CN110396535A - 单分子技术检测cgi序列甲基化调控cxxc结构域位点特异性结合的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种应用于探测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法。通过构建CGI发夹结构，并将CGI发夹结构连接到反应池的底面和微球表面，在单分子操纵技术的操控下，微球受到拉力，进而在没有CXXC结构域存在的条件下CGI发夹结构被拉伸，CGI发夹结构被迅速打开；当在有CXXC结构域存在的情况下，CGI发夹结构的打开过程被结合在其上的CXXC结构域阻碍，产生停顿信号；对未修饰的CGI序列和甲基化修饰的CGI序列中停顿信号事件的发生次数进行计数，判断CXXC结构域对处于不同表观遗传修饰状态的CGI序列特异性位点结合的变化，从而揭示CGI的表观遗传修饰对基因转录活性的影响机制，为理解细胞的生命活动和细胞的癌变机制提供一种单分子水平的实验检测方法。

Description

单分子技术检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性 结合的方法

技术领域

本发明属于表观遗传修饰调控基因转录领域，尤其是涉及单分子技术检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法。

背景技术

在细胞的正常发育进程中，体细胞从干细胞继承得到相同的基因组序列。在干细胞分裂分化成体细胞的过程中，通过对不同基因的表达或抑制作用，产生具有不同功能的体细胞。在对基因进行选择性表达或抑制的过程中，表观遗传对DNA的修饰作用在其中起到了重要的作。其中，DNA甲基化是一种在真核细胞内主要的表观遗传修饰方式。在哺乳动物细胞DNA甲基化修饰中，DNA甲基化修饰大多发生在CpG双脱氧核糖核酸位点中。DNA甲基化修饰是一个动态的修饰过程，包括胞嘧啶第五位碳原子的甲基化作用和去甲基化作用。在DNA甲基转移酶DNMT的催化作用下，S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基团转移到CpG中的胞嘧啶(cytosine，C)上，C的第五位碳原子被加上一个甲基(-CH₃)基团，C被甲基化修饰成为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。在DNA去甲基化酶TET的催化作用下，5mC依次被氧化成5羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl cytosine，5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)，接着通过DNA损伤修复过程，5mC最终回复生成C，完成DNA甲基化修饰的动态循环过程。研究发现，在CpG位点丰度较高的DNA序列中，DNA甲基化修饰的动态变化能够引起染色质结构、DNA稳定性以及DNA与蛋白质间相互作用方式发生改变，进而调控靶标基因的表达。富含CpG位点的CpG岛(CpG island，CGI)，是散布在基因中CpG含量占比大于60％的DNA序列，其CpG的含量10倍高于基因组内的其它区域。CGI内含有约60％的人类编码蛋白基因的转录起始位点，CGI内CpG位点的甲基化动态修饰能够调控基因的转录活性、细胞的生长发育和细胞癌变的发生。

DNA甲基化修饰能够影响转录因子与染色质之间的相互作用。研究表明，CXXC结构域蛋白家族能够结合到基因CpG位点、CpGG、CpN(N代表A、T、C、G)或5mCpG位点，对染色质进行DNA甲基化或去甲基化、组蛋白甲基化或去甲基化等表观遗传修饰，进而调控相关基因的转录活性。X射线衍射实验和NMR实验结果显示，CXXC结构域能够像楔子一样插入到双螺旋CpG DNA大沟中，并且延伸到CpG DNA的小沟中，通过氢键作用、静电作用和疏水作用等分子间的相互作用力与CpG DNA发生相互作用。然而，目前对于表观遗传修饰动态调控CXXC结合CGI序列的有关机制尚未报道。

常用于探测蛋白与DNA分子间相互作用的传统生物学技术方法包括凝胶迁移实验、DNase1足迹实验、甲基化干扰实验、免疫共沉淀实验等。在本发明中所采用的技术为单分子力学探测技术，区别于传统生物学技术对分子相互作用事件的平均化研究，单分子力学操纵技术可以通过对单个分子施加外部机械力，对单个蛋白分子与DNA分子间的相互作用进行探测。近期，法国科学家申请的专利号为CN108588208A的发明专利——通过单分子操作来检测DNA修饰和蛋白的结合，描述了通过应用单分子操作来判断蛋白是否能够与特异性的DNA序列结合、判断蛋白在DNA上的结合序列，以及通过蛋白在DNA序列上的结合来鉴定DNA序列甲基化等的修饰，为探测蛋白与DNA分子间相互作用提供了一种新的思路。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种单分子技术检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法。在前人的工作基础上，通过构建含有基因启动子区CGI序列的发夹结构，应用单分子操纵技术检测CGI与CXXC结构域间的结合事件，为揭示甲基化修饰对CXXC结构域在CGI序列特异性位点结合的调控机制提供一种可能，为理解细胞的生命活动和细胞的癌变机制提供一种单分子水平的实验检测方法。

