CN111254144A - 一种分子尺发夹结构及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法 - Google Patents

一种分子尺发夹结构及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种分子尺发夹结构及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法，首先构建茎干部分含有多个CCGG位点的发夹结构为分子尺发夹结构，将发夹结构固定于工作池表面，使用单分子磁镊实时监测磁珠的位置，计算可以得到分子尺发夹结构于两个相邻停顿态之间的精确长度，亦即相邻CCGG位点间长度。通过长度与碱基对数的转换，可以精确计算长度转换系数，并与蠕虫模型理论值进行比较，从而衡量单分子磁镊空间尺度的准确度。本发明可用于精密仪器准确度的标定，拓宽了衡量精密仪器准确度的方法。

Description

一种分子尺发夹结构及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确 性的方法
技术领域
本发明属于精密仪器测量与分析领域，尤其是涉及一种通过使用DNA长度变化来标定单分子磁镊仪器空间尺度准确性的方法。
背景技术
单分子力谱技术是近年来生物物理领域新兴的精密测量与分析技术，可以在体外或细胞内检测单个分子或分子复合物的动态反应过程。单分子磁镊是流行的单分子力谱技术之一，可对成百上千的单个分子施加外力和扭矩，并进行平行追踪。生物分子的长度及长度变化是单分子磁镊测量的重要指标，可用来计算一系列蛋白质—核酸作用的具体参数。但是单分子磁镊仪器的准确度目前依赖于通过虚焦影像分析，对微球探针进行空间定位。
构建磁镊空间尺度准确性的标准测量方法，需要分子长度理论计算、原子精度分子结构和动态测量分子构象变化等技术。蠕虫模型可计算出DNA在特定缓冲液条件下的单链和双链长度，提供分子长度变化的理论值。锌指结构CXXC家族蛋白识别DNA上的特异位点，形成稳定的蛋白-核酸复合物，已被晶体学方法解析出原子细节的结构。譬如，十-十一易位双加氧酶1(TET1)的CXXC结构域与含CCGG位点的DNA形成稳定的复合体。磁镊通过解链双链DNA，破坏在特异位点上形成的蛋白-核酸复合体，可测量复合体的位置信号，获得DNA长度变化。目前没有衡量单分子磁镊空间尺度准确性的标准方法。
中国专利CN201910380148.5公开了一种单分子磁镊检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法，精密测量了CXXC蛋白与DNA的结合事件。到目前为止，基于蛋白-核酸复合体结合事件和理论模型衡量单分子磁镊空间尺度准确性的方法未见报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种分子尺发夹结构及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法。
本发明采用的技术方案是：一种测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构，茎干部分含有多个CCGG位点。
优选地，CCGG位点数量包括2-20个，各个CCGG位点等距设置；
优选地，相邻两个CCGG位点之间由AT序列隔开，AT序列长度为16-40bp；
优选地，AT序列长度为18bp。
优选地，还包括生物素把手、地高辛把手、第一核酸片段、第二核酸片段、Y字结构、loop结构和组成茎干部分的第三核酸片段和第四核酸片段；
第一核酸片段连接生物素把手和Y字结构，第二核酸片段连接地高辛把手和Y字结构，茎干部分连接loop结构和Y字结构。
优选地，第三核酸片段由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10退火形成，第四核酸片段由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12退火形成。
测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构的制备方法，包括如下步骤：
PCR获得生物素把手及地高辛把手，并对制得的生物素把手及地高辛把手进行酶切；
退火反应制备Y字结构、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构，并进行磷酸化；
将制得的生物素把手、地高辛把手、Y字结构、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构连接得到分子尺发夹结构。
优选地，生物素把手、第一核酸片段、Y字结构、第二核酸片段、地高辛把手、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构添加摩尔比例为1-9:1-3:1:1-3:1-9:1-3:1-9:1-27；
优选地，摩尔比例为6:2:1:2:6:2:4:20。
分子尺发夹结构用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法，包括如下步骤：
通过单分子磁镊施加外力，在工作浓度的TET1 CXXC结构域条件下，收集连接分子尺发夹结构的磁珠实时空间位置，计算纳米/碱基的实测转换系数；
根据理论蠕虫模型计算纳米/碱基的理论转换系数；
比较实测转换系数和理论转换系数衡量单分子磁镊空间尺度准确度。
