAAGCAGGGGTGAAAC-3’；

H4-F(序列表的序列7)：5’-CCTTGAGCGCGGTTTGATTCTTG-3’；

H4-R(序列表的序列8)：5’-GTGGTGGCTTTGTTAGTGGGATGC-3’；

H5-F(序列表的序列9)：5’-AGAGCCTGCTGGTGGGGATTG-3’；

H5-R(序列表的序列10)：5’-AAGCCTTGTATGTCGGTGGTGGTA-3’；

H48-F(序列表的序列11)：5’-GCATCAGCAGGTAAAGGAGT-3’；

H48-R(序列表的序列12)：5’-CCTGCTTGATTTGCCTCATCA-3’。

F代表上游引物，R代表下游引物。

H1-F与H1-R的靶序列位于人β-globin基因。

H2-F与H2-R的靶序列位于幽门螺杆菌烷基过氧化氢还原酶基因(alkylhydroperoxide reducatase gene，又称tsaA基因)。

H3-F与H3-R的靶序列位于幽门螺杆菌磷酸葡萄糖胺变位酶基因(phosphoglucosamine mutase gene)。

H4-F与H4-R的靶序列位于幽门螺杆菌鞭毛鞘粘附素基因(flagellar sheathadhesin gene，又称hpaA基因)。

H5-F与H5-R的靶序列位于幽门螺杆菌cagA基因(西方型幽门螺杆菌cagA基因和东亚型幽门螺杆菌cagA基因的共有的保守区)。

H48-F与H48-R的靶序列位于幽门螺杆菌cagA基因(东亚型幽门螺杆菌cagA基因独有的特异区)。

H1-F和H1-R组成IPC引物对(又称H1引物对)。H48-F与H48-R组成cagA引物对(又称H48引物对)。H2-F、H2-R、H3-F、H3-R、H4-F、H4-R、H5-F和H5-R组成HP引物组。

二、标准品质粒的制备

后续实施例中所述的6种标准品质粒均指的是标准品质粒H1、标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4、标准品质粒H5和标准品质粒H48。

实施例3、反应体系的优化

一、反应体系的优化

1、取六种标准品质粒混合液，用1×TE溶液悬浮，得到模板溶液。模板溶液中每种质粒浓度均为32000拷贝/μL。

2、制备反应体系。

反应体系组成(10μl)：1μl模板溶液、市售预混液1、市售预混液2、HP引物组中的每条引物，余量为水。反应体系中，h2-F的浓度为0.1μM、h2-R的浓度为0.1μM、h3-F的浓度为0.1μM、h3-R的浓度为0.1μM、h4-F的浓度为0.15μM、h4-R的浓度为0.15μM、h5-F的浓度为0.05μM、h5-R的浓度为0.05μM。

设置三种反应体系。反应体系1中，市售预混液1加入量为2μl、市售预混液2加入量为2.5μl(即两者体积配比为4:5)。反应体系2中，市售预混液1加入量为2.5μl、市售预混液2加入量为2μl(即两者体积配比为5:4)。反应体系3中，市售预混液1加入量为2.5μl、市售预混液2加入量为2.5μl(即两者体积配比为1:1)。

3、进行实时荧光定量PCR。

结果见图4。反应体系2扩增效率最好,并且产生引物二聚体可以被有效的抑制。

二、引物浓度的优化

1、取六种标准品质粒混合液，用1×TE悬浮，得到模板溶液。模板溶液中每种质粒浓度均为32000拷贝/μL。

2、制备反应体系。

反应体系组成(10μl)：1μl模板溶液、2.5μl市售预混液1、2μl市售预混液2、引物，余量为水。

设置多种反应体系。不同反应体系采用的引物分别为：H1-F和H1-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.4μM)，或者，H1-F和H1-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H1-F和H1-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H1-F和H1-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)，H2-F和H2-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H2-F和H2-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.15μM)，或者，H2-F和H2-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H2-F和H2-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)，H3-F和H3-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H3-F和H3-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.15μM)，或者，H3-F和H3-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H3-F和H3-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)，H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.15μM)，或者，H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H4-F和H4-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)，H5-F和H5-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H5-F和H5-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.15μM)，或者，H5-F和H5-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H5-F和H5-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)或者，H48-F和H48-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.4μM)，或者，H48-F和H48-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.2μM)，或者，H48-F和H48-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.1μM)，或者，H48-F和H48-R(两条引物在反应体系中的浓度均为0.05μM)。