本发明采用的技术方案是：用于单分子操纵技术检测CXXC结构域与CGI序列结合的发夹结构，包括两个带有修饰的DNA把手，三叉形中间连接体，茎干部分的目标序列和T4末端环形结构，茎干部分的目标序列中含有CGI序列。

优选地，两个带有修饰的DNA把手分别为生物素修饰的DNA把手和地高辛修饰的DNA把手；

优选地，生物素修饰的DNA把手含有多位点的生物素分子，地高辛修饰的DNA把手含有多位点的地高辛分子；

优选地，生物素修饰的DNA把手或地高辛修饰的DNA把手长度为200-1200bp；

优选地，生物素修饰的DNA把手含有BbvCI内切酶识别位点，地高辛修饰的DNA把手含有PpuMI内切酶识别位点；

优选地，制备生物素修饰的DNA把手或地高辛修饰的DNA把手时使用带有生物素或地高辛标记的dUTP与不带生物素或地高辛修饰的dTTP间的比值为1:2-10。

优选地，三叉形中间连接体富含AT碱基序列，并且不包括CGI序列；

优选地，三叉形中间连接体退火形成的互补双链部分大于或等于12bp；优选地，大于或等于16bp；

优选地，三叉形中间连接体配对形成的茎干部分的粘性末端为PflMI内切酶消化产物的粘性末端。

优选地，T4末端环形结构的成环部分由4个核酸组成，优选地，由4个脱氧胸腺嘧啶核酸组成；

优选地，T4末端环形结构的长度为43nt；

优选地，T4末端环形结构退火后形成的双链互补配对区长度大于或等于12bp，优选地长度为12bp；

优选地，末端环形结构退火形成的粘性末端为PflMI内切酶消化产物的粘性末端。一种探测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法，构建含有CGI序列的发夹结构和甲基化CGI序列的发夹结构，比对其在CXXC结构域存在的条件下拉开过程中停顿信号产生的概率，判断CXXC结构域对处于不同表观遗传修饰下的CGI序列中的特异性位点结合的变化。

具体步骤为：

步骤一构建含有CGI序列的DNA发夹结构；

步骤二采用酶促反应对CGI发夹结构进行甲基化表观遗传修饰；

步骤三设计单分子操纵技术拉伸CGI发夹结构的重复拉伸恒力施力模式并实施；

步骤四通过计算CGI序列特异性位点上CXXC结构域结合事件发生的相对概率，确定CXXC结构域对CGI序列特异性位点结合。

优选地，步骤一中，通过DNA连接酶酶促反应，构建用于单分子操纵技术检测CXXC结构域与CGI结合的发夹结构，生物素修饰的DNA把手、地高辛修饰的DNA把手、三叉形中间连接体、茎干部分的目标CGI序列和T4末端环形结构连接时的摩尔比是3-10:3-10:1:3-10:10。

优选地，步骤二中的甲基化修饰是通过DNA甲基转移酶酶促反应构建用于单分子磁镊的甲基化CGI发夹结构；

优选地，DNA甲基化转移酶为CpG甲基转移酶M.SssI；

优选地，DNA甲基化转移酶与DNA的孵育温度为37℃，孵育时间为4h；

优选地，通过重亚硫酸盐测序验证发夹结构的甲基化处理完全。

优选地，步骤三中恒力施力模式的施力方案为：力8pN，维持35s；力25pN，维持10s；力30pN，维持5s；力25pN，维持5s；

优选地，恒力施力模式的重复次数为5-100次；

优选地，单分子操纵技术为单分子磁镊技术；

优选地，单次单分子实验所需非甲基化或甲基化CGI发夹结构用量为0.5ng。

优选地，单分子实验所使用的CXXC结构域为MLL1蛋白的CXXC结构域；

优选地，用于单分子磁镊实验的CXXC结构域浓度为1μM。

本发明具有的优点和积极效果是：应用单分子力学操纵技术，从单个分子间相互作用的角度，直接探测DNA甲基化修饰对于CXXC结构域结合CGI序列特异性位点的调控机制，揭示表观遗传修饰对基因转录活性的调控机制，为理解细胞的生命活动和细胞的癌变机制提供一种单分子水平的实验检测方法。

