CN112255396A - 一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法。首先，设计和构建基于DNA发卡结构物的单分子反应器。DNA发卡结构物的茎干部分包含与蛋白互作的基序，把手部分通过聚合酶链式反应进行地高辛和生物素标记。其次，制备与DNA互作的蛋白。再次，将DNA发卡结构物固定在磁珠和玻璃片之间，在微流控反应池内通过单分子力学方法进行DNA解链实验。最后，系统测试小分子药物浓度对结合了蛋白的DNA的解链反应的影响，绘制药物剂量‑响应曲线，计算半数抑制浓度，评估小分子药物对蛋白核酸互作的药效。本发明属于生物大分子互作和单分子药理学领域，为分子生物学研究、药物开发和药理评估开发了一种直接测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物大分子互作和单分子药理学领域，尤其是涉及一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法。
背景技术
氨基酸基序在蛋白的结构和功能中发挥重要的作用，并且普遍是药物靶点。譬如，骨髓清除药物白消安(Busulfan)能够将氧化还原酶蛋白CXXC基序中的半胱氨酸转化成为脱氢丙氨酸和羊毛硫氨酸。再如，蛋白激酶PKCθ通过CXXC基序与CD28相互作用，成为小分子药物二甲基富马酸酯(dimethyl fumarate，DMF)的作用靶点。因为越来越多的DMF靶点得以鉴别，譬如，NF-kappaB和GAPDH，DMF能够治疗的疾患也有望能从银屑病和多发性硬化症扩展到肿瘤。事实上，对蛋白靶点中的基序进行选择性的修饰是目前药物研发中流行的方法和策略。
药物靶点的鉴别和对剂量-响应关系进行量化评估在药物研发中至关重要，而且依赖于有效的生物物理方法。特别值得指出的是，检测方法给出的信号应该稳健而且能够避免人工伪迹。例如，白藜芦醇曾被报道是sirtuin的激动剂，但是后期发现这是一个多肽底物上的荧光标记引起的实验伪迹。也就是说，白藜芦醇的sirtuin激动活性完全依赖于酶底物上共价修饰的荧光基团。
单分子力学技术，作为一种无标记方法，已经在多种药物干预的蛋白核酸互作研究中证明是一种行之有效的量化分析手段。越来越多的研究显示基于磁镊、光镊和纳米孔的技术是研究蛋白核酸互作等药物靶点的极佳平台。例如，单分子磁镊曾经揭示了抗癌药物拓扑替康(Topotecan)阻碍拓扑异构酶I解旋的分子机制。但是，目前依然缺乏稳健通用的单分子检测器来探索药物干预下的蛋白核酸互作机制。
基于单分子磁镊和DNA发卡结构物，本方法发明了一种单分子检测器来研究药物干预下的蛋白核酸互作。这种单分子方法通过对DNA发卡结构物进行解链，测量解链时间。因为蛋白结合能使得蛋白核酸复合物更加稳定，所以蛋白结合时的解链时间就比没有蛋白时更长。如果一种药物能够抑制蛋白核酸复合体的形成，那么药物干预下的蛋白核酸复合体形成就变少，总体稳定性变低，从而导致DNA解链时间变短。因为MLL1蛋白CXXC结构域结合CpG，所以本方法就以MLL1 CXXC为例来使用这一单分子检测器研究蛋白结合DNA的反应。本方法设计了一个CpG DNA发卡结构物，富含AT的背景序列中等距排布了5个CpG位点。CpG位点之间间距20bp，使得蛋白核酸结合位点信号能够做到基线分离。本方法发现外力导致的MLL1 CXXC-CpG复合体解离时间大约需要10毫秒。作为初步的概念验证实验，本方法展示如何通过测量解链时间来发现DMF作用于MLL1 CXXC-DNA复合体的剂量-响应关系。本方法发现，DMF作用于MLL1 CXXC-DNA复合体的半数抑制浓度IC50大约是1μM。这也是DMF靶向CXXC家族蛋白的第一例研究。本方法显示基于磁镊的无标记单分子反应器适用于研究靶向蛋白核酸互作的药物效用。本方法的单分子反应器有望成为药物发现领域的通用方法。而且，至目前为止，基于单分子力学测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的方法未见报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法。