3、进行实时荧光定量PCR。

根据扩增曲线，将各个引物的优化浓度确定为：H1-F 0.4μM、H1-R 0.4μM；H2-F0.1μM、H2-R 0.1μM；H3-F 0.1μM、H3-R 0.1μM；H4-F 0.15μM、H4-R 0.15μM；H5-F 0.05μM、H5-R 0.05μM；H48-F 0.4μM、H48-R 0.4μM。六对引物的重复性好，而H2、H3、H4、H5在加入量较少时，其Ct值相近(扩增效率相同)。

实施例4、试剂盒的制备

一、试剂盒的组成

质粒标准品：标准品质粒H1、标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4、标准品质粒H5、标准品质粒H48，混合,六种质粒的浓度均为32000拷贝/μL。

PCR预混液A：25％(体积百分含量)市售预混液1、20％(体积百分含量)市售预混液2、HP引物组中的每条引物，余量为水。PCR预混液A中，H2-F的浓度为1/9μM、H2-R的浓度为1/9μM、H3-F的浓度为1/9μM、H3-R的浓度为1/9μM、H4-F的浓度为1/6μM、H4-R的浓度为1/6μM、H5-F的浓度为1/18μM、H5-R的浓度为1/18μM。

PCR预混液B：25％(体积百分含量)市售预混液1、20％(体积百分含量)市售预混液2、IPC引物对中的每条引物，余量为水。PCR预混液B中，H1-F的浓度为4/9μM、H1-R的浓度为4/9μM。

PCR预混液C：25％(体积百分含量)市售预混液1、20％(体积百分含量)市售预混液2、cagA引物对中的每条引物，余量为水。PCR预混液C中，H48-F的浓度为4/9μM、H48-R的浓度为4/9μM。

阴性对照品：灭菌超纯水。

二、试剂盒的使用方法

1、荧光实时定量PCR

将1μL模板溶液与9μL PCR预混液混合。由于有3种预混液，所以分为3个体系(按照与PCR预混液对应的顺序，依次命名为体系A、体系B和体系C)。模板溶液为供试样本的DNA溶液或者阳性对照(质粒标准品)或者阴性对照。

PCR扩增程序：

第一步：94℃2min；

第三步：94℃20s，58℃20s，72℃25s，35个循环；72℃收集SYBR荧光信号；

第四步(制作溶解曲线)：95℃30s，65℃10s，0.1-0.2℃/循环，95℃10s，收集SYBR荧光信号。

阈值(threshold):设定原则以阈值线刚好超过阴性对照的扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

2、结果判读

满足如下标准时，结果可信：

(1)阴性对照(NTC)反应孔中应无S型扩增曲线；

(2)三个阳性对照反应孔中均应检测出S型扩增曲线，且Ct≤29。

满足如下标准时，DNA样本可信：体系B反应孔中溶解曲线峰值应位于86.5-87.5℃之间(含两个端值)，检测出S型扩增曲线。

对于反应体系A：溶解曲线峰值应位于81-84℃之间(含两个端值)；如Ct≤29判断为阳性(即具有幽门螺杆菌)，如Ct≥32判断为阴性(不具有幽门螺杆菌或幽门螺杆菌低于检测限)；如Ct大于29且小于32(处于灰区)，样本进行复检，复检仍处于灰区或复检为阳性判断为阳性，复检为阴性判断为阴性。

对于反应体系C：溶解曲线峰值应位于83-84℃之间(含两个端值)；如Ct≤29判断为阳性(即具有东亚型幽门螺杆菌)，如Ct≥32判断为阴性(不具有东亚型幽门螺杆菌或东亚型幽门螺杆菌低于检测限)；如Ct大于29且小于32(处于灰区)，样本进行复检，复检仍处于灰区或复检为阳性判断为阳性，复检为阴性判断为阴性。

实施例5、检测阳性标准品

标准品A，含标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4和标准品质粒H5，四种质粒的浓度均为200拷贝/μL。将1μL标准品A与9μL实施例4制备的PCR预混液A混合。

标准品B，含标准品质粒H1，浓度为200拷贝/μL。将1μL标准品B与9μL实施例4制备的PCR预混液B混合。

标准品C，含标准品质粒H48，浓度为200拷贝/μL。将1μL标准品C与9μL实施例4制备的PCR预混液C混合。

PCR扩增程序同实施例4。

Ct值结果见表1。

表1

共计20次检测	标准品B	标准品A	标准品C(cagA)
				1	24.58	23.62	23.64
2	24.89	23.63	23.64
				3	23.51	23.69	23.85
4	25.18	22.99	23.50
				5	25.13	24.66	25.23
6	26	25.2	24.59
				7	25.29	24.87	25.48
8	25.89	24.8	25.77
				9	25.64	25.68	25.43
10	25.39	24.79	25.09
				11	26.22	24.63	24.34
12	24.92	24.61	24.84
				13	24.97	24.33	25.45
14	25.82	24.35	25.25
				15	26	24.72	25.24
16	25.28	24.22	24.9
				17	25.81	23.64	24.34
18	24.74	24.84	24.93
				19	26.64	25.48	24.92
20	25.84	25.25	25.19