附图说明

图1 CGI发夹结构的构建过程示意图；①-④三叉形中间连接体，⑤T4末端环形结构，⑥生物素修饰的DNA把手，⑦地高辛修饰的DNA把手，⑧茎干部分的目标序列；

图2 CGI发夹结构琼脂糖凝胶电泳图；1 DNA分子量标准，2 CGI发夹结构；1 DNA分子量标准，2 CGI发夹结构；

图3单分子磁镊检测CXXC结合非甲基化/甲基化CGI发夹结构的实验设置；

图4无MLL1 CXXC条件下，CGI发夹结构的多次重复恒力拉伸信号；

图5 MLL1 CXXC存在条件下，CGI发夹结构的多次重复恒力拉伸信号；

图6 MLL1 CXXC存在条件下，甲基化CGI发夹结构的多次重复恒力拉伸信号；

图7单次恒力拉伸实验中，MLL1 CXXC结合到CGI发夹结构上的信号；

图8高斯拟合分析MLL1 CXXC结合到CGI发夹结构上的相对结合位置；

图9甲基化修饰降低MLL1 CXXC在CGI序列特异性位点的结合概率。

具体实施方式

在实施例中未对具体实验条件进行明确说明的实验方案，均按照相应产品说明书中的操作步骤进行操作。在实施例中用到的仪器、耗材和试剂，如未特别指出，均可从商业公司购买。本发明提供一种应用单分子技术探测DNA甲基化修饰调控CXXC结构域对CGI序列特异性位点结合的影响，为理解DNA表观遗传修饰调控基因转录机制提供一种新的技术路线。

构建CGI发夹结构，通过分子间亲和作用和抗原抗体相互作用，将CGI发夹结构连接到反应池的底面和微球表面，在单分子力学操纵技术的操控下，微球受到拉力，进而在没有CXXC结构域存在的条件下CGI发夹结构被拉伸，CGI发夹结构被打开；当在有CXXC结构域存在的情况下，CGI发夹结构的打开过程被结合在其上的CXXC结构域阻碍，产生停顿信号。接着，对未修饰的CGI序列和甲基化修饰的CGI序列中特异性位点停顿事件的发生次数进行计数，通过比较CXXC结构域与CGI序列特异性位点上的相对结合概率的大小，判断CXXC结构域对不同表观遗传修饰CGI序列特异性位点的变化。

其中用于单分子操纵技术检测CXXC结构域与CGI序列结合的CGI发夹结构，包括两个带有修饰的DNA把手，三叉形中间连接体，茎干部分的目标序列和T4末端环形结构；茎干部分的目标序列中含有CGI序列，可通过酶促反应对茎干部分的CGI序列进行甲基化修饰。

两个所述带有修饰的DNA把手分别为生物素修饰的DNA把手和地高辛修饰的DNA把手，生物素修饰的DNA把手或地高辛修饰的DNA把手长度限定为200-1200bp，生物素修饰的DNA把手含有多位点的生物素分子，能够与磁球连接，便于施力，地高辛修饰的DNA把手含有多位点的地高辛分子，通过地高辛抗体固定连接在池底；在制备多位点生物素标记或地高辛标记的DNA把手时，为了能够将带有生物素或地高辛修饰的dUTP有效地插入到DNA把手中，所使用的带有生物素或地高辛标记的dUTP与不带修饰的dTTP间的比值为1:2-10，优选为1:9，可以有效的构建多位点生物素标记或地高辛标记的DNA把手。三叉形中间连接体用于连接生物素修饰的DNA把手，地高辛修饰的DNA把手和茎干部分的CGI目标序列，三叉形中间连接体序列富含AT碱基序列，并且不包括CpG位点，避免了茎干部分以外的其它DNA序列对实验信号的采集产生影响，三叉形中间连接体退火形成的互补双链部分大于或等于12bp，优选为不小于16bp，这样的长度使得发夹结构比较稳定，并不影响拉伸效率。T4末端环形结构的成环部分由4个核酸组成，具体为4个脱氧胸腺嘧啶核酸组成，末端环形结构的长度为43nt；T4末端环形结构退火后形成的双链互补配对区长度大于或等于12bp，优选地长度为12bp，确保DNA发夹结构的稳定性。通过DNA连接酶酶促反应，将各部分DNA片段通过连接反应构建用于单分子磁镊测试的CGI发夹结构。

一种探测DNA甲基化修饰调控CXXC结构域对CGI序列特异性位点结合的方法，构建含有CGI序列的发夹结构，通过将CGI发夹结构在CXXC结构域存在的条件下拉开，拉开过程中由于CGI发夹结构结合了CXXC结构域，CGI的拉开过程中会产生停顿信号，比对甲基化修饰的CGI序列和未经修饰的CGI序列中停顿信号产生的概率，从而判断CXXC结构域对处于不同表观遗传修饰下的CGI序列中的特异性位点结合的变化。

