CN111549098A

CN111549098A - 测量人端粒精准长度的单分子力学方法

Info

Publication number: CN111549098A
Application number: CN202010546218.2A
Authority: CN
Inventors: 于仲波; 李旭; 王美杰; 郑薇; 黄威; 王泽瑜
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明涉及一种测量人端粒精准长度的单分子力学方法。首先，提取目标细胞的基因组DNA；使用组合酶切，消化基因组，保留端粒DNA；分别采用地高辛和生物素对端粒DNA两端进行亲和标记，从而获得可用于单分子力学测量的端粒DNA结构。其次，将端粒结构固定于链霉亲和素包被的磁珠和抗地高辛抗体铺敷的玻璃表面之间，在单分子仪器上进行DNA力学拉伸实验。最后，使用蠕虫模型，对实测端粒长度进行纳米与碱基对之间的长度转换，即可实现端粒长度的精准测量。本发明属于精密仪器测量分析与细胞分子生物学领域，为细胞研究、健康筛查和临床药物疗效评估开发了一种直接测量端粒精准长度的新方法。

Description

测量人端粒精准长度的单分子力学方法

技术领域

本发明属于精密仪器测量分析与细胞分子生物学领域，尤其是涉及一种使用单分子力谱技术测量人端粒精准长度的方法。

背景技术

端粒是人类寿命的时钟，其长度决定了细胞的命运。端粒位于真核细胞染色体末端，在保持染色体的完整性和控制细胞的分裂周期上起着重要的作用。端粒的DNA序列为5′-TTAGGG-3′的高度重复序列。随着细胞分裂次数的增加，端粒长度因复制损失或DNA损伤修复而变短。当端粒短于关键长度后，会激活凋亡机制，导致细胞凋亡。因此，端粒也被称为细胞命运的生物钟。测量端粒的精准长度，对于流行病学调查、端粒生物学研究、以及靶向端粒的药物研发有非常重要的作用。

目前有多种测量端粒长度的方法，但都有欠精准，比如DNA印记法(Southernblot,SB)、杂交保护分析法(hybridization protection assay,HPA)、荧光原位杂交(FISH)、流式细胞计量-荧光原位杂交(Flow-FISH)、寡核苷酸引物原位DNA合成法(PRINS)、定量PCR(Q-PCR)、单个端粒长度分析(STELA)等。上述方法都是间接测量端粒的长度，并受到高杂背景噪音的困扰。SB、HPA、FISH、Flow-FISH、PRINS需要与探针进行杂交，检测发光强度间接计算端粒长度；Q-PCR根据T/S率测定端粒长度；STELA是在单个染色体水平上基于PCR的端粒测量方法。

单分子力谱技术近年兴起，可用于研究DNA长度对力谱的响应。单分子力谱实验，譬如基于单分子磁镊技术，可以精确测量在可控外力下DNA长度的相应变化。单分子磁镊的高通量属性，允许在体外同时测量成百上千的DNA分子，可迅速积累统计量。

本方法发明了一种直接测量人端粒精准长度的非标记单分子力学方法，而不需要与荧光探针结合检测荧光强度，也不需要通过PCR反应测量端粒的长度，是一种避免了高杂背景噪音的方法。至目前为止，基于单分子力谱测量人端粒精准长度的方法未见报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种测量人端粒精准长度的单分子力学方法。

本发明采用的技术方案是：将细胞基因组DNA进行组合酶切，保留端粒，经亲和标记后，使用单分子力谱测量端粒的精准长度。本发明选择的组合酶是MseI/NdeI/BfaI/CviAII。端粒两端的亲和标记采用地高辛修饰和生物素修饰。端粒结构的生物素修饰端与链霉亲和素包被的微球磁珠相连，端粒结构的地高辛修饰端与反应池表面铺敷的地高辛抗体相连，端粒DNA得以固定在反应池内。在单分子磁镊装置上通过调制磁场强度对微球磁珠施加皮克牛顿级的力，并实时监测磁珠的位置。在MatLab软件环境中分析力与磁珠位置的关系曲线，测定端粒DNA结构的长度(即磁珠位置最高点与最低点之间的差值)。基于蠕虫模型，对实测长度进行纳米碱基对的换算，最终获得端粒的长度。本发明可以用于测量人端粒长度，为测量端粒长度提供了一条更新、更精准的技术路线。