检验结果显示：20次检测均为阳性。

实施例6、检测阴性标准品

以灭菌的超纯水作为空白对照进行检测。

采用实施例4的试剂盒并按说明操作。结果见表2。

检验结果显示：10次检测中，每次检测3个体系均为阴性。

实施例7、线性检测

标准品A，含标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4和标准品质粒H5，10倍梯度稀释，稀释度1中四种质粒的浓度均为100000/μL，稀释度2中四种质粒的浓度均为10000/μL，稀释度3中四种质粒的浓度均为1000/μL，稀释度4中四种质粒的浓度均为100μL，稀释度5中四种质粒的浓度均为10/μL。将1μL标准品A与9μL实施例4制备的PCR预混液A混合。

标准品B，含标准品质粒H1，10倍梯度稀释，稀释度1中质粒的浓度为100000/μL，稀释度2中质粒的浓度为10000/μL，稀释度3中质粒的浓度为1000/μL，稀释度4中质粒的浓度为100μL，稀释度5中质粒的浓度为10/μL。将1μL标准品B与9μL实施例4制备的PCR预混液B混合。

标准品C，含标准品质粒H48，10倍梯度稀释，稀释度1中质粒的浓度为100000/μL，稀释度2中质粒的浓度为10000/μL，稀释度3中质粒的浓度为1000/μL，稀释度4中质粒的浓度为100μL，稀释度5中质粒的浓度为10/μL。将1μL标准品C与9μL实施例4制备的PCR预混液C混合。

PCR扩增程序同实施例4。

标准品A的线性范围结果见表2和图5A(横坐标为Ct值，纵坐标为拷贝数以10为底的对数)。y＝-0.2691x+8.5714；R2＝0.999。

标准品B的线性范围结果见表3和图5B(横坐标为Ct值，纵坐标为拷贝数以10为底的对数)。y＝-0.2615x+8.7597；R2＝0.999。

标准品C的线性范围结果见表4和图5C(横坐标为Ct值，纵坐标为拷贝数以10为底的对数)。y＝-0.2736x+7.9676；R2＝0.9991。

表2

拷贝数	100000	10000	1000	100	10
						以10为底的对数	5	4	3	2	1
Ct值(第一次重复试验)	13.39	16.75	20.93	25.57	27.33
						Ct值(第二次重复试验)	13.24	16.87	20.84	24.33	27.37
Ct值(第三次重复试验)	13.22	16.82	20.79	23.99	28.71
						平均数	13.28333	16.81333	20.85333	24.63	27.93667

表3

拷贝数	100000	10000	1000	100	10
						以10为底的对数	5	4	3	2	1
Ct值(第一次重复试验)	14.25	18.42	21.88	27.44	N
						Ct值(第二次重复试验)	14.44	18.50	21.78	24.93	32.83
Ct值(第三次重复试验)	14.07	18.36	22.26	26.55	N
						平均数	14.25333	18.42667	21.97333	25.80667

表4

结果显示：线性相关系数︱r︱≥0.98。

实施例8、批内精密度

标准品A，含标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4和标准品质粒H5，设置两个浓度，高值浓度即四种质粒的浓度均为10⁵拷贝/μL，低值浓度即四种质粒的浓度均为400拷贝/μL。将1μL标准品A与9μL实施例4制备的PCR预混液A混合。

标准品B，含标准品质粒H1，设置两个浓度，高值浓度即质粒的浓度为10⁵拷贝/μL，低值浓度即质粒的浓度为400拷贝/μL。将1μL标准品B与9μL实施例4制备的PCR预混液B混合。

标准品C，含标准品质粒H48，设置两个浓度，高值浓度即质粒的浓度为10⁵拷贝/μL，低值浓度即质粒的浓度为400拷贝/μL。将1μL标准品C与9μL实施例4制备的PCR预混液C混合。

PCR扩增程序同实施例4。

Ct值结果见表5。

表5

检测结果显示：CV值均小于5％。

实施例9、干扰实验

将医院确诊的不含幽门螺杆菌的临床样本(胃部组织，志愿者知情同意)，提取DNA。作为背景DNA。

标准品A，将背景DNA、标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4和标准品质粒H5混合，背景DNA的浓度为8ng/μL，高浓度质粒即四种质粒的浓度均为800拷贝/μL，中浓度质粒即四种质粒的浓度均为400拷贝/μL，低浓度质粒即四种质粒的浓度均为200拷贝/μL。将1μL标准品A与9μL实施例4制备的PCR预混液A混合。设置用背景DNA代替标准品A的阴性对照。

