CN108588208B - 通过单分子操作来检测dna修饰和蛋白结合的方法 - Google Patents

通过单分子操作来检测dna修饰和蛋白结合的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过单分子操作来检测DNA修饰和蛋白结合的方法。具体地，本发明涉及用于确定蛋白是否结合特异性DNA序列的方法。这种方法特别用于通过特异性识别这些修饰的蛋白(例如，抗体)的结合来鉴定DNA序列的修饰(如甲基化)，也用于鉴定各种蛋白在DNA上的结合序列。

Description

通过单分子操作来检测DNA修饰和蛋白结合的方法
本申请是申请号为201480017389.9，申请日为2014年01月22日，发明名称为“通过单分子操作来检测DNA修饰和蛋白结合的方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于确定蛋白是否结合特异性DNA序列的方法。这种方法特别用于通过特异性识别这些修饰的蛋白(例如，抗体)的结合来鉴定DNA序列的修饰(例如，甲基化)，也用于鉴定各种蛋白在DNA上的结合序列。
背景技术
蛋白与DNA的结合是在生物学中的重要现象；它在调节细胞和病毒功能中具有基本作用。这些包括基本细胞过程，如DNA复制、转录、DNA修复和DNA重组、还有DNA修饰或染色体结构的维护。
有几种蛋白结合到基因组中特定位点来调节基因组的表达和维持。DNA-结合蛋白组成具有多样化和重要生物学功能的蛋白大家族。DNA-结合蛋白家族是细菌、古生菌和真核生物的各种基因组中最受关注和研究最多的之一。大多数这些蛋白(如真核和原核转录因子)含有独立的折叠单元(结构域)以实现其与DNA轮廓的识别。它们包括重要的基因调节蛋白(称为转录因子及DNA加工蛋白)，如例如DNA和RNA聚合酶、DNA连接酶、DNA解旋酶、DNA内切酶和外切酶、以及DNA修复和重组蛋白。
已证明鉴定这些蛋白结合位点是艰巨的任务。例如，在人类基因组中，有多于700个预测的C2H2锌指转录因子(Tadepally等人,BMC Evol.Biol.,8:176,2008)，但这些中只有约10％具有已知结合基序(Matys等人,Nucleic Acids Res.,34:D108-D110,2006)。此外，虽然蛋白结合DNA的热力学平衡性质是公知的，然而测定其结合和解结合的动力学是更具挑战性的问题。
使用各种方法，如凝胶移位分析、足迹、和转录激活来研究DNA-蛋白相互作用(Carey等人,Cold Spring Harb Protoc,2012(7):733-57,2012)。虽然每种这些方法可提供关于结合的位置或影响的不同信息，它们却不能提供定量测量特异性结合的简单方法。荧光偏振/各向异性提供了快速、非放射性方法以直接在溶液中不使用过滤器结合、电泳、或沉淀步骤就能精确测量DNA-蛋白结合(Guest等人,1991；Heyduk和Lee,1990；LeTilly和Royer,1993；Lundblad等人,1996；Royer等人,1992)。
基因组信息指导不同生物分子合成的分子机制一直是过去三十年很多分子生物学研究的重点。以前的研究通常集中在单个基因，使用所得到的一般原理然后为以下提供见解：转录、染色质重塑、信使RNA剪接、DNA复制和许多其它基因组加工。尽管在研究其它基因时很多这样原理似乎有效，然而这些原理通常没有提供关于基因组范围对生物功能的见解。另一方面，转录和调节信息的系统分析对鉴定基因和调节区是必需的，并且是人类生物学和疾病研究中的重要的资源。这种分析还可以提供对细胞环境、物种和个体中组织和基因变异性(variability)以及调节信息的综合观点。
全基因组的努力，例如编码项目(Encode project)(DNA元件的百科全书(Encyclopedia of DNA Elements))，来鉴定例如在人类基因组中的所有转录因子结合位点，这已被证明很麻烦并且是非常劳动密集型的(The ENCODE Project Consortium,Nature,489:57-74,2012)。
因此，仍然需要检测蛋白/核酸相互作用的简单而可靠的方法。
发明内容