本发明提供的测量人端粒精准长度的方法的具体步骤如下所示：

1)对人慢性髓系白血病细胞K562细胞进行细胞复苏、细胞换液、细胞传代。

2)对K562细胞进行基因组的提取。

3)对基因组进行片段化和修饰。

4)对修饰后的端粒结构进行力学拉伸，测量端粒的长度，将长度转化为碱基对数，测得端粒精确长度。

步骤1)中细胞复苏：从液氮中取出K562细胞于37℃水浴中持续摇晃，使细胞快速解冻。细胞解冻后，补加2ml完全培养基(RPMI medium添加终浓度为10％的胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素溶液)，700rpm离心。弃去上清液，加入5ml完全培养基重悬细胞，转入60mm培养皿中，于37℃、5％CO₂培养箱中静置培养24小时。细胞换液：从培养箱中取出培养皿置于生物安全柜中。用移液枪吸取并弃去上清液，沿培养皿侧壁加入5ml完全培养基，轻摇混匀并继续培养24小时。细胞传代：从培养箱中取出细胞培养皿，置于生物安全柜中。用1ml移液枪吸取培养基反复吹打使贴壁细胞从培养皿底部完全脱落，将细胞移至50ml离心管中，700rpm离心5分钟，弃去上清液。取5ml完全培养基重悬细胞，补加15ml完全培养基并将细胞悬液分至2个100mm培养皿，于培养箱中继续培养24小时。

步骤2)中人慢性髓系白血病细胞K562细胞基因组的提取为：使用DNeasy Bloodand Tissue Kit基因组提取试剂盒进行细胞基因组的提取。详细使用方法见试剂盒使用说明书。提取的基因组DNA样品通过1％琼脂糖凝胶电泳评价所得基因组的完整性。

步骤主要为：收集细胞(约5x10⁶个)并用PBS(pH 7.4)清洗两遍，用200μl PBS溶液重悬细胞，加入20μl protein K溶液，涡旋混匀；向细胞悬液中加入200μl缓冲液LA，涡旋混匀，于56℃水浴10分钟。使细胞悬液变澄清；将溶液转移至吸附柱内，12000rmp离心至液体完全转移至收集管。弃去废液后用缓冲液AW1洗一次，用缓冲液AW2洗两次。将吸附柱置于60℃烘箱烘干吸附柱中残留液体；加入70μl去离子水洗脱目标基因组，用NANODROP 8000测定样品浓度；使用1％琼脂糖凝胶电泳试验评估基因组的完整性，电泳条件设置为电压200伏特、电流150毫安，电泳时间为50分钟，电泳缓冲液为1×TAE。

步骤3)中提取的基因组首先被限制性内切酶消化，消化后的基因组被片段化。使用Klenow fragment(3′-5′exo-)聚合酶将含有地高辛(Digoxigenin)修饰的dUTP(Digoxigenin-11-dUTP)引入DNA片段5′末端。使用含生物素修饰的寡核苷酸探针识别含有端粒重复序列的特定DNA片段。标记后的样品直接用于单分子力学测量，主要步骤如下：取20μg基因组DNA于0.2ml PCR小管中，加入5μl 10×Cutsmart缓冲液，加入10个单位的限制性核酸内切酶CviAII，用去离子水补足至50μl，于25℃反应12小时；向上述反应体系中分别加入10个单位的限制性内切酶Ndel、Msel和Bfal，于37℃反应12小时；80℃加热20分钟灭活限制性核酸内切酶。取2μg消化后的产物片段用于DNA末端地高辛修饰，加入2μl 10×NEB缓冲液2，分别加入终浓度为0.2mM的dATP和0.2mM Digoxingenin-11-dUTP，以及10个单位的klenow fragment(3′-5′exo-)，用去离子水补足体积至20μl，将反应混合物置于37℃反应12小时；将上述所得样品与生物素修饰探针混合并进行梯度退火试验，本试验所得产物可通过与链霉亲和素包被的磁球结合实现进一步纯化。