具体步骤为：

步骤一通过DNA连接酶酶促反应，生物素修饰的DNA把手、地高辛修饰的DNA把手、三叉形中间连接体、茎干部分的CGI目标序列和T4末端环形结构连接，摩尔比是3-10:3-10:1:3-10:10，构建含有CGI序列的DNA发夹结构；

步骤二采用酶促反应对CGI发夹结构进行甲基化修饰，通过CpG甲基转移酶M.SssI酶促反应构建用于单分子磁镊的甲基化CGI发夹结构；

步骤三设计单分子磁镊力学操纵仪器拉伸CGI发夹结构的重复恒力施力模式，增加单分子力学操纵技术的探测效率，恒力施力模式的施力方案为：力8pN，维持35s；力25pN，维持10s(实验信号测试力)；力30pN，维持5s；力25pN，维持5s(参照力)；循环重复50次，扩大单分子力学操纵技术对于单分子相互作用事件的探测样本量，提高单分子力学操纵技术探测单分子相互作用事件的准确性；其中，单次单分子实验中所需非甲基化或甲基化DNA发夹结构的用量为0.5ng，使用的蛋白为MLL1 CXXC结构域，蛋白浓度为1μM；

步骤四利用单分子磁镊拉伸CGI发夹结构的恒力施力模式，依次探测在没有CXXC结构域存在的情况下，CGI发夹结构的拉伸信号；在CXXC结构域存在的情况下，CGI发夹结构的拉伸信号；在CXXC结构域存在的情况下，甲基化表观遗传修饰CGI发夹结构的拉伸信号；通过计算CGI特异性序列位点上CXXC结构域结合事件发生的相对概率，确定CXXC结构域对CGI序列特异性位点结合。

下面将根据具体实施例来对本发明做详细介绍。

实施例1

1制备含有CGI序列的茎干部分的目标序列

选取MLL1转录因子调控的下游靶基因Hoxa9启动子序列中的第一个CGI作为研究对象，制作用于构建CGI发夹结构的DNA序列。CGI序列(5′-3′方向)如SEQ ID NO:1所示：

SEQ ID NO:1

ACCTGGCGGTCCTCCGCTAGGCCACGCGTTTCCTGCTCGCCGGAGGGGGGGGGGGAACACTAGGTGGGGGAAGGGTCGCGGGAGCGCGCGCCTCAGCGGGCGGGCGCCTAGGAGGGAGAAGAGGGGGAGAGCGAGCGGCTGCGGGGAGTGAGTAGAAGAGGCCGCGGCCAGCCACAGGACCCGGCTC

将该CGI序列在基因合成公司合成并克隆到扩增载体pUC57中，设计引物，经过聚合酶链式反应(PCR)扩增CGI序列，并经过PflMI内切酶的酶切反应，获得带有黏性末端的可用于构建CGI发夹结构的CGI序列，如图1中⑧所示的DNA序列。引物序列(5′-3′方向)如下所示：

上游引物：ATATTTCCACCTACTGGACCTGGC

下游引物：ATATTTCCAGACAGTGGAGCCGG

2构建含有CGI序列的DNA发夹结构

如图1所示，CGI发夹结构包括五部分：生物素修饰的DNA把手⑥、地高辛修饰的DNA把手⑦、三叉形中间连接体、茎干部分的目标序列⑧和T4末端环形结构⑤。其中三叉形中间连接体由四条单链①-④DNA序列经退火后生成。选取用于构建DNA发夹结构中除茎干部分以外的其它部分的DNA序列，由于MLL1 CXXC结构域主要结合到DNA序列中的CpG位点，因此对于DNA发夹结构茎干部分以外其它序列(包括图1中①-⑦的序列)的选取要避免出现CpG位点，其中，图1中①-⑤中的序列均不含有CpG位点。

2.1 CGI发夹结构五部分序列的准备

序列①来自疟原虫DBL2基因组中富含AT序列的DNA片段，序列(5′-3′方向)如SEQID NO:2所示，序列②为序列①的互补链，序列(5′-3′方向)如SEQ ID NO:3所示；序列③来自λ噬菌体基因组中的富含AT的序列，序列(5′-3′方向)如SEQ ID NO:4所示，序列④为序列③的互补链，序列(5′-3′方向)如SEQ ID NO:5所示。上述序列①-④均通过PCR技术等生物技术人工合成的基因片段。