本发明采用的技术方案是：本发明通过基于DNA发卡结构物的单分子反应器检测小分子化合物对于蛋白核酸反应的抑制作用。本发明首先制备单分子反应器DNA发卡结构物。在制备过程中DNA发卡结构物两端分别标记生物素和地高辛，而茎干部分内置蛋白结合序列。在微流控反应池中，本发明通过亲和反应将DNA发卡结构物的两端分别固定在玻片基底和磁球表面之间。然后，基于磁镊仪器，通过DNA解链实验探测蛋白核酸结合反应。调制磁场强度，选择适当的探测力水平，进行DNA解链实验，通过指数回归函数，评估DNA解链时间。进而，在蛋白核酸反应中添加小分子药物，测量小分子药物抑制单分子反应器的响应时间。基于小分子药物抑制单分子反应器的响应时间，运用四参数回归模型，解析小分子药物的半数抑制浓度IC50。本发明通过单分子反应器评估小分子药物对蛋白核酸反应的抑制效果，响应信号稳健，而且样品消耗极少。此外，本发明可方便更换DNA序列，用于不同蛋白的结合反应，并且可以快速评估不同的小分子药物，为药物发现研究提供了一条更新、更精准、更通用的技术路线。
本发明提供的测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法的具体步骤如下所示：
1)制备单分子反应器；
2)微流控反应池内建立单分子反应器体系；
3)单分子反应数据线的归一化处理；
4)测量和评估DNA解链响应时间；
5)运用四参数回归模型，估算半数抑制浓度。
步骤1)制备单分子反应器：DNA发卡结构物把手制备主要步骤如下。DNA发卡结构物把手含有生物素和地高辛修饰，通过聚合酶链式反应进行制备，流程如下。在无酶反应管中添加1微升的生物素/地高辛把手上游引物(浓度为10微摩)，1微升的生物素/地高辛把手下游引物(浓度为10微摩)，dATP、dGTP和dCTP各1微升(10毫摩)，0.9微升的dTTP(10毫摩)，1微升的生物素修饰的尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(浓度为1毫摩)，1微升的地高辛修饰的尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(浓度为1毫摩)，1微升的pbluescrIISK+质粒(浓度为5纳克/微升)，0.25微升Taq DNA聚合酶，3微升25毫摩氯化镁溶液，5微升10×Taq氯化钾缓冲液及33.85微升纯水。聚合酶链式反应热循环为：95℃DNA双链变性分离3分钟，95℃变性30秒，55℃引物结合30秒，72℃延长50秒，40个循环，72℃最终延长5分钟，12℃停止反应。DNA产物纯化使用cycle pure试剂盒。
DNA发卡结构物把手的酶切反应主要步骤如下。生物素把手酶切反应配方如下。56微升生物素把手DNA(125.0纳克/微升)，18微升10×CutSmart缓冲液，17.5微升BbvC I限制性内切酶，88.5微升纯水，混匀，四个反应管均分。地高辛把手酶切反应配方如下。44微升地高辛把手DNA(134.2纳克/微升)，13.5微升10×CutSmart缓冲液，3.5微升PpuM I限制性内切酶，74微升纯水，混匀，三个反应管均分。在37℃，孵育12小时。加热终止反应。使用分离纯化试剂盒，收集生物素DNA把手和地高辛DNA把手。
退火制备DNA发卡结构片段主要步骤如下。核酸关节片段退火反应体系如下。向反应管中加入8微升的各种关节寡核苷酸(浓度均为50微摩)，10微升的5×退火缓冲液，补充纯水使总体积为50微升。发卡茎干茎环结构退火反应体系如下。向反应体系中加入8微升的茎干茎环寡核苷酸(浓度均为50微摩)，10微升的5×退火缓冲液，总体积50微升。执行退火反应温控程序为：98℃变性3分钟，然后梯度降温，速率为-0.1℃/8秒，至25℃保持3分钟，最终保存在12℃。
磷酸化DNA发卡结构片段主要步骤如下。磷酸化反应体系如下。1微升结构片段，2微升10×T4 DNA连接酶缓冲液，2微升T4磷酸激酶，15微升纯水。37℃反应90分钟，然后70℃反应5分钟，最后以-0.1℃/8秒的降温速率梯度降温至25℃，保持3分钟，最后停止在12℃。