步骤4)中对于单分子磁镊实验，力坡实验的力学操纵模式为：整个过程为力线性增加后线性降低，力从0皮牛顿线性增加至17皮牛顿，力的增速为4皮牛顿/秒，然后力从17皮牛顿线性降低至0皮牛顿，力的降低速度为4皮牛顿/秒。

本发明中使用单分子磁镊实时采集磁珠位置图像，采样频率为200Hz，对磁珠位置变化反应的分子长度进行柱状图统计。通过相应力下纳米碱基对转换系数，获得DNA的碱基对数，DNA长度随着力变化的关系符合公式1，

其中F为力，x为长度，P为持续长度，L₀为轮廓长度，k为玻尔兹曼常数，T为温度，S为弹性拉伸模量，根据Bosco,A.所述(PMID:24225314)，工作条件下P为51.1纳米，K为4.1皮牛顿·纳米，S为1006皮牛顿，据此计算出的转换系数为0.33纳米/碱基对。

本发明具有的优点和积极效果是：本方案提供了一种测量人端粒精准长度的单分子力学方法；组合酶切最大可能消化了亚端粒区，将亚端粒区对长度测量的影响降到最低；在端粒两端引入地高辛修饰和生物素修饰，构建可用于力学操控的端粒结构物；应用单分子磁镊测量端粒长度对力谱的响应，借助蠕虫模型，换算端粒的碱基对长度，从而获得端粒的精准长度。本方案可用于人群端粒长度的流行病学调查，临床患者端粒长度的评分，分子细胞生物学实验，以及药物药理和毒理研究。

附图说明

图1是从K562细胞基因组中制备端粒结构的流程图；

图2是单分子磁镊测量端粒DNA长度的实验装置；

图3是单分子磁镊控力模式；

图4是端粒长度对力响应关系图；

图5是力与纳米碱基对转化系数曲线图；

图6是端粒长度统计分布图。

具体实施方式

下述结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。

本发明的目的在于提供一种应用单分子力谱技术来精密测量人细胞染色体端粒长度的方法。本方案，如图1所示，收集目标细胞，提取其基因组，使用组合酶消化端粒之外的DNA，获得端粒DNA。在端粒DNA两端进行地高辛和生物素标记后，在微流控反应池中，通过亲和反应将端粒两端分别固定于玻片和磁球表面之间。进而用高通量单分子磁镊装置测量端粒DNA的精确长度。具体为，在优选磁球和DNA混合比例下，调制磁场强度，以优选的速度增减外力操控分子伸缩，测量端粒DNA对外力的长度响应。基于端粒分子对外力响应的测量数据，运用蠕虫模型，解析端粒的精确长度。本方法对细胞染色体端粒进行直接采样测量，避免了信号扩增过程引入的偏差。此外，本方法对不同长度的端粒DNA测量精度一致，避免了短端粒在凝胶图像分析和荧光标记测量中面临的高背景噪音难题。

应用单分子力谱技术精密测量人细胞染色体端粒长度的方法具体包括如下步骤：

1)收集目标细胞，提取其基因组；

2)限制性内切酶组合消化基因组，并保留端粒DNA；

3)端粒DNA双链区亲和修饰与单链区亲和探针标记；

4)微流控反应池内固定端粒DNA；

5)调制磁场强度，操控端粒分子长度伸缩；

6)运用蠕虫模型，解析端粒的精确长度。

本发明对人源细胞具有普适性，目标细胞可以是人组织中含有染色体的细胞样本，譬如白细胞；也可以是培养的细胞系，譬如K562白血病细胞。对人源细胞的端粒长度进行分析，可以用于流行病学调查，或临床相关指征筛查，以及相关药物治疗评分反馈。对细胞系端粒长度进行分析，可以用于细胞分子生物学试验，或药物发现，以及药理毒理研究。提取细胞基因组可采用实验室自建规程或者商业化试剂盒流程。本方案以K562细胞系和商业化基因组提取试剂盒为例做出进一步说明。