SEQ ID NO:2

TCAGCAAGGAAGGAGATTTTGAAAAATTTATTTATTAGATATTGGAAATATTATTAGAGGAGATGATTTAAAAAAATATGAAGAATGGTATAATAAAAGGGTTTGGTTATTAGAGGACACCTA

SEQ ID NO:3

CCCTTTTATTATACCATTCTTCATATTTTTTTAAATCATCTCCTCTAATAATATTTCCAATATCTAATAAATAAATTTTTCAAAATCTCCTTCCTTGC

SEQ ID NO:4

GTGTCCTCTAATAACCTTTGGGAGTAGATGTGGTTTTTGTTTTTTTGAATAATAAATGTTAAAAAAAGTGGGGAAGTGAGTAATGAAATTATTTTGTATGTTTTTTATATGAATTTATTTTTTGGG

SEQ ID NO:5

ACCCCAAAAAATAAATTCATATAAAAAACATACAAAATAATTTCATTACTCACTTCCCCACTTTTTTTAACATTTATTATTCAAAAAAACAAAAACCACATCTACTCCC

取上述序列①-④经逐步降温反应，退火形成三叉形中间连接体，三叉形中间连接体配对形成的茎干部分的长度为16bp，三叉形中间连接体配对形成的茎干部分的粘性末端为PflMI内切酶消化产物的粘性末端，用于连接含有PflMI内切酶粘性末端的茎干部分的CGI目标序列。T4末端环形结构序列⑤来自疟原虫DBL2基因组中富含AT序列的DNA片段，序列(5′-3′方向)如SEQ ID NO:6所示，T4末端环形结构包含4个胸腺嘧啶，长度为43nt，将4个胸腺嘧啶拼接到获得的疟原虫DBL2基因组中富含AT序列的DNA片段中形成序列⑤，T4末端环形结构退火形成的粘性末端为PflMI内切酶消化产物的粘性末端，同样用于连接含有PflMI内切酶粘性末端的茎干部分的目标序列。

SEQ ID NO:6

GTGAAGAGATTTGTAAAGTTTTCTTTACAAATCTCTTCACACA

序列⑥和序列⑦来自以pBluescript II SK(+)质粒为模板和以带有生物素/地高辛修饰的dUTP为底物进行PCR扩增，PCR扩增产物再分别经过内切酶BbvCI和PpuMI的酶切反应获得；生物素修饰的DNA把手和地高辛修饰的DNA把手长度均为666.5bp。由于序列⑥和⑦带有多位点的生物素或地高辛修饰，这两个DNA片段将会分别被固定到磁球表面和反应池底面，在对磁球进行拉伸信号分析时，结合到其上的蛋白分子将不会对拉伸信号进行影响，因此，序列⑥和⑦上是否有CpG位点，均不会对实验信号的解读造成影响。序列⑥所用的引物序列(5′-3′方向)如下所示：

上游引物：GACCGAGATAGGGTTGAGTG

下游引物：GCATCGGCTGAGGAAAGGGAACAAAAGCTGG

序列⑦所用的引物序列(5′-3′方向)如下所示：

上游引物：ATCGTAGGGTCCTGACCGAGATAGGGTTGAGTG

下游引物：AAAGGGAACAAAAGCTGG

2.2 CGI发夹结构五部分序列的连接

通过DNA连接酶酶促反应，构建用于单分子磁镊测试的CGI发夹结构。将生物素修饰的DNA把手⑥、地高辛修饰的DNA把手⑦、三叉形中间连接体、茎干部分的CGI目标序列⑧和T4末端环形结构⑤，按5:5:1:3:10的摩尔比混匀，加入T4DNA连接酶(货号：M0202S，NEB公司)和连接酶缓冲液，在25℃条件下孵育1h，20℃条件下孵育3h。用TAE缓冲液配制1％的琼脂糖凝胶，将孵育后的产物载入琼脂糖凝胶加样孔中，100V恒压电泳30min后，切胶回收连接产物的目的条带，如图2中右侧三角符号所指示的位置，即获得含有CGI序列的DNA发夹结构，图2中其余条带为连接反应中的副产物，在本实施例中称为CGI发夹结构，可置于-20℃，待用。

