CN110699353A - 一种靶向端粒的核酸探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向端粒的核酸探针，其核酸探针序列为5'‑CCCTA‑E‑CCCTAA‑Gly‑3'，核酸探针序列中E是荧光基团香豆素酸OC7标记的肽核酸骨架。本发明通过合成Fmoc和Alloc保护基团保护的肽核酸骨架Fmoc‑aeg(Alloc)‑OH将荧光基团香豆素酸OC7嵌入到靶向端粒的肽核酸序列中，为端粒的检测提供了一种核酸探针分子工具。

Description

一种靶向端粒的核酸探针
技术领域
本发明涉及核酸探针，特别涉及一种靶向端粒的核酸探针。
背景技术
端粒由简单的DNA(脱氧核糖核酸)高度串联重复序列TTAGGG组成，位于染色体末端。端粒与端粒结合蛋白一起构成了特殊的"帽子"结构，保持着染色体的完整性和控制细胞分裂周期。端粒的缺失会引起染色体融合并导致细胞的衰老和死亡。因此端粒的检测对于诊断疾病和控制细胞寿命有着极其重要的意义。
发明内容
1.本发明的目的是提供一种靶向端粒的核酸探针，所述的核酸探针序列为5'-CCCTA-E-CCCTAA-Gly-3',其中E的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
本发明的一种靶向端粒的核酸探针的制备包括如下步骤：
1）合成Fmoc和Alloc保护基团保护的肽核酸骨架Fmoc-aeg(Alloc)-OH,其合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
2）Fmoc-Rink Amide树脂和脱保护剂混合，得到Rink Amide 树脂；
3）Fmoc-Gly-OH与Rink Amide树脂缩合，得到Fmoc-Gly-Rink Amide 树脂；
4）Fmoc-Gly-Rink Amide树脂与其它带有Fmoc保护基团的肽核酸和Fmoc-aeg(Alloc)-OH逐一用缩合剂缩合，封端，脱保护剂脱去Fmoc-保护基团，得到序列为CCCTA-aeg(Alloc)-CCCTAA-Gly肽核酸树脂；
5）肽核酸脱去Alloc保护基团后，极性响应染料香豆素酸OC7通过缩合反应嵌入到肽核酸中，得到一种靶向端粒的核酸探针树脂；
6）加入切割液进行切割，冰乙醚沉淀后，得到一种靶向端粒的核酸探针粗品；
7）用HPLC进行分离纯化，获得目标产物。
进一步的，所述步骤2）中脱保护剂为20%哌啶/DMF溶液,脱除时间2×5mins。
进一步的，所述步骤4）中的封端试剂为AC2O:DIPEA:DMF=1:1:8体积比的混合液，封端时间2mins。
进一步的，所述步骤6）中的切割液为TFA：苯酚：水：TIPS=88:5:5:2体积比的混合液，切割时间2×30mins。
进一步的，所说步骤7）中的HPLC纯化方法是指采用高效液相色谱法纯化，使用反相C18色谱柱，以A相：90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B相：90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比；流速为1mL/min;以流动相B/%（5→5→32→80→90）,Time/min（0→5→15→40→50）的梯度进行多肽的分离提纯，真空冷冻干燥后得到一种靶向端粒的核酸探针。
本发明的有益效果:本发明通过合成Fmoc和Alloc保护基团保护的肽核酸骨架Fmoc-aeg(Alloc)-OH将荧光基团香豆素酸OC7嵌入到靶向端粒的肽核酸序列中，为端粒的检测提供了一种核酸探针分子工具。
附图说明
图1为本发明一种靶向端粒的核酸探针结构示意图；
图2 为本发明一种靶向端粒的核酸探针原理示意图；
图3 为本发明一种靶向端粒的核酸探针的合成路线；
图4为本发明一种靶向端粒的核酸探针的HPLC谱图；
图5为本发明一种靶向端粒的核酸探针的质谱图。
具体实施方式
本发明所使用的缩写的含义列于下表中。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例1：Fmoc-aeg(Alloc)-OH的合成
1.将22mL乙二胺置于圆底烧瓶中，加入145mL DCM，冰浴条件下搅拌滴加30mL DCM和5.5mL溴乙酸叔丁酯的混合液，滴加完后保持冰浴反应5小时，溶液颜色由无色变为黄色，升至室温继续反应12小时，反应结束后加入45mL纯水萃取3次，水相用DCM反萃取一次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥并旋蒸，得到3.4g黄色液体I1。
2.将3.4g黄色液体I1和3.23mL的DIPEA置于圆底烧瓶中，加入142mL DCM溶解，室温条件下搅拌滴加溶于25mL DCM的4.5g Fmoc-Osu,加完后继续反应5小时，溶液逐渐变为白色浑浊状，反应结束后用80mL的1mol/L盐酸萃取3次，45mL的饱和食盐水萃取1次，有机相用无水硫酸钠干燥并旋蒸后得到粗品，粗品重结晶后得到6.77g白色粉末I2。