连接反应获得单分子反应器主要步骤如下。连接反应体系如下。13.6微升生物素把手(3皮摩尔)，17.6微升地高辛把手(3皮摩尔)，1微升DNA发卡结构片段(1皮摩尔)，5微升10×T4 DNA连接酶缓冲液，5微升T4 DNA连接酶(，纯水补充至50微升体积。16℃反应1小时，20℃反应1小时，25℃反应1小时，循环3次，最终停止在12℃。1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，试剂盒回收。至此，得到DNA发夹结构物单分子反应器。
步骤2)微流控反应池内建立单分子反应器体系主要步骤如下：首先制备微流控反应池。在多功能打磨雕切机上，对一个玻片在两端位置分别打孔，用于液体进样和出样。然后超声清洗。玻片浸入加入洗洁精的水中，超声清洗30分钟。更换纯水清洗3次，每次5分钟。更换异丙醇，超声30分钟。更换纯水，清洗3次，每次5分钟。更换75％乙醇，浸泡数小时。最后氮气吹干。铺敷硝酸纤维素，并固定参考小球。取1％的硝酸纤维素储存液，掺入单分散聚丙乙烯小球，并用无水乙醇稀释至0.1％。取8μl混有聚丙乙烯小球的0.1％硝酸纤维素，均匀涂抹在未打孔玻片上。在加热至100℃的电炉平板上，将铺敷硝酸纤维素的玻片加热3分钟，将小球固定在玻片上。
组装微流控反应池主要步骤如下。在带孔玻片上放置切割了反应池通道的双层封口膜，与铺敷了硝酸纤维素的玻片组装成三明治结构。在加热至85℃的电炉平板上，加热融化封口膜，粘合微流控反应池玻片。至此，玻璃、封口膜、进样孔、出样孔和封口膜通道共同组装成微流控反应池。
制备微流控反应池抗体表面主要步骤如下。通过进样孔，向反应池中注入70微升0.1mg/ml的抗地高辛抗体。室温孵育30分钟。缓冲液10倍体积冲洗后，注入70微升5mg/ml新生牛血清白蛋白，过夜封闭微流控反应池表面。
建立单分子反应器主要步骤如下。取20微升表面包被了链霉亲和素的磁球，反应缓冲液清洗5次，最后混悬于70微升反应缓冲液中。加入1纳克DNA发卡结构物，混匀，静置15分钟，允许DNA发卡结构物通过生物素-链霉亲和素反应固定于磁球表面。将携带DNA发卡结构物的磁球注入微流控反应池。DNA发卡结构物的一端通过地高辛-抗地高辛互作，结合在反应池的表面；而另一端通过生物素-链霉亲和素互作固定于磁球。至此，磁镊装置上，微流控反应池内，建立了单分子反应器。
磁镊装置通过磁球对DNA发卡结构物进行力学操控主要步骤如下。实验模式可选择力坡或力跳模式。力坡模式的磁场操纵模式为：操控力呈线性增减，譬如，先从0皮牛顿线性增加至30皮牛顿，增速为4皮牛顿/秒；然后操控力从30皮牛顿线性降低至0皮牛顿，减速为-4皮牛顿/秒。力跳模式可依据实验需求灵活设置。
步骤3)单分子反应数据线的归一化处理主要步骤如下。检测蛋白在DNA上的结合位置时，首先对DNA的长度按照碱基单位进行归一化处理。在测试力条件下，归一化处理以DNA发卡结构物完全解链后的长度为准。每条单分子数据线按照DNA解链后的长度进行自我校准，然后建立直方图。直方图分布中的中间峰，指示蛋白在DNA上的结合位置。参照直方图分布的中间峰，对DNA长度从纳米到碱基数进行转换。
步骤4)测量和评估DNA解链响应时间主要步骤如下。首先定义滞留时间长度。再次定义蛋白结合特定核酸位点的碱基范围。测量蛋白在特定核酸位点上的滞留时间，可以在适当的计算软件中采用步伐拟合算法。最后采用指数回归函数对滞留时间分布进行数据拟合，评估DNA解链响应时间。
步骤5)运用四参数回归模型，估算半数抑制浓度主要步骤如下。获得小分子药物抑制蛋白核酸互作的剂量-响应关系曲线后，本发明基于四参数回归模型进行数据拟合，计算小分子药物的半数抑制浓度IC50。曲线拟合可以在任意数据处理软件中进行。
本发明具有的优点和积极效果是：本方案提供了一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法；单分子反应器基于DNA发卡结构物，发卡茎干部分可以内置多种核酸基序模式，从而实现高通量检测蛋白核酸结合反应；单分子反应器采用稳健的DNA解链时间作为响应信号，实现评估小分子药物抑制蛋白核酸作用的通用性；应用四参数回归模型评估小分子药物抑制蛋白核酸互作，从而获得半数抑制浓度，通过与传统技术对比，获得检测的可靠性。本方案可用于生物大分子互作和单分子药理学领域，为分子生物学研究、药物开发和药理评估开发了一种直接测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的新方法。