3对CGI发夹结构的甲基化表观遗传修饰

应用甲基化转移酶对CGI发夹结构进行甲基化表观遗传修饰。将制备好的CGI发夹结构，用CpG甲基转移酶(货号：M0226S，NEB公司)将底物S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)上的甲基基团(-CH3)转移到CpG位点中的胞嘧啶上，生成含有5mCpG位点的CGI发夹结构。CpG甲基化转移酶与DNA的反应温度为37℃，孵育时间为4h。反应完成后，使用DNA纯化试剂盒(货号：D6492-02，Omega公司)对甲基化产物进行回收纯化。然后，用TAE缓冲溶液配制1％的琼脂糖凝胶，将回收纯化后的连接产物载入琼脂糖凝胶加样孔中，100V恒压电泳30min，使用胶回收试剂盒(货号：D2500-02，Omega公司)回收目标产物。其中，为了确保所有的CpG位点都变成5mCpG位点，以确保甲基化CGI发夹结构成份的单一性，排除在甲基化CGI发夹结构中个别CpG位点对于信号检测的影响，用重亚硫酸盐处理的方法对发夹结构的甲基化结果测序，检测CGI序列中CpG位点中的C是否全部被甲基化为5mCpG；将甲基化后的CGI发夹结构置于-20℃，待用。

4单分子磁镊拉伸非甲基化CGI发夹结构和甲基化CGI发夹结构

设计单分子磁镊拉伸CGI发夹结构的恒力施力模式。本实施例中使用的恒力施力模式共由四部分组成；

A：力8pN，维持35s。该力是低力，用F_low表示，在F_low作用下可以维持CGI发夹结构的茎干部分不受外力作用，有利于蛋白与DNA序列的结合；

B：力25pN，维持10s。该力是检测信号的力，用F_test表示，在F_test作用下检测蛋白与DNA序列的结合。在F_test下，如果蛋白未结合到DNA序列上，则DNA发夹结构会在瞬间被完全打开，中间没有停顿信号，如图4所示；如果蛋白结合在DNA序列上，则会导致DNA发夹结构的打开受阻，出现停顿信号，如图5和图6所示；

C：力30pN，维持5s。该力是高力阶段，用F_high表示，在F_high作用下，会破坏绝大部分结合到DNA序列上的蛋白，使蛋白从DNA分子上解离，恢复DNA分子处于未被蛋白结合的状态；

D：力25pN，维持5s。该力是参照力，用F_reference表示，该力是一个参照力。由于参照力F_reference和信号检测力F_test大小一致，在不同的力下，DNA分子结合到磁球上的偏心效应将不会对分子拉伸长度的计算造成影响，所以F_reference可用于计算在F_test下蛋白结合到DNA上的相对位置。

按照从A到D的施力顺序，重复不少于50次，这样的重复拉伸操作可以在一次实验中收集多次蛋白与DNA间的结合事件，扩大了实验的数据样本，增加了实验信号的可信度。

5计算CGI序列位点上CXXC结构域结合事件发生的相对概率

利用单分子磁镊拉伸CGI发夹结构的恒力施力模式，依次探测在没有CXXC结构域存在的情况下，CGI发夹结构的拉伸信号；在CXXC结构域存在的情况下，CGI发夹结构的拉伸信号；在CXXC结构域存在的情况下，甲基化表观遗传修饰CGI发夹结构的拉伸信号。在本实施例中所使用的MLL1 CXXC结构域的浓度为1μM，CGI发夹结构的质量为0.5ng。

没有MLL1 CXXC结构域存在的情况下，CGI发夹结构的拉伸信号结果如图4所示，图中显示的是在无MLL1 CXXC存在的条件下，CGI发夹结构在单分子磁镊恒力施力模式下的10次重复拉伸信号，上方图中是单分子磁镊在恒力施力模式中的施加在磁球上的拉力大小的变化，下方图中是CGI发夹结构在相对应的恒力施力模式中的分子拉伸长度变化，图中显示由F_low到F_test的过程中，CGI发夹结构的拉伸长度会迅速变长，出现一个跳跃式的变化，表明CGI发夹结构被迅速打开，而在F_test作用下，CGI发夹结构的拉伸长度在一个恒定值的上下波动，CGI发夹结构的拉伸长度并不随时间的延长而增加，说明CGI发夹结构被完全打开，接着当力到达F_high时，处于完全打开的CGI发夹结构被进一步拉伸，CGI发夹结构的拉伸长度会比在F_test作用下的长度稍有增加，表明在增加力的作用下，CGI分子中的键长变长，当力由F_high回降到F_test时，CGI发夹结构的拉伸长度稍有降低，直至力由F_test回降到F_low时，CGI发夹结构拉伸长度迅速变短，说明CGI发夹结构由完全打开状态再次回复到了闭合状态。在MLL1 CXXC结构域存在的情况下，CGI发夹结构的拉伸信号，如图5所示，图中显示的是在MLL1 CXXC结构域存在的条件下，CGI发夹结构在单分子磁镊恒力施力模式下的10次重复拉伸信号，上方图中是单分子磁镊在恒力施力模式中的施加在磁球上的拉力大小的变化，下方图中是CGI发夹结构在相对应的恒力施力模式中的分子拉伸长度变化，其中处于F_test作用力下出现的停顿信号为MLL1 CXXC结构域在CGI发夹结构上的结合信号，停顿信号出现的位置不同，说明MLL1 CXXC结构域可以结合到CGI发夹结构茎干部分不同的序列位置；如图6所示，是在MLL1 CXXC结构域存在的条件下，甲基化CGI发夹结构在单分子磁镊恒力施力模式下的10次重复拉伸信号。