标准品C，将背景DNA和标准品质粒H48混合，背景DNA的浓度为8ng/μL，高浓度质粒即质粒的浓度为800拷贝/μL，中浓度质粒即质粒的浓度为400拷贝/μL，低浓度质粒即质粒的浓度为200拷贝/μL。将1μL标准品C与9μL实施例4制备的PCR预混液C混合。设置用背景DNA代替标准品C的阴性对照。

PCR扩增程序同实施例4。

Ct值结果见表6。

表6

实施例10、不同试剂盒的检测阳性率比较

分别应用达安基因试剂盒、尿素[14C]呼气试验药盒和实施例4制备的试剂盒对同一批临床样本进行检测，结果见表7。本实施例仅检测是否具有幽门螺杆菌，不检测是否具有东亚型幽门螺杆菌，因此采用实施例4制备的试剂盒时未使用PCR预混液C。

达安基因试剂盒：http://www.daangene.com/product/detail.aspx？mid＝ 02060101。

尿素[14C]呼气试验药盒：

http://www.headwaychina.com/hdw/cyyfw/cpzx/yh/364610/365778/ index.html。

表7

	阳性样本个数	阴性样本个数	样本总数	阳性率％
					达安结果	37	22	59	62.7％
<sup>14</sup>C呼气试验	25	24	59	42.4％
					多重PCR	40	19	59	67.8％

经后续追踪，本发明提供的试剂盒的检测结果正确。

实施例11、

16株菌的信息如下(北京北纳创联生物技术研究院)：脆弱拟杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、两歧双歧杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、白假丝酵母菌、甲型溶血性链球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺菌、乙型溶血性链球菌、厌氧消化链球菌。

3株菌的信息如下(自行分离)：大肠杆菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌。

采用实施例4制备的试剂盒并按说明操作，分别对各菌株进行检测。

各菌株体系A的结果均为阴性。各菌株体系C的结果均为阴性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 沈阳祥伴科技有限公司

<120> 用于检测或辅助检测幽门螺杆菌的引物组合物以及试剂盒

<130> GNCYX191116

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gggagggctg agggtttgaa gtc 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cccagggcct caccaccaac 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gtggaaaaag gcggtatcgg tcaa 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

catgccttta tcgccttttc tcca 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aatcgcaggg gtgggcatag g 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tgaggggtaa agcaggggtg aaac 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ccttgagcgc ggtttgattc ttg 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gtggtggctt tgttagtggg atgc 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

agagcctgct ggtggggatt g 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

aagccttgta tgtcggtggt ggta 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gcatcagcag gtaaaggagt 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

cctgcttgat ttgcctcatc a 21

<210> 13

<211> 327

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gggagggctg agggtttgaa gtccaactcc taagccagtg ccagaagagc caaggacagg 60

tacggctgtc atcacttaga cctcaccctg tggagccaca ccctagggtt ggccaatcta 120

ctcccaggag cagggagggc aggagccagg gctgggcata aaagtcaggg cagagccatc 180

tattgcttac atttgcttct gacacaactg tgttcactag caacctcaaa cagacaccat 240

ggtgcacctg actcctgagg agaagtctgc cgttactgcc ctgtggggca aggtgaacgt 300

ggatgaagtt ggtggtgagg ccctggg 327

<210> 14

<211> 276

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gtggaaaaag gcggtatcgg tcaagtgtct ttccctatgg tggctgatat cactaagagc 60

atttctagag actatgatgt gctgtttgaa gaagcgatcg ctttgagagg cgcttttttg 120

attgataaaa acatgaaagt aagacatgca gtgatcaatg acttgccatt aggtaggaat 180

gcagatgaaa tgcttcgcat ggtagacgct ctcttacact ttgaagaaca tggtgaagta 240

tgcccagcag gttggagaaa aggcgataaa ggcatg 276

<210> 15

<211> 218

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

aatcgcaggg gtgggcatag gccctatttg aatcacatta tagcctatgg aagttagagc 60

gctcactaaa gcgttttcta ccatatagcc gctttttctg gtgtctttac cgattagaat 120

tttattcgtt tgagaatgtt ttttaaaata caatccggca gcaatgccta aacgcatcac 180

aaacatgggg gtgagtttca cccctgcttt acccctca 218

<210> 16

<211> 199

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ccttgagcgc ggtttgattc ttgaatttgt tttcatactc tttagcaata ttatcgctgt 60