附图说明
图1是测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法示意图。
图2是单分子反应器的结构示意图。
图3是单分子反应器DNA解链时间在有无蛋白结合条件下的对比图。
图4是小分子药物抑制蛋白核酸互作的剂量-响应关系图。
具体实施方式
下述结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行。如无特殊说明，具体实施方式中所用到的仪器、试剂和耗材均可从商业公司购买获得。
本发明的目的在于提供一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法。本发明，如图1所示，通过基于DNA发卡结构物的单分子反应器检测小分子化合物对于蛋白核酸反应的抑制作用。本发明首先制备单分子反应器DNA发卡结构物(图2)。在制备过程中DNA发卡结构物两端分别标记生物素和地高辛，而茎干部分内置蛋白结合序列。在微流控反应池中，本方案通过亲和反应将DNA发卡结构物的两端分别固定在玻片基底和磁球表面之间。然后，基于磁镊仪器，通过DNA解链实验探测蛋白核酸结合反应。具体为，在优选磁球和DNA发卡结构物混合比例下，优选蛋白浓度，并调制磁场强度，在优选的探测力水平上进行DNA解链实验，通过指数回归函数，评估DNA解链时间(图3)。进而，在蛋白核酸反应中添加小分子药物，测量小分子药物抑制单分子反应器的响应时间(图4)。基于小分子药物抑制单分子反应器的响应时间，运用四参数回归模型，解析小分子药物的半数抑制浓度IC50。本方法通过单分子反应器评估小分子药物对蛋白核酸反应的抑制效果，响应信号稳健，而且样品消耗极少。此外，本方法可方便更换DNA序列，用于不同蛋白的结合反应，并且可以快速评估不同的小分子药物，通用性很高。
应用单分子反应器测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的力学方法具体包括如下步骤：
1)制备单分子反应器；
2)微流控反应池内建立单分子反应器体系；
3)单分子反应数据线的归一化处理；
4)测量和评估DNA解链响应时间；
5)运用四参数回归模型，估算半数抑制浓度。
本发明对小分子药物干预蛋白核酸互作的单分子反应具有普适性。如图1所示，核酸可以是任意来源的序列，譬如病毒、细菌、寄生虫、动物或人等。蛋白也可以来源于任何生物的单体，譬如病毒、原核生物、真核生物等；也可以是培养的细胞系。对蛋白核酸互作进行单分子分析，可以用于研究分子生物学机制和药物靶点设计等。对小分子药物干预蛋白核酸互作进行分析，可以用于分子生物学试验，或药物发现，以及药理毒理研究。单分子力学装置采用实验室自建仪器或者商业化仪器。本方案以商业化单分子磁镊和基于DNA发卡结构物的自制单分子反应器为例做出进一步说明。
构建基于DNA发卡结构物的单分子反应器，可在发卡结构物茎干部分内置蛋白识别序列。DNA解链实验将茎干部分双链DNA解开成为单链DNA时，因为蛋白结合能增加了DNA双链的稳定性，所以DNA解链时间对蛋白结合与否产生响应。该DNA解链响应时间非常稳健，可用于评估小分子药物干预蛋白核酸互作的效应。稳健的单分子反应器使得本发明具有非常高的通用性和可靠性。
此外，DNA茎干部分内置的蛋白识别基序，可以依据实验需求及逆行多模式设计，譬如，单个核酸基序，均匀分布的多个核酸基序，或者特定距离间隔的定制分布样式等。如图2所示，这种核酸基序的多样化模式，允许单分子反应器高通量测试蛋白核酸互作反应，以及小分子药物对蛋白识别不同核酸基序或基序模式的干预效应。单分子反应器中核酸的多模式设计潜力，使得本发明针对蛋白种类和小分子药物种类都具有高通量检测能力。