优选地，单分子磁镊施加外力的力学操控模式为：低力6pN维持55s，测试力14.75pN维持10s，高力30pN维持5s，测试力14.75pN维持5s，低力6pN维持5s，力跳循环数范围可控制为1-100次；
优选地，采取力跳循环50次。
优选地，TET1 CXXC结构域工作浓度优选地使用1-3μM，分子尺发夹结构工作用量优选地使用0.5-1.5ng；
优选地，TET1 CXXC结构域工作浓度优选地使用3μM，分子尺发夹结构工作用量优选地使用0.5ng。
优选地，理论蠕虫模型计算如公式1所示，
Figure BDA0002378535840000031
其中F为力，x为长度，Lp为持久长度，Lc为轮廓长度，KB为玻尔兹曼常数，T为温度。
本发明具有的优点和积极效果是：通过本方案设计的分子尺发夹结构，通过测量其在与TET1 CXXC结构域结合DNA时，磁珠在测试力下处于不同停顿态的位置信息，可以精确地探测单分子磁镊的控制尺度准确度；具体通过长度与碱基对数的转换，可以精确计算长度转换系数，与蠕虫模型理论值进行比较，从而衡量单分子磁镊空间尺度的准确度；本方案可用于精密仪器准确度的标定，拓宽了衡量精密仪器准确度的方法。
附图说明
图1是合成分子尺发夹结构流程图；
图2是合成分子尺发夹结构凝胶电泳结果图；
图3是磁镊力学操控模式及磁珠轨迹图；
图4是磁珠位置柱形图；
图5是转换系数柱形图；
图6是分子尺发夹结构结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
本发明的目的在于提供一种分子尺发夹结构，以及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法。本方案设计的分子尺发夹结构茎干部分含多个CCGG位点，如图6所示，通过单分子磁镊施加外力，通过捕捉工作浓度的TET1 CXXC结构域条件下磁珠在测试力下处于不同停顿态的实时位置信息，可以实时、准确、可重复地探测核酸的实时长度变化，拓宽了核酸长度实时测量的方法。具体为在工作浓度的TET1 CXXC结构域条件下，收集磁珠实时空间位置，运用MatLab软件作图可以得到分子尺发夹结构于两个相邻停顿态之间的精确长度，即分子尺发夹相邻CCGG位点间对应的长度。通过CCGG位点间纳米单位长度测量值，与碱基对数设计值的转换，可以与蠕虫模型理论值进行比较，从而衡量单分子磁镊空间尺度准确度。
衡量单分子磁镊准确度的方法具体包括如下步骤：
1)构建茎干部分含有多个CCGG位点的分子尺发夹结构；
2)对于单分子磁镊采用循环力跳模式，探测蛋白核酸复合体的精确位置；
3)比较蛋白核酸复合体位置测量值与理论值，衡量单分子磁镊空间尺度准确度。
当多个CCGG位点为等距设置时其效果更好，作为标尺作用更明显，可以更好地将长度变化转化为碱基数，CCGG位点可以为2-20个，其长度越长，对准确度的判断越准确，但由于CCGG位点数量较多时会导致分子尺发夹结构过长，构建难度更大，综合检测效果和构建难易程度，本方案以包含八个等距的CCGG位点为例做出进一步说明。
分子尺发夹结构包括生物素把手、地高辛把手、Y字结构、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构，如图1所示，分别制备各个片段，再利用连接反应将上述片段连接再一起形成分子尺发夹结构。第一核酸片段连接生物素把手和Y字结构，第二核酸片段连接地高辛把手和Y字结构，茎干部分连接loop结构和Y字结构。第三核酸片段和第四核酸片段连接构成茎干部分，茎干部分含有八个等距CCGG位点，八个等距CCGG由随机AT序列隔开，AT序列长度可选择16-40bp，当AT序列长度为18bp时效果最为准确。例如为每个CCGG位点之间的距离为22bp，其中包含上一个位点的GG，18bp的随机AT序列，以及下一个位点的CC的结构。
生物素把手通过如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示上下游引物PCR获得，地高辛把手通过如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示上下游引物PCR获得，生物素把手及地高辛把手均为多位点修饰，将获得的片段通过酶切形成粘性接头备用。
SEQ ID NO.1 GACCGAGATAGGGTTGAGTG
SEQ ID NO.2 GCATCGGCTGAGGAAAGGGAACAAAAGCTGG
SEQ ID NO.3 ATCGTAGGGTCCTGACCGAGATAGGGTTGAGTG
SEQ ID NO.4 AAAGGGAACAAAAGCTGG
通过退火构建Y字结构、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构，其中Y字结构通过SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12退火形成，第一核酸片段通过SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6退火形成，第二核酸片段通过SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8退火形成，第三核酸片段通过SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14退火形成，第四核酸片段通过SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16退火形成，loop结构由SEQ IDNO.17退火形成。将退火形成的各个片段磷酸化备用。