从人染色体基因组获取端粒DNA片段，需要使用限制性内切酶消化非端粒DNA。因为人端粒DNA只含有TTAGGG重复基序，所以限制性内切酶的选择范围大而广。人染色体的亚端粒区在端粒上游，由TTAGGG重复基序突变而来。染色体消化后，亚端粒的残留长短，严重影响端粒长度的精确测量。本方案优选限制性内切酶组合，MseI/NdeI/BfaI/CviAII。该限制性内切酶组合满足上述多个端粒DNA片段制备的技术要求。第一，该组合对端粒无损。第二，该组合完全消化基因组非端粒区。第三，该组合对染色体亚端粒区进行最大程度酶切，对端粒长度测量的影响降到最低。第四，MseI/NdeI/BfaI可在相同的缓冲液条件下进行共酶切反应和灭活，简化步骤，缩短流程。

端粒DNA具有双链区和单链区两个特征域。酶切消化后保留的端粒双链区含有以TA或AT结尾的断端。在该断端进行亲和标记(如图1所示)，需要使用没有外切酶活性的DNA聚合酶。该方案采用Klenow fragment(3′-5′exo-)，其既保留了DNA聚合酶活性，又丢失了5′-3′和3′-5′双向外切酶活性，对端粒单链区无损。携带亲和标记的非天然核苷酸选择广泛，使该发明的技术路线宽广而灵活。综合考虑实验传统和经济成本，本方案采用地高辛标记的dUTP对端粒双链区断端进行亲和标记，后续可进行地高辛和抗地高辛抗体之间的亲和反应，对端粒双链端进行固定。端粒单链区是5′-TTAGGG-3′重复基序。该基序连续重复4次以上易倾向形成G-四链体高级结构。其互补序列是5′-CCCTAA-3′重复基序。该基序连续重复4次以上后在酸性条件下倾向形成i-motif高级结构。为了避免G-四链体和i-motif对亲和反应的影响，本方案采用重复3次的5′-CCCTAA-3′单链寡聚核苷酸作为捕捉探针，通过DNA碱基互补配对识别端粒单链区。本方案采用寡核苷酸链捕捉探针携带生物素修饰，后续可通过生物素和链霉亲和素之间的亲和反应对端粒单链区进行固定。

在微流控反应池内固定端粒DNA，需要在玻璃基底上覆盖抗地高辛抗体，还需要在磁球表面耦合链霉亲和素。或者相反，在玻璃基底上耦合链霉亲和素，在磁球上耦合抗地高辛抗体。表面化学处理可采用实验室自建规程，或商业化制品。本方案对微流控玻璃基底进行抗地高辛表面处理，并采用商业化的携带链霉亲和素的磁球。因为玻璃表面抗地高辛抗体密度和磁球数量对端粒DNA的单分子固定有显著影响，优选的，本方案采用的抗体孵育条件是22℃，12小时；M270磁球用量是7.5mg/ml，60μl。

使用磁镊对端粒DNA进行力学操控，磁场调制模式有多种选择，譬如力坡、力跳和恒力。本方案选择力坡模式，如图2所示，即磁镊对磁球施加的作用力，以固定的速度增减力，优选速度是4皮牛顿/秒，从而对端粒DNA进行伸缩操控。优选的，本方案在0皮牛顿和17皮牛顿之间测量端粒DNA的长度，即单分子力谱测量。

端粒DNA长度以公制纳米为单位，对外力具有弹性响应，符合蠕虫模型。如公式1所示：

运用公式1，基于单分子力谱测量数据，可精确解析以碱基对为单位的端粒长度。

下面通过具体实施例对本方案进一步说明。

实施例1收集人慢性髓系白血病细胞K562细胞，提取细胞基因组

1K562细胞的收集

1.1K562细胞的复苏与换液

从液氮中取出1管细胞(1.5ml，约5×10⁶个细胞)进行快速解冻，补加2ml完全培养基(RPMI medium添加终浓度为10％的胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素溶液)。室温下700rpm离心5分钟，弃上清液，加5ml完全培养基重悬。接着将细胞转入60mm培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱中。细胞贴壁，并增殖生长。静置培养24小时后，换液一次。取出细胞培养皿，置于生物安全柜中，弃去培养基上清液，取5ml完全培养基沿培养皿侧壁缓慢加入。继续培养24小时。从培养箱中轻轻取出细胞培养皿(保持水平)，放置于生物安全柜中，再换液一次。用移液枪轻轻吸出并弃去培养基上清液，取5ml完全培养基沿着培养皿侧壁缓慢加入，继续培养24小时。