微流控反应池为单分子反应器体系的建立提供稳定的检测环境。基于DNA发卡结构物的单分子反应器首先需要在微流控反应池内进行固定。一方面，微流控反应池的玻璃基底上铺敷了抗地高辛抗体。另一方面，磁球表面包被了链霉亲和素。或者相反，亦可在微流控反应池玻璃基底上铺敷链霉亲和素，而在磁球表面包被抗地高辛抗体。表面的化学处理流程可通过实验室自建规程进行，或者采用商业化成品。本方案对微流控反应池的玻璃基底铺敷抗地高辛抗体，并采用商业化的包被了链霉亲和素的磁球。因为反应池表面抗体密度和磁球数量对单分子反应器的固定有明显影响，优选的，本方案采用的抗体孵育条件是室温，30分钟；磁球用量是7.5毫克/毫升，20微升。
磁镊为单分子反应器提供灵活多样的力学操控模式。磁场调制有多种模式可以选择，譬如恒力、力跳和力坡等。本方案优先选择力跳模式，如图3所示，即磁镊对磁球施加的作用力，可在多个操控力之间迅速切换。优选的，本方案选择静息力8皮牛顿，12.5皮牛顿测试力，以及25皮牛顿最大力。
小分子药物干预蛋白核酸互作的剂量-响应关系，可采用多种参数进行评估。如图4所示，优选的，本方案采用回归模型拟合解析小分子药物干预蛋白核酸互作的半数抑制浓度IC50。曲线拟合可以在任意数据处理软件中进行。拟合方法可选择通用方法，譬如最小二乘法。
下面通过具体实施例对本方案进一步说明。
实施例1针对CpG基序构建基于DNA结构物的单分子反应器
表1人工寡核苷酸DNA名称和序列信息
DNA发卡结构物把手制备。DNA发卡结构物把手含有生物素和地高辛修饰，通过聚合酶链式反应进行制备，流程如下。在无酶反应管中添加1微升的生物素/地高辛把手上游引物(表1，浓度为10微摩)，1微升的生物素/地高辛把手下游引物(表1，浓度为10微摩，引物均购自生工生物工程公司)，1微升(浓度为10毫摩)的dATP(货号：4026Q，宝日医生物技术公司)，1微升(浓度为10毫摩)的dGTP(货号：4027Q，宝日医生物技术公司)，1微升的dCTP(浓度为10毫摩，货号：4028Q，宝日医生物技术公司)，0.9微升的dTTP(浓度为10毫摩，货号：4029Q，宝日医生物技术公司)，1微升的生物素修饰的尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(浓度为1毫摩，货号：11093070910，罗氏公司)，1微升的地高辛修饰的尿嘧啶脱氧核糖核苷酸(浓度为1毫摩，货号：11093088910，罗氏公司)，1微升的pbluescrIISK+质粒(浓度为5纳克/微升，购自生工生物工程公司)，0.25微升Taq DNA聚合酶(货号：EP0402，赛默飞世尔公司)，3微升25毫摩氯化镁溶液，5微升10×Taq氯化钾缓冲液及33.85微升纯水。聚合酶链式反应热循环为：95℃DNA双链变性分离3分钟，95℃变性30秒，55℃引物结合30秒，72℃延长50秒，40个循环，72℃最终延长5分钟，12℃停止反应。DNA产物纯化使用cycle pure试剂盒(货号：D6492-02，欧米伽公司)。
DNA发卡结构物把手的酶切反应。生物素把手酶切反应配方如下。56微升生物素把手DNA(125.0纳克/微升)，18微升10×CutSmart缓冲液，17.5微升BbvC I限制性内切酶(货号：R0601S，新英格兰生物公司)，88.5微升纯水，混匀，四个反应管均分。地高辛把手酶切反应配方如下。44微升地高辛把手DNA(134.2纳克/微升)，13.5微升10×CutSmart缓冲液，3.5微升PpuM I限制性内切酶(货号：R0506L，新英格兰生物公司)，74微升纯水，混匀，三个反应管均分。在37℃，孵育12小时。加热终止反应。使用cycle-pure试剂盒，对产物进行分离纯化，收集生物素DNA把手和地高辛DNA把手。
退火制备含有CpG基序的DNA发卡结构片段。核酸关节片段退火反应体系如下。向反应管中加入8微升的各种关节寡核苷酸(表1，浓度均为50微摩)，10微升的5×退火缓冲液，补充纯水使总体积为50微升。DNA发卡的茎干核酸片段含有5个CpG基序位点，用于探测蛋白结合反应。发卡茎干茎环结构退火反应体系如下。向反应体系中加入8微升的茎干茎环寡核苷酸(表1，浓度均为50微摩)，10微升的5×退火缓冲液，总体积50微升。执行退火反应温控程序为：98℃变性3分钟，然后梯度降温，速率为-0.1℃/8秒，至25℃保持3分钟，最终保存在12℃。