SEQ ID NO.5
TCAGCAAGGAAGGAGATTTTGAAAAATTTATTTATTAGATATTGGAAATATTATTAGAG
SEQ ID NO.6
AAATCATCTCCTCTAATAATATTTCCAATATCTAATAAATAAATTTTTCAAAATCTCCTTCCTTGC
SEQ ID NO.7
AATGATGAGTGTTAAAAAAAGTGGGGAAGTGAGTAATGAAATTATTTTGTATGTTTTTTATATGAATTTATTTTTTGGG
SEQ ID NO.8
GACCCCAAAAAATAAATTCATATAAAAAACATACAAAATAATTTCATTACTCACTTCCCCACTTTTTTTAAC
SEQ ID NO.9
CCCTTTTATTATACCATTCTTCATATTTTTTC
SEQ ID NO.10
GAGATGATTTGAAAAAATATGAAGAATGGTATAATAAAAGGGTGATTTATATTTATTTATTCCGGTATTTAATTTAATTATATCCG
SEQ ID NO.11
AATATATAACCGGATATAATTAAATTAAATACCGGAATAAATAAATATAAATCTGGGAGTAGATGTGGTTTTTGTTTGTTTG
SEQ ID NO.12
ACTCATCATTCAAACAAACAAAAACCACATCTACTCCC
SEQ ID NO.13
GTTATATATTTATATTTATCCGGTTTATTTATTATTTATTTCCGGTTATTTATAATTTAATTAC
SEQ ID NO.14
ATAATAACCGGTAATTAAATTATAAATAACCGGAAATAAATAATAAATAAACCGGATAAATATA
SEQ ID NO.15
CGGTTATTATATATTATTTATCCGGTATTTATTTAATTATATTCCGGTTATTTATATATTTATATCC
SEQ ID NO.16
ATATAAATAACCGGAATATAATTAAATAAATACCGGATAAATAATAT
SEQ ID NO.17
GGTTAATATTTATTATATTTTTTTAAATATAATAAATATTAACCGGATATAAAT
将上述制备合成的生物素把手、第一核酸片段、Y字结构、第二核酸片段、地高辛把手、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构按照摩尔比例为6:2:1:2:6:2:4:20混合连接，连接得到分子尺发夹结构。分子尺发夹结构可通过地高辛—地高辛抗体间相互作用固定于工作池玻璃表面，通过生物素—链霉亲和素亲和结合与超顺磁小球连接。
单分子磁镊实验中，如图6所示，单次力跳实验的力学操控模式为：低力6pN维持55s，测试力14.75pN维持10s，高力30pN维持5s，测试力14.75pN维持5s，低力6pN维持5s，力跳循环数范围可控制为1-100次，优选为50次。其中TET1 CXXC结构域工作浓度优选使用3μM，分子尺发夹结构工作用量优选使用0.5ng；单分子磁镊仪器实时采集磁珠位置图像导入计算机，照相机采样频率为200HZ，对磁珠停顿态位置进行高斯拟合，计算所有磁珠轨迹相邻停顿态的长度差，基于设计长度获得纳米碱基实测转换系数。DNA长度可通过理论蠕虫模型计算，如公式1所示：
Figure BDA0002378535840000071
其中F为力，x为长度，Lp为持久长度，Lc为轮廓长度，KB为玻尔兹曼常数，T为温度，计算得到理论转换系数。比较实测转换系数和理论转换系数衡量单分子磁镊空间尺度准确度。
下面通过具体实施例对本申请进一步说明。
实施例1分子尺发夹结构的构建
1生物素把手和地高辛把手的制备
1.1生物素修饰/地高辛修饰的聚合酶链式反应
通过对pbluescrIISK+质粒进行生物素修饰/地高辛修饰的聚合酶链式反应，在反应管中加入：
1μl浓度为10μM的生物素/地高辛把手上游引物，分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.3所示，(引物购自金唯智公司)；
1μl浓度为10μM的生物素/地高辛把手下游引物，分别如SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.4所示，(引物购自金唯智公司)；
1μl 10mM dATP(货号：4026Q，宝日医生物技术公司)；
1μl 10mM dGTP(货号：4027Q，宝日医生物技术公司)；
1μl 10mM dCTP(货号：4028Q，宝日医生物技术公司)；
0.9μl 10mM dTTP(货号：4029Q，宝日医生物技术公司)；
1μl 1mM Bio-16-dUTP(货号：11093070910，罗氏公司)/1μl 1mM Dig-11-dUTP(货号：11093088910，罗氏公司)；
1μl 5ng/μl pbluescrIISK+质粒(购自生工生物工程公司)；
0.25μl Taq DNA聚合酶(货号：EP0402，赛默飞世尔公司)；
3μl 25mM MgCl2溶液；
5μl 10×Taq KCl缓冲液；
33.85μl纯水。
聚合酶链式反应温控循环为：95℃3分钟，95℃30秒，55℃30秒，72℃50秒，循环40次，72℃5分钟，终止在12℃。
使用cycle pure试剂盒(货号：D6492-02，omega公司)进行产物纯化，所得生物素及地高辛把手片段长度为666bp。