对产生的多次重复拉伸信号利用Matlab软件进行分割，将多次重复拉伸信号分割成单次的拉伸信号，如图7所示。将单次拉伸信号作柱形图统计分析，用高斯拟合计算在F_reference下CGI发夹结构拉伸长度的平均值，并用所有作用力(包括F_low，F_test，F_high和F_reference)下的分子拉伸长度减去该平均值，获得在F_test作用力下，MLL1 CXXC结构域结合到DNA分子特异性序列的相对位置。对图7中的CGI发夹结构分子的拉伸信号做柱状图分析，如图8所示，对CGI发夹结构分子的拉伸长度做统计分析，并对处于F_reference作用下的拉伸长度做高斯拟合分析，获得CGI发夹分子在F_reference作用下的拉伸长度，接着用分子处于不同拉伸力下的拉伸长度减去该F_reference作用下的分子拉伸长度，获得分子相对于F_reference作用力下的相对拉伸长度。随后，对有停顿信号出现的位置作高斯拟合分析，高斯拟合中的峰值代表停顿信号出现在CGI发夹分子中的相对位置，即可获得MLL1 CXXC结构域结合到CGI发夹分子上的位置。

根据获得的MLL1 CXXC结构域结合到CGI序列特异性位点上的相对位置，分别对MLL1 CXXC结构域结合到非甲基化CGI(图5)或甲基化CGI(图6)上的相对位置做统计，如图9所示。根据图8中获得MLL1 CXXC结构域结合到CGI发夹分子上位置的方法，对整个实验过程中的所有停顿信号进行分析，可获得MLL1 CXXC结构域结合到CGI发夹分子上的不同位置。接着，对结合到CGI发夹结构分子上相同位置的发生次数进行统计，获得MLL1 CXXC结构域结合到CGI发夹结构上特异位点上的次数，再用MLL1 CXXC结构域结合到CGI发夹结构某一位点的次数除以总的结合次数，获得图中所示的MLL1 CXXC结构域结合到CGI发夹结构上特异性位点的结合事件发生概率。图中灰色线条代表MLL1 CXXC结构域结合到非甲基化CGI序列特异性位点的发生概率统计，黑色线条代表MLL1 CXXC结构域结合到甲基化CGI序列特异性位点的发生概率统计，数据由平均值加标准差的形式表示。图中的DNA序列为CGI发夹结构茎干部分的CGI序列信息，其中标黑的序列为CpG位点，浅灰色矩形框中的DNA序列为在CGI序列中CpG位点或C+G含量丰富的区域，实验结果显示，MLL1 CXXC结构域更倾向于结合到这些CGI序列中CpG或C+G含量丰富的区域内，与CGI序列上其它区域相比MLL1 CXXC结构域呈现出较高的结合概率，说明MLL1 CXXC更偏向于结合到CpG或C+G含量丰富的CGI序列位点上，而当对CGI序列中的CpG位点进行甲基化修饰后，MLL1 CXXC结构域在CGI序列中CpG或C+G含量丰富区域的结合概率明显降低，表现出甲基化修饰对MLL1 CXXC结合CGI序列呈负向调控作用。

结果显示，甲基化修饰的CGI序列明显降低了MLL1 CXXC结构域结合到CGI序列上的发生概率，表明MLL1 CXXC结构域对甲基化修饰的CGI序列特异性位点的结合降低，揭示甲基化修饰CGI能够通过降低CXXC结构域结合到CGI特异性位点上的概率来调控靶基因的转录。

综上，本发明通过提供一种用于单分子操纵技术检测的DNA发夹结构的构建方法、单分子操纵技术的力学恒力施力模式和单分子结合概率的计算方法，从单个分子的角度出发，探讨表观遗传修饰调控蛋白对DNA序列特异性位点的结合，为理解表观遗传修饰调控基因转录的分子机制提供一种新的思路和方法。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.用于单分子操纵技术检测CXXC结构域与CGI序列结合的发夹结构，其特征在于：包括两个带有修饰的DNA把手，三叉形中间连接体，茎干部分的目标序列和T4末端环形结构，茎干部分的目标序列中含有CGI序列。