磷酸化含有CpG基序的DNA发卡结构片段。磷酸化反应体系如下。1微升结构片段，2微升10×T4 DNA连接酶缓冲液，2微升T4磷酸激酶(货号：2021A，宝日医生物技术公司)，15微升纯水。37℃反应90分钟，然后70℃反应5分钟，最后以-0.1℃/8秒的降温速率梯度降温至25℃，保持3分钟，最后停止在12℃。
连接反应获得含有CpG基序的DNA发夹结构物单分子反应器。连接反应体系如下。13.6微升生物素把手(3皮摩尔)，17.6微升地高辛把手(3皮摩尔)，1微升DNA发卡结构片段(1皮摩尔)，5微升10×T4 DNA连接酶缓冲液，5微升T4 DNA连接酶(货号：M0202S，新英格兰生物公司)，纯水补充至50微升体积。16℃反应1小时，20℃反应1小时，25℃反应1小时，循环3次，最终停止在12℃。1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，使用Gel-extraction试剂盒(货号：D2500-02，Omega公司)回收。至此，得到DNA发夹结构物单分子反应器。
实施例2微流控反应池内建立基于DNA发卡结构物的单分子反应器体系
微流控反应池的制备过程如下。取两片玻片，规格为60毫米×24毫米。在多功能打磨雕切机(型号：TC-169)上，对一个玻片在两端位置分别打孔，用于液体进样和出样。
然后，执行清洗步骤。玻片浸入加入洗洁精的水中，超声清洗30分钟。更换纯水清洗3次，每次5分钟。更换异丙醇，超声30分钟。更换纯水，清洗3次，每次5分钟。更换75％乙醇，浸泡数小时。最后氮气吹干。
铺敷硝酸纤维素，并固定参考小球。取1％的硝酸纤维素储存液，掺入250mg/10ml的单分散聚丙乙烯小球(货号：PSC-03000，大鹅(天津)科技有限公司)，并用无水乙醇稀释至0.1％。取8μl混有聚丙乙烯小球的0.1％硝酸纤维素，均匀涂抹在未打孔玻片上。在加热至100℃的电炉平板上，将铺敷硝酸纤维素的玻片加热3分钟，将小球固定在玻片上。
组装微流控反应池。在带孔玻片上放置切割了反应池通道的双层封口膜，与铺敷了硝酸纤维素的玻片组装成三明治结构。在加热至85℃的电炉平板上，加热融化封口膜，粘合微流控反应池玻片。至此，玻璃、封口膜、进样孔、出样孔和封口膜通道共同组装成微流控反应池。
制备微流控反应池抗体表面。通过进样孔，向反应池中注入70微升0.1mg/ml的抗地高辛抗体(货号：11214667001，西格玛奥德里奇中国公司)。室温孵育30分钟。缓冲液10倍体积冲洗后，注入70微升5mg/ml新生牛血清白蛋白，过夜封闭微流控反应池表面。
建立单分子反应器。取20微升表面包被了链霉亲和素的磁球(货号：65305，Invitrogen公司)，反应缓冲液(10mM Tris、100mM NaCl、1mM EDTA、0.063％TW20)清洗5次，最后混悬于70微升反应缓冲液中。加入1纳克DNA发卡结构物，混匀，静置15分钟，允许DNA发卡结构物通过生物素-链霉亲和素反应固定于磁球表面。将携带DNA发卡结构物的磁球注入微流控反应池。DNA发卡结构物的一端通过地高辛-抗地高辛互作，结合在反应池的表面；而另一端通过生物素-链霉亲和素互作固定于磁球。至此，磁镊装置上，微流控反应池内，建立了单分子反应器。
本实施例中的磁镊装置由天津光影微纳科技有限公司生产。磁镊装置通过磁球对DNA发卡结构物进行力学操控。实验模式可选择力坡或力跳模式。力坡模式的磁场操纵模式为：操控力呈线性增减，譬如，先从0皮牛顿线性增加至30皮牛顿，增速为4皮牛顿/秒；然后操控力从30皮牛顿线性降低至0皮牛顿，减速为-4皮牛顿/秒。优选地，DNA结构物工作用量为1纳克。磁镊的采样频率为200Hz。力跳模式可依据实验需求灵活设置，优选地，本实施例选择静息力8皮牛顿，12.5皮牛顿测试力，以及25皮牛顿最大力。
实施例3 MLL1 CXXC蛋白结合CpG基序的单分子反应数据线的归一化处理
本实施例采用的蛋白是MLL1 CXXC结构域，可特异性识别DNA发卡结构物茎干中含有的CpG基序。MLL1 CXXC蛋白由生工生物工程公司合成。本实施例检测蛋白在DNA上的结合位置时，首先对DNA的长度按照碱基单位进行归一化处理。在测试力条件下，归一化处理以DNA发卡结构物完全解链后的长度为准。每条单分子数据线按照DNA解链后的长度进行自我校准，然后建立直方图。直方图分布中的中间峰，指示蛋白在DNA上的结合位置。参照直方图分布的中间峰，对DNA长度从纳米到碱基数进行转换。本实施例使用Marko-Sigga公式(公式1)计算在测试力上的DNA长度转换系数。