1.2酶切制备生物素把手和地高辛把手
生物素把手酶切反应配方为：
56μl第一步所得生物素把手片段(125.0ng/μl)；
18μl 10×CutSmart缓冲液；
17.5μl BbvCI内切酶(货号：R0601S，Neb公司)；
纯水88.5μl。
混匀后均分至四个反应管。
地高辛把手酶切反应配方为：
44μl第一步所得生物素把手片段(134.2ng/μl)；
13.5μl 10×CutSmart缓冲液；
3.5μl PpuMI内切酶(货号：R0506L，Neb公司)；
纯水74μl。
混匀后均分至三个反应管。
将上述反应管在37℃反应12小时。使用cycle-pure试剂盒进行产物纯化即得生物素把手及地高辛把手。
2构建Y字结构、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构
2.1退火反应
Y字结构退火反应体系为：
2μl 50μM序列如SEQ ID NO.9所示核酸链；
2μl 50μM序列如SEQ ID NO.10所示核酸链；
2μl 50μM序列如SEQ ID NO.11所示核酸链；
2μl 50μM序列如SEQ ID NO.12所示核酸链；
2μl 5×DNA退火缓冲液(货号：SL3220，碧云天生物技术公司)。
第一核酸片段退火反应体系为：
8μl 50μM序列如SEQ ID NO.5所示核酸链；
8μl 50μM序列如SEQ ID NO.6所示核酸链；
4μl 5×DNA退火缓冲液。
第二核酸片段退火反应体系为：
8μl 50μM序列如SEQ ID NO.7所示核酸链；
8μl 50μM序列如SEQ ID NO.8所示核酸链；
4μl 5×DNA退火缓冲液。
第三核酸片段退火反应体系为：
8μl 50μM序列如SEQ ID NO.13所示核酸链；
8μl 50μM序列如SEQ ID NO.14所示核酸链；
4μl 5×DNA退火缓冲液。
第四核酸片段退火反应体系为：
8μl 50μM序列如SEQ ID NO.15所示核酸链；
8μl 50μM序列如SEQ ID NO.16所示核酸链；
4μl 5×DNA退火缓冲液。
Loop结构的退火反应体系为：
20μl 50μM序列如SEQ ID NO.17所示核酸链；
5μl 5×DNA退火缓冲液。
以上退火反应温控程序为：98℃3分钟，以-0.1℃/8秒的降温速率梯度降温至25℃，25℃3分钟，终止在12℃。
2.2磷酸化反应
Y字结构磷酸化反应体系为：
1μl Y字结构退火产物；
2μl 10×T4 DNA连接反应缓冲液；
2μl T4磷酸激酶(货号：2021A，宝日医生物技术公司)；
15μl纯水。
第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构的磷酸化反应体系为：
0.5μl对应的退火产物；
2μl 10×T4 DNA连接反应缓冲液；
2μl T4磷酸激酶；
15.5μl纯水。
上述磷酸化反应体系磷酸化温控程序为：37℃90分钟，70℃5分钟，以-0.1℃/8秒的降温速率梯度降温至25℃，25℃3分钟，终止在12℃。
3连接构建分子尺发夹结构
连接反应体系为：
24μl生物素把手(3pmole)；
15.3μl地高辛把手(3pmole)；
1μl Y字结构(0.5pmole)；
2μl第一核酸片段(1pmole)；
2μl第二核酸片段(1pmole)；
2μl第三核酸片段(1pmole)；
4μl第四核酸片段(1pmole)；
10μl loop结构(10pmole)；
7.5μl 10×T4 DNA连接反应缓冲液；
6μl T4 DNA连接酶(货号：M0202S，NEB公司)；
1.2μl纯水。
连接反应温控程序为：16℃1小时，20℃1小时，25℃1小时，循环3次，最终停止在12℃。
如图2所示合成分子尺发夹结构凝胶电泳结果图，凝胶电泳条件为1％的琼脂糖凝胶，电压100V，时间30分钟；条带1为8000bp DNA标记物，条带2为分子尺发夹结构连接产物混合物，2000bp左右为发夹结构对应条带，其余条带对应的均为副反应产物，经1％琼脂糖电泳分离切胶后，使用Gel-extraction试剂盒(货号：D2500-02，Omega公司)回收分子尺发夹结构对应条带，至此得到磁镊所用分子尺发夹结构。
实施例2通过单分子磁镊施加外力测算纳米/碱基的实测转换系数
本实施例中磁镊实验使用天津光影微纳科技有限公司生产的磁镊装置。分子尺发夹结构可通过地高辛—地高辛抗体间相互作用固定于工作池玻璃表面，通过生物素—链霉亲和素亲和结合与超顺磁小球(M270，货号：65305，Invitrogen公司)相连。
工作池制备流程如下：取两片60mm×24mm的洁净盖玻片，一片用TC-169多功能打磨雕切机打两个孔，作为进水口与出水口，一片均匀涂抹3μm聚苯乙烯小球作为磁珠参照物，在两片玻璃间夹上提前切好反应孔道的双层封口膜，加热使反应池粘合。工作池下表面用90μl 0.1mg/ml抗地高辛抗体(货号：11214667001，西格玛奥德里奇中国公司)于25℃孵育2小时，之后用100μl 5mg/ml牛血清白蛋白溶液进行封闭。通过操控磁铁位置对超顺磁小球施加磁场，从而主动对分子尺发夹施加外力，力的范围可达到0.1–150pN。分子尺发夹结构工作用量为0.5ng，TET1 CXXC结构域工作浓度为3μM。
磁镊装置力学操控模式为：低力6pN维持55s，测试力14.75pN维持10s，高力30pN维持5s，测试力14.75pN维持5s，低力6pN维持5s，循环次数50次。