2.根据权利要求1所述的用于单分子操纵技术检测CXXC结构域与CGI序列结合的CGI发夹结构，其特征在于：两个所述带有修饰的DNA把手分别为生物素修饰的DNA把手和地高辛修饰的DNA把手；

优选地，生物素修饰的DNA把手含有多位点的生物素分子，地高辛修饰的DNA把手含有多位点的地高辛分子；

优选地，生物素修饰的DNA把手或地高辛修饰的DNA把手长度为200-1200bp；优选地，生物素修饰的DNA把手含有BbvCI内切酶识别位点，地高辛修饰的DNA把手含有PpuMI内切酶识别位点；

优选地，制备生物素修饰的DNA把手或地高辛修饰的DNA把手时使用带有生物素或地高辛标记的dUTP与不带生物素或地高辛修饰的dTTP间的比值为1:2-10。

3.根据权利要求1或2所述的用于单分子操纵技术检测CXXC结构域与CGI序列结合的CGI发夹结构，其特征在于：所述三叉形中间连接体富含AT碱基序列，并且不包括CGI序列；

优选地，三叉形中间连接体退火形成的互补双链部分大于或等于12bp；优选地，大于或等于16bp；

优选地，三叉形中间连接体配对形成的茎干部分的粘性末端为PflMI内切酶消化产物的粘性末端。

4.根据权利要求1-3中任一所述的用于单分子操纵技术检测CXXC结构域与CGI序列结合的CGI发夹结构，其特征在于：T4末端环形结构的成环部分由4个核酸组成，优选地，由4个脱氧胸腺嘧啶核酸组成；

优选地，T4末端环形结构的长度为43nt；

优选地，T4末端环形结构退火后形成的双链互补配对区长度大于或等于12bp，优选地长度为12bp；

优选地，末端环形结构退火形成的粘性末端为PflMI内切酶消化产物的粘性末端。

5.单分子技术检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法，其特征在于：构建含有CGI序列的发夹结构和甲基化CGI序列的发夹结构，比对其在CXXC结构域存在的条件下拉开过程中停顿信号产生的概率，判断CXXC结构域对处于不同表观遗传修饰下的CGI序列中的特异性位点结合的变化。

6.根据权利要求5所述的单分子技术检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法，其特征在于：具体步骤为：

步骤一构建含有CGI序列的DNA发夹结构；

步骤二采用酶促反应对CGI发夹结构进行甲基化表观遗传修饰；

步骤三设计单分子操纵技术拉伸CGI发夹结构的重复拉伸恒力施力模式并实施；

步骤四通过计算CGI序列特异性位点上CXXC结构域结合事件发生的相对概率，确定CXXC结构域对CGI序列特异性位点结合。

7.根据权利要求6所述的单分子技术检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法，其特征在于：所述步骤一中，通过DNA连接酶酶促反应，构建用于单分子操纵技术检测CXXC结构域与CGI结合的发夹结构，生物素修饰的DNA把手、地高辛修饰的DNA把手、三叉形中间连接体、茎干部分的目标CGI序列和T4末端环形结构连接时的摩尔比是3-10:3-10:1:3-10:10。

8.根据权利要求6所述的单分子技术检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法，其特征在于：所述步骤二中的甲基化修饰是通过DNA甲基转移酶酶促反应构建用于单分子磁镊的甲基化CGI发夹结构；

优选地，DNA甲基化转移酶为CpG甲基转移酶M.SssI；

优选地，DNA甲基化转移酶与DNA的孵育温度为37℃，孵育时间为4h；

优选地，通过重亚硫酸盐测序验证发夹结构的甲基化处理完全。

9.根据权利要求6所述的单分子技术检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法，其特征在于：所述步骤三中恒力施力模式的施力方案为：力8pN，维持35s；力25pN，维持10s；力30pN，维持5s；力25pN，维持5s；

优选地，恒力施力模式的重复次数为5-100次；

优选地，单分子操纵技术为单分子磁镊技术；

优选地，单次单分子实验所需非甲基化或甲基化CGI发夹结构用量为0.5ng。

10.根据权利要求5-9中任一所述的单分子技术检测CGI序列甲基化调控CXXC结构域位点特异性结合的方法，其特征在于：单分子实验所使用的CXXC结构域为MLL1蛋白的CXXC结构域；

优选地，用于单分子磁镊实验的CXXC结构域浓度为1μM。