1.2细胞传代

从培养箱中轻轻取出细胞培养皿(保持水平)，放置生物安全柜中。用移液枪吸出部分上清液并反复吹打，使细胞从培养皿底部完全脱落。将细胞悬液转移至50ml离心管，700rpm离心5分钟，弃去上清液。取5ml完全培养基重悬细胞，补加15ml完全培养基并将细胞悬液均分至2个100mm培养皿，于37℃、5％CO₂培养箱继续培养24小时。

2提取K562细胞基因组

使用基因组提取试剂盒DNeasy Blood and Tissue Kit(货号：DC102-01,Qiagen)。详细使用方法见试剂盒使用说明书。提取的基因组DNA样品通过1％琼脂糖凝胶电泳评价所得基因组的完整性。

实施例2限制性内切酶组合消化基因组，保留端粒DNA

回收的基因组用限制性核酸内切酶(CviAII/NdeI/MseI/BfaI)消化。取20μg基因组DNA于0.2ml PCR管中，加入5μl 10×Cutsmart缓冲液、10个单位的限制性核酸内切酶CviAII(货号：R0640L，NEB)，用去离子水补足至50μl，于25℃反应12小时。向以上反应体系中分别加入10个单位的限制性核酸内切酶NdeI(货号：R0111S，NEB)、MseI(货号：R0525S，NEB)和BfaI(货号：R0568S，NEB)，于37℃反应12小时。80℃加热20分钟，使以上限制性核酸内切酶失活。

实施例3端粒DNA双链区亲和修饰和单链区亲和探针标记

3.1对端粒DNA末端进行地高辛修饰

取2μg基因组DNA消化产物，加入2μl 10×0NEB缓冲液2，分别加入终浓度为0.2mM的dATP(货号：4026Q，宝日医生物技术公司)和0.2mM Digoxigenin-11-dUTP(货号：11093070910，罗氏公司)，以及10个单位的Klenow Fragment(3′-5′exo-)聚合酶(货号：M0212S，NEB)，用去离子水补足体积至20μl。将反应混合物置于37℃反应12小时，使样品反应充分。

3.2对端粒DNA末端进行生物素修饰

将10μl(2.4μg)上步产物与2.4μl(2.4pmol)生物素修饰探针(Biotin-CCCTAACCCTAACCCTAA)混合并进行梯度退火试验。梯度退火程序为75℃，3分钟；75-25℃(每8秒降低0.1℃，共500个循环)；25℃，3分钟；4℃保存。

实施例4微流控反应池内固定端粒DNA

取两片60mm×24mm玻片，用TC-169多功能打磨雕切机在其中一个玻片的两端中间位置打两个小孔，分别作为进样孔与出样孔。然后，依次进行以下清洗步骤：加入去污剂的超纯水超声30分钟，纯水清洗3次；加入纯水超声30分钟，纯水清洗3次；加入异丙醇超声30分钟，纯水清洗3次；浸泡在75％乙醇数小时后氮气吹干。将1％的硝酸纤维素用无水乙醇稀释至0.1％，再用0.1％的硝酸纤维素7倍稀释250mg/10ml的单分散聚丙乙烯小球(货号：PSC-03000，大鹅(天津)科技有限公司)。取8μl上述稀释好的聚丙乙烯小球均匀涂抹在未打孔玻片上，作为磁珠的参照物。100℃加热3分钟使小球固定于玻片表面。打孔玻片上放置切割好通道的双层封口膜(parafilm)，在85℃加热条件下与未打孔玻片粘合。玻璃上的进样孔、出样孔和封口膜通道构成微流控反应池。向反应池中加入70μl 0.1mg/ml抗地高辛抗体(货号：11214667001，西格玛奥德里奇中国公司)于25℃孵育2小时，之后用70μl 5mg/ml牛血清白蛋白溶液进行过夜封闭。端粒结构可通过地高辛-抗地高辛间相互作用结合在反应池的表面，通过生物素-链霉亲和素之间的相互作用固定于超顺磁球(货号：65305，Invitrogen公司)。进行端粒长度试验前，取2μl端粒DNA加入到含60μl、2.5mg/ml的链霉亲和素磁珠的磁球工作缓冲液中，冰上孵育10分钟后，用磁铁富集磁珠，用移液枪吸出上清液。重复上步一次。补加60μl工作缓冲液(20mM Hepes、100mM NaCl、1mM EDTA、0.063％TW20)重悬磁珠，孵育10分钟后，将样品加入反应池。