照相机采样频率为200HZ，可实时采集磁珠空间位置，从而得到发夹结构力、时间、轨迹的实时数据，利用MatLab软件计算可得到结构长度—时间的关系，对磁珠停顿态位置进行高斯拟合，测算得到纳米/碱基的实测转换系数。如图3-5所示，图3是磁镊力学操控模式及磁珠轨迹图；上图为单次循环力学操控模式，下图为磁珠轨迹图。当磁铁施加低力时，发夹结构处于关闭态；当系统中存在工作浓度蛋白，磁铁施加测试力时，发夹结构可能会处在不同的停顿态；当磁铁施加高力时，发夹结构处于拉伸态；图4是磁珠位置柱形图；曲线部分为高斯模型拟合曲线，长度差为相邻CCGG位点高斯峰中心值差值；图5是转换系数柱形图。计算所有磁珠轨迹相邻停顿态的长度差，基于设计长度获得纳米碱基转换系数0.46±0.04纳米/碱基。
实施例3根据理论蠕虫模型计算纳米/碱基的理论转换系数
DNA长度可通过理论蠕虫模型计算，如公式1所示，其中F为力，x为长度，Lp为持久长度，Lc为轮廓长度，KB为玻尔兹曼常数，T为温度。
Figure BDA0002378535840000121
根据Bosco,A.在文章Elastic properties and secondary structureformation of single-stranded DNA at monovalent and divalent salt conditions(PMID:24225314)中描述的工作条件下，选用Lp为0.87纳米，Lc为0.69纳米/碱基，据此计算出的理论转换系数为0.48纳米/碱基。
比较本实施例实测转换系数与理论转换系数偏差为4％，因此，所用仪器单分子磁镊的空间尺度准确度为96％。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种分子尺发夹结构及其用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法
<130> 2020
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaccgagata gggttgagtg 20
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatcggctg aggaaaggga acaaaagctg g 31
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcgtagggt cctgaccgag atagggttga gtg 33
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaagggaaca aaagctgg 18
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcagcaagga aggagatttt gaaaaattta tttattagat attggaaata ttattagag 59
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatcatctc ctctaataat atttccaata tctaataaat aaatttttca aaatctcctt 60
ccttgc 66
<210> 7
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgatgagt gttaaaaaaa gtggggaagt gagtaatgaa attattttgt atgtttttta 60
tatgaattta ttttttggg 79
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaccccaaaa aataaattca tataaaaaac atacaaaata atttcattac tcacttcccc 60
acttttttta ac 72
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccttttatt ataccattct tcatattttt tc 32
<210> 10
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagatgattt gaaaaaatat gaagaatggt ataataaaag ggtgatttat atttatttat 60
tccggtattt aatttaatta tatccg 86
<210> 11
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatatataac cggatataat taaattaaat accggaataa ataaatataa atctgggagt 60
agatgtggtt tttgtttgtt tg 82
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
actcatcatt caaacaaaca aaaaccacat ctactccc 38
<210> 13
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gttatatatt tatatttatc cggtttattt attatttatt tccggttatt tataatttaa 60
ttac 64
<210> 14