其中，
是单链DNA的持续长度；
是单链DNA的轮廓长度；kB是玻尔兹曼常数；T是温度。本实施例中，在NaCl浓度为100毫摩尔的条件下，
实施例4测量和评估DNA解链响应时间
基于实验数据线的采样频率，本发明仅测量响应时间长于奈奎斯特频率限制的单分子事件。以采样频率200赫兹为例，其奈奎斯特限制频率为100赫兹，所以测量的响应时间均长于10毫秒。因此，本实施例中滞留事件的定义是滞留时间长于10毫秒。此例就CpG DNA发卡结构物而言，蛋白结合特定CpG位点的定义是结合事件发生在待测CpG位点前后11个碱基范围之内。测量蛋白在特定CpG位点上的滞留时间，可以在适当的计算软件中采用步伐拟合算法，譬如Python或者Matlab。因为滞留时间的统计直方图呈现严重的拖尾分布特征，所以构建直方图时的面元尺寸大小可采用适用于拖尾分布的算法，譬如Freedman-Diaconis算法能够有效抑制离群值引起的拖尾效应。本实施例首先采用指数回归函数(公式2)对滞留时间分布进行数据拟合。
如果拟合优度不能令人满意，那么本实施例讲进一步采用二元或多元指数回归函数(公式3)进行数据拟合。
二元或多元指数回归函数是简单指数函数的线性组合，指示滞留时间分布源自多个速率不同的独立泊松过程。
实施例5运用四参数回归模型，估算二甲基富马酸酯干预蛋白核酸互作的半数抑制浓度
本实施例测试的小分子药物是二甲基富马酸酯，可特异性的与蛋白中的半胱氨酸共价反应。MLL1蛋白的CXXC结构域中含有多个半胱氨酸，是二甲基富马酸酯的修饰底物。获得小分子药物抑制蛋白核酸互作的剂量-响应关系曲线后，本发明基于四参数回归模型(公式4)进行数据拟合，计算小分子药物的半数抑制浓度IC50。
y＝(a-d)/(1+(x/c)^b)+d 公式4
其中x和y分别是药物浓度和测量得到的响应；a和d分别是响应的低和高平台值；b描述的是剂量-响应曲线中的线性部分的斜率；c是半数抑制浓度，亦即对应a和d之间响应中值的浓度。曲线拟合可以在任意数据处理软件中进行。拟合方法可选择通用方法，譬如最小二乘法。
以上对本发明的一个实施例进行了详细的说明，但所述内容仅为本发明较佳的实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法
<130> 008
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagatgattt gaaaaaatat gaagaatggt ataataaaag ggtgatttat atttatttat 60
tccggtattt aatttaatta tatccg 86
<210> 2
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatatataac cggatataat taaattaaat accggaataa ataaatataa atctgggagt 60
agatgtggtt tttgtttgtt tg 82
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccttttatt ataccattct tcatattttt tc 32
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actcatcatt caaacaaaca aaaaccacat ctactccc 38
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttatatatt tatatttatc cggtttattt attatttatt tccggttatt tataatttaa 60
ttac 64
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ataataaccg gtaattaaat tataaataac cggaaataaa taataaataa accggataaa 60