实施例5通过调制单分子磁镊磁场强度，操纵端粒分子长度伸缩

本实施例磁镊实验装置使用天津光影微纳科技有限公司生产的磁镊装置。使用磁镊装置对端粒DNA进行力学操纵，选择力坡的磁场调制模式。力坡实验的力学操纵模式为：整个过程为力线性增加后线性降低，力从0皮牛顿线性增加至17皮牛顿，力的增速为4皮牛顿/秒，然后力从17皮牛顿线性降低至0皮牛顿，力的降低速度为4皮牛顿/秒。优选地，基因组DNA片段工作量为2μl。照相机的采样频率为200Hz，可实时采集磁珠位置信息，从而得到端粒结构力、时间、轨迹的实时数据，利用MatLab软件计算可得到结构长度-力的关系。

实施例6运用蠕虫模型，解析端粒的精确长度

端粒DNA长度对外力具有弹性响应，可以通过理论蠕虫模型(公式1)计算得到DNA的长度。

其中F为力，x为长度，P为持续长度，L₀为轮廓长度，k为玻尔兹曼常数，T为温度，S为弹性拉伸模量，根据Bosco,A.所述(PMID:24225314)，工作条件下P为51.1纳米，K为4.1皮牛顿·纳米，S为1006皮牛顿，据此计算出的转换系数为0.33纳米/碱基对。运用公式1，基于单分子力谱测量的数据，可精确解析以碱基对为单位的端粒长度。

以上对本发明的一个实施例进行了详细的说明，但所述内容仅为本发明较佳的实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims

1.一种测量人端粒长度的单分子力学方法，其特征包含以下步骤：

1)端粒DNA结构由生物素修饰、地高辛修饰和细胞端粒结构组成；

2)细胞端粒结构是由末端限制性片段化法处理细胞基因组得到；

3)地高辛修饰是通过DNA聚合酶对细胞端粒结构进行5′粘性末端补平反应得到；

4)生物素修饰是由生物素修饰的DNA互补单链作为探针与细胞端粒结构单链区退火得到；

5)通过单分子磁镊对端粒DNA结构进行拉伸，统计端粒结构的长度数据，通过做柱形图分析端粒长度的分布。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)所述的地高辛修饰为5′末端地高辛(Digoxigenin-11-dUTP)，生物素修饰为生物素修饰的DNA单链互补探针，细胞端粒结构为人慢性髓系白血病细胞K562细胞端粒区结构。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)所述的细胞端粒结构的末端限制性片段化，为使基因组的非端粒区与亚端粒区尽可能的消化成小片段，以便更好的提取所需细胞端粒结构，DNA末端限制性片段化方法为多位点切割，所选用的限制性核酸内切酶组合为CviAII、BfaI、MseI、NdeI，优选地每种酶的使用量为10个单位，酶切反应后的酶失活采用80℃加热20分钟。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述的地高辛修饰是通过KlenowFragment(3′-5′exo-)聚合酶将含有地高辛修饰的dUTP引入到细胞端粒结构中补平5′突出末端，优选地使用提取的基因组为20mg，反应条件为25℃，12小时。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4)所述的生物素把手是使用生物素修饰的端粒重复寡核苷酸序列5′-TAACCCTAACCCTAACCC-3′作为探针，通过梯度退火试验与细胞端粒单链区互补配对，梯度退火程序：75℃，3分钟；75-25℃(每8秒降低0.1℃，共500个循环)；25℃，3分钟；4℃保存。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5)所述的单分子磁镊对DNA进行力学拉伸的操纵模式为：整个过程为力线性增加和线性降低，力从0皮牛顿线性增加至17皮牛顿，力的增速为4皮牛顿/秒，然后力从17皮牛顿线性降低至0皮牛顿，力的降低速度为4皮牛顿/秒。