3）将溶于200mL DCM的1g白色粉末I2用饱和100L NaHCO3清洗3次，有机相用无水Na2SO4干燥过滤后在冰浴条件下加入320uL Et3N,搅拌滴加30mL DCM和245uL Alloc-Cl的混合液,TCL跟踪至原料反应完毕，反应液倒入80mL水中，摇晃均匀后水层用100mL的DCM萃取3次，合并有机相，有机相用45mL饱和食盐水清洗1次，无水Na2SO4干燥并旋蒸后得到粗产物I3,粗产物I3通过柱层析200-300目硅胶（洗脱液由石油醚和乙酸乙酯体积比7：3混合构成）提纯得到0.99g中间体I3。
4）将5mL的DCM,10mL的TFA置于圆底烧瓶中,加入0.99g中间体I3，室温反应3小时，反应结束后减压蒸馏，真空冷冻干燥后得到目标产物0.82g Fmoc-aeg(Alloc)-OH。
实施例2：Fmoc-Gly-Rink Amide 树脂的制备
称取取代度为0.33mmol/g的Fmoc-Rink Amide树脂 3.3mg(1umol)，加入到固相合成管中，用DMF洗涤2次，DMF溶胀树脂30分钟后，取100uL 20%哌啶/DMF溶液反应2×5mins脱除Fmoc-Rink Amide 树脂Fmoc保护基团。DMF洗涤5次后取3.0mg Fmoc-Gly-OH（10umol），4.0mg HCTU（9.8umol）,用100uL的NMP溶解，再加入3.31uL DIPEA（20umol),活化2分钟，加入到固相合成管中，37℃下反应1小时。反应结束后，用DMF清洗树脂3次，然后用配制好的封端试剂(AC2O:DIPEA:DMF=1:1:8,V%)封闭2分钟，DMF洗涤5次。
实施例3：肽核酸树脂的制备
将实施例2中得到的Fmoc-Gly-Rink Amide树脂用DMF清洗5遍，然后用20%哌啶/DMF溶液反应2×5mins后脱除Fmoc保护基团，用DMF清洗5遍。称取3.6mg Fmoc-A（Bhoc)-OH(5umol)，2.6mg PyAop(5umol)用50uL NMP溶解,再加入1.1uL NMM(10umol)，活化2分钟后加入到固相合成管中，37℃混匀反应1小时，然后用配制好的封闭试剂(AC2O:DIPEA:DMF=1:1:8,V%)封闭2分钟，1mL 20%哌啶/DMF溶液反应2×5mins脱除Fmoc保护基团。重复上述操作，按照肽核酸序列依次偶联Fmoc-A(Bhoc)-OH,Fmoc-T-OH,Fmoc-C(Bhoc)-OH,Fmoc-C(Bhoc)-OH,Fmoc-C(Bhoc)-OH,Fmoc-aeg(Alloc)-OH,Fmoc-A(Bhoc)-OH,Fmoc-T-OH,Fmoc-C(Bhoc)-OH,Fmoc-C(Bhoc)-OH,Fmoc-C(Bhoc)-OH。Fmoc-aeg(Alloc)-OH与Fmoc-C(Bhoc)-OH的缩合反应过程中，改称取4.2mg Fmoc-aeg(Alloc)-OH（10umol),5.2mg PyAop(10umol),用140uL NMP溶解，再加入2.2uL NMM(20umol),活化二分钟，混合均匀后加入到固相合成管中，37℃混匀2小时反应。
实施例4：Alloc保护基团的脱除
称取1.15mg Pd(PPh3)4（1umol)，0.62uL PhSiH3(5umol)溶于0.2mL体积比为1:1的DCM和DMF的混合溶液，混合均匀后加入到实施例3后的固相合成管中，混匀常温避光反应3h。反应结束后，依次用DMF（3×0.3mL)、DMF配制的0.5%NaS2CN(C2H5)2（6×0.3mL)、DCM（2×0.3mL)和DMF（2×0.3mL)洗涤树脂至暗棕色消失。
实施例5：一种靶向端粒的核酸探针树脂的制备
称取1.6mg极性响应染料香豆素酸OC7(5umol),2.6mg PyAop(5umol)溶于50uL的NMP中，再加入1.1uL的NMM(10umol),混合均匀后加入到实施例4后的固相合成管中，常温过夜反应，结束后用DMF洗涤5遍。
实施例6：一种靶向端粒的核酸探针的制备
将实施例5后的肽核酸树脂依次用DMF,DCM洗涤二次后，自然干燥15分钟。将200uL的切割试剂（TFA：苯酚：水：TIPS=88:5:5:2（v/v））加入到固相合成管中，室温振荡2×30mins,用1.5mL的EP管收集切割液，树脂再用少量TFA洗涤1次，合并滤液后加入冰乙醚沉淀，离心3次。粗品自然干燥后溶于纯水中，过滤，滤液经反相C18柱进行分离纯化，流动相A:90%水+10%乙腈+0.1%TFA,B:90%乙腈+10%水+0.1%TFA,体积比；流速为1mL/min;检测波长为：210nm。以流动相B/%(5→5→32→80→90),Time/min(0→5→15→40→50)的梯度用高效液相色谱跟踪收集所需要的流出液。其纯化后的HPLC谱图如图4，纯化HPLC纯度97.044%，其质谱图如图5所示，[M+H]+:3383.48、[M+Na]+:3405.85，一种靶向端粒的核酸探针的理论分子量：3382.33，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。

Claims (1)

1.一种靶向端粒的核酸探针,其特征在于，所述的核酸探针序列为5'-CCCTA-E-CCCTAA-Gly-3',其中E的结构式如下：
。
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