tata 64
<210> 7
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggttattat atattattta tccggtattt atttaattat attccggtta tttatatatt 60
tatatcc 67
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atataaataa ccggaatata attaaataaa taccggataa ataatat 47
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggttaatatt tattatattt ttttaaatat aataaatatt aaccggatat aaat 54
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaccgagata gggttgagtg 20
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcatcggctg aggaaaggga acaaaagctg g 31
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcgtagggt cctgaccgag atagggttga gtg 33
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaagggaaca aaagctgg 18
Claims (5)
1.一种测量小分子药物抑制蛋白核酸互作的单分子力学方法，其特征包含以下步骤：
1)单分子反应器基于DNA发卡结构物，其中发卡结构茎干部分内置CpG核酸基序；
2)微流控反应池为单分子反应器提供固定界面，而蛋白和小分子药物在微流控反应池内为自由游离状态；
3)磁镊收集蛋白核酸反应的单分子数据，并进行归一化处理；
4)DNA解链时间是单分子反应器的响应信号，蛋白结合延长DNA解链时间，蛋白是MLL1CXXC蛋白；
5)通过测量DNA解链时间，构建小分子药物干预蛋白核酸互作的剂量-响应曲线，评估药物效果。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)所述的单分子反应器是一种DNA发卡结构物；其把手含有生物素和地高辛修饰；DNA发卡的茎干核酸片段含有5个CpG基序位点，用于探测蛋白结合反应；5个CpG位点之间等距间隔；间隔为20个碱基对。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)所述的单分子反应器建立在微流控反应池内；玻璃、封口膜、进样孔、出样孔和封口膜通道共同组装成微流控反应池，规格为60毫米×24毫米；反应池底面铺敷硝酸纤维素和抗地高辛抗体，并固定参考小球；DNA发卡结构物的一端通过地高辛-抗地高辛互作，结合在反应池的表面；而另一端通过生物素-链霉亲和素互作固定于磁球；磁镊装置通过磁球对DNA发卡结构物进行力学操控。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4)所述的测量和评估DNA解链响应时间测量和评估DNA解链响应时间中，滞留事件的定义是滞留时间长于10毫秒；蛋白结合特定CpG位点的定义是结合事件发生在待测CpG位点前后11个碱基范围之内；蛋白是MLL1 CXXC；测量蛋白在特定CpG位点上的滞留时间，可以采用步伐拟合算法；采用指数回归函数对滞留时间分布进行数据拟合。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5)所述的运用四参数回归模型，估算小分子药物干预蛋白核酸互作的半数抑制浓度中，小分子药物是二甲基富马酸酯；获得小分子药物抑制蛋白核酸互作的剂量-响应关系曲线后，基于四参数回归模型进行数据拟合，评估药物效果；其中药物效果是指计算小分子药物的半数抑制浓度。
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