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ataataaccg gtaattaaat tataaataac cggaaataaa taataaataa accggataaa 60
tata 64
<210> 15
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cggttattat atattattta tccggtattt atttaattat attccggtta tttatatatt 60
tatatcc 67
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atataaataa ccggaatata attaaataaa taccggataa ataatat 47
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggttaatatt tattatattt ttttaaatat aataaatatt aaccggatat aaat 54

Claims (10)

1.一种测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构，其特征在于：茎干部分含有多个CCGG位点。
2.根据权利要求1所述的测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构，其特征在于：CCGG位点数量包括2-20个，各个CCGG位点等距设置；
优选地，相邻两个CCGG位点之间由AT序列隔开，AT序列长度为16-40bp；优选地，AT序列长度为18bp。
3.根据权利要求1或2所述的测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构，其特征在于：还包括生物素把手、地高辛把手、第一核酸片段、第二核酸片段、Y字结构、loop结构和组成所述茎干部分的第三核酸片段和第四核酸片段；
所述第一核酸片段连接所述生物素把手和所述Y字结构，所述第二核酸片段连接所述地高辛把手和所述Y字结构，所述茎干部分连接所述loop结构和所述Y字结构。
4.根据权利要求3所述的测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构，其特征在于：所述第三核酸片段由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14退火形成，所述第四核酸片段由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16退火形成。
5.制备权利要求1-4中任一所述的测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构的方法，其特征在于：包括如下步骤：
PCR获得生物素把手及地高辛把手，并对制得的生物素把手及地高辛把手进行酶切；
退火反应制备Y字结构、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构，并进行磷酸化；
将制得的生物素把手、地高辛把手、Y字结构、第一核酸片段、第二核酸片段、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构连接得到分子尺发夹结构。
6.根据权利要求5所述的测量单分子磁镊空间尺度准确性的分子尺发夹结构的制备方法，其特征在于：生物素把手、第一核酸片段、Y字结构、第二核酸片段、地高辛把手、第三核酸片段、第四核酸片段和loop结构添加摩尔比例为1-9:1-3:1:1-3:1-9:1-3:1-9:1-27；优选地，摩尔比例为6:2:1:2:6:2:4:20。
7.将权利要求1-4中任一所述的分子尺发夹结构用于测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
通过单分子磁镊施加外力，在工作浓度的TET1 CXXC结构域条件下，收集连接所述分子尺发夹结构的磁珠实时空间位置，计算纳米/碱基的实测转换系数；
根据理论蠕虫模型计算纳米/碱基的理论转换系数；
比较实测转换系数和理论转换系数衡量单分子磁镊空间尺度准确度。
8.根据权利要求7所述的测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法，其特征在于：单分子磁镊施加外力的力学操控模式为：低力6pN维持55s，测试力14.75pN维持10s，高力30pN维持5s，测试力14.75pN维持5s，低力6pN维持5s，力跳循环数范围可控制为1-100次；
优选地，采取力跳循环50次。
9.根据权利要求7所述的测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法，其特征在于：TET1CXXC结构域工作浓度优选地使用1-3μM，分子尺发夹结构工作用量优选地使用0.5-1.5ng；
优选地，TET1 CXXC结构域工作浓度优选地使用3μM，分子尺发夹结构工作用量优选地使用0.5ng。
10.根据权利要求7所述的测量单分子磁镊空间尺度准确性的方法，其特征在于：理论蠕虫模型计算如公式1所示，
Figure FDA0002378535830000021
其中F为力，x为长度，Lp为持久长度，Lc为轮廓长度，KB为玻尔兹曼常数，T为温度。
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