attgaaaagc tggccttaaa agcaaaatct tttcatctaa cgcttgaact ttctcgctag 120

ctggatggta attcaatttc aaagcgactt cattggtttc aataatatgc gggctgcatc 180

ccactaacaa agccaccac 199

<210> 17

<211> 150

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

agagcctgct ggtggggatt ggcttgatat ttttctctca tttgtattca acaaaaaaca 60

atcttccgat ctcaaagaaa cgctccatca agagccaagg cctgattttg aacaaaatat 120

agccactacc accaccgaca tacaaggctt 150

<210> 18

<211> 104

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gcatcagcag gtaaaggagt gggcggtttc agtggagcag ggcgatcagc tagccctgaa 60

cccatttacg ctacaattga ttttgatgag gcaaatcaag cagg 104

Claims

1.特异引物组，由如下四个引物对组成：H2引物对、H3引物对、H4引物对和H5引物对；

2.引物组合，包括权利要求1所述特异引物组和H48引物对；H48引物对由引物H48-F与引物H48-R组成；引物H48-F为序列表的序列11所示的单链DNA分子；引物H48-R为序列表的序列12所示的单链DNA分子。

3.如权利要求2所述的引物组合，其特征在于：所述引物组合还包括H1引物对；H1引物对由引物H1-F与引物H1-R组成；引物H1-F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；引物H1-R为序列表的序列2所示的单链DNA分子。

4.权利要求1所述特异引物组、权利要求2所述引物组合或权利要求3所述引物组合的应用，为如下(g1)或(g2)或(g3)或(g4)或(g5)或(g6)或(g7)或(g8)或(g9)或(g10)或(g11)或(g12)：

(g1)制备用于检测受试者是否感染幽门螺杆菌的试剂盒；

(g2)制备用于检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌的试剂盒；

(g3)制备用于鉴定幽门螺杆菌的试剂盒；

(g6)制备用于鉴定东亚型幽门螺杆菌的试剂盒；

(g7)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；

(g8)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；

(g9)鉴定幽门螺杆菌；

(g10)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；

(g11)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；

(g12)鉴定东亚型幽门螺杆菌。

5.一种试剂盒，包括权利要求1所述特异引物组、权利要求2所述引物组合或权利要求3所述引物组合；所述试剂盒的功能为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)或(h5)或(h6)：

(h1)检测受试者是否感染幽门螺杆菌；

(h2)检测生物样本中是否含有幽门螺杆菌；

(h3)鉴定幽门螺杆菌；

(h4)检测受试者是否感染东亚型幽门螺杆菌；

(h5)检测生物样本中是否含有东亚型幽门螺杆菌；

(h6)鉴定东亚型幽门螺杆菌。

6.一种试剂盒，包括PCR预混液A；PCR预混液A中，引物H2-F的浓度为1/9μM、引物H2-R的浓度为1/9μM、引物H3-F的浓度为1/9μM、引物H3-R的浓度为1/9μM、引物H4-F的浓度为1/6μM、引物H4-R的浓度为1/6μM、引物H5-F的浓度为1/18μM、引物H5-R的浓度为1/18μM；

引物H2-F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；引物H2-R为序列表的序列4所示的单链DNA分子；引物H3-F为序列表的序列5所示的单链DNA分子；引物H3-R为序列表的序列6所示的单链DNA分子；引物H4-F为序列表的序列7所示的单链DNA分子；引物H4-R为序列表的序列8所示的单链DNA分子；引物H5-F为序列表的序列9所示的单链DNA分子；引物H5-R为序列表的序列10所示的单链DNA分子。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR预混液C；PCR预混液C中，引物H48-F的浓度为4/9μM、引物H48-R的浓度为4/9μM；引物H48-F为序列表的序列11所示的单链DNA分子；引物H48-R为序列表的序列12所示的单链DNA分子。

8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR预混液B；PCR预混液B中，引物H1-F的浓度为4/9μM、引物H1-R的浓度为4/9μM；引物H1-F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；引物H1-R为序列表的序列2所示的单链DNA分子。

9.如权利要求6或7或8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品质粒H2、标准品质粒H3、标准品质粒H4和标准品质粒H5；标准品质粒H2具有序列表的序列14所示的DNA分子；标准品质粒H3具有序列表的序列15所示的DNA分子；标准品质粒H4具有序列表的序列16所示的DNA分子；标准品质粒H5具有序列表的序列17所示的DNA分子。

10.如权利要求6或7或8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品质粒H48；标准品质粒H48具有序列表的序列18所示的DNA分子。