本发明涉及通过物理操作用于确定蛋白与核酸分子结合的方法。
根据本发明的基于物理技术和电子处理的方法，不同于目前化学或生物化学的方法。其比现有技术提供很多优点：
1)其是高度灵敏的，因为它是基于检测单蛋白或蛋白复合物分子与单核酸分子。使用单分子不仅能够提供测量蛋白寻找其核酸靶所需时间以及蛋白停留在其靶上时间，还能够精确定位结合事件。
2)不使用昂贵的(具有荧光团或一些其它基团)标记的核苷酸。
3)通过测量双链核酸分子两端之间的距离，使得它能够确定蛋白结合位点沿着所述双链核酸上的精确定位(以bp计)。
4)可在第二时标(time-scale)中周期性重复测量，从而导致消除假阳性、改进统计并显著降低仪器漂移(drift)。
5)实验可以在同一分子上重复多次，从而改进统计和测量的可靠性。
6)它能够检测任何核酸结合蛋白。因此，可鉴定特异性识别核酸的结构修饰的蛋白，从而检测结构修饰的位点。
本发明涉及基于蛋白在测序的核酸分子上的结合位点的物理定位来检测蛋白与核酸序列的结合的方法。
在本发明的上下文中，“结合”是指大分子之间(例如，蛋白和核酸之间)的非共价相互作用。这样相互作用一般以10-6M-1或更低的解离常数(Kd)来表征。“亲和性”是指结合的强度：增加结合亲和性与更低的Kd相关。
“检测蛋白与核酸分子的结合”本文指，导致直接或间接获得关于存在或不存在所述蛋白和所述核酸分子之间相互作用的某些信息的所有活动。检测所述结合可涉及或可不涉及确定其它信息，如例如结合反应的动力学参数或蛋白结合位点的序列。本领域技术人员将明白，本发明的方法允许容易地进行这样的确定。
本发明基于这样的观察，即变性双链核酸的两条链在适当的条件下将重新杂交。如果在复性步骤期间分子结合所述变性双链核酸分子的任意链，重新杂交仅仅是部分的。本发明人现在已发现，在特定条件下重新杂交中的这种永久或短暂的暂停可用于检测蛋白与所述变性双链核酸分子之间的相互作用。根据本发明，有可能检测双链核酸分子重新杂交的阻断；与这种阻断相关的物理参数(如，阻断持续时间，阻断在双链核酸分子上的位置)然后允许检测蛋白与核酸序列之间的相互作用。
因此，本发明涉及用于确定蛋白与核酸分子结合的方法，所述方法包括检测变性的双链核酸分子的复性阻断的步骤。
“变性”在此处表示双链之间的大部分氢键断裂时发生的所述双链核酸分子的两条链分离的过程。变性过程产生变性的核酸分子，其在此处表示双链核酸分子变性所产生的两条分离的互补链。“复性”在此处指这样的过程，通过这种过程两条分离的互补链通过杂交重新形成双螺旋。如此处所用，“杂交”是核酸的两条或更多互补链之间建立非共价的、序列特异性的相互作用从而形成单个杂交体的过程。
本领域技术人员已知用来变性核酸的几种可能。在最优选的方式中，通过向两条链施加物理力将它们分开。根据本发明的“物理力”是导致物体经历某种改变，或者关于其运动、方向或几何构造的任何影响。本领域技术人员将清楚根据本发明的力与其它物理参数，如温度(这是直接的物质属性而不是施加于其上的影响)不同。根据本发明的物理力包括这样的力，如摩擦力、拉力、法向力(normal force)、空气阻力、作用力、和弹力。最优选地，根据本发明的物理力是拉力。根据本实施方式，所述双链核酸的游离端可被拉开，因此使配对碱基之间的所有键断裂，从而打开双链核酸。
本发明适用于任何类型的双链核酸。大多数情况下，双链核酸将是DNA，但应当理解，本发明也适用于完全配对的或者不完全配对的单链DNA-单链DNA双链体，或适用于完全配对的或者不完全配对的单链DNA-单链RNA双链体，或适用于完全配对的或者不完全配对的单链RNA-单链RNA双链体。此外，双链体可由获自不同来源的样本的两条单链的至少部分重新配对组成。最后，本发明也适用于唯一单链DNA或唯一单链RNA的二级结构。
因此，本发明的方法涉及用于检测蛋白与核酸分子结合的方法，所述方法包括以下步骤：
·通过向双链核酸分子施加物理力使所述分子变性；以及
·检测双链核酸复性的阻断。
有利地，所述方法包括确定阻断位置的另一步骤。
在这种类型用于分析蛋白与DNA分子结合的方法中，为了促进重新配对，有利的是在被拉开之前安排双链DNA分子的游离端(即没有附着至支持物的端)共价或准共价连接至另一端。在优选的实施方式中，双链核酸分子是发夹。如果想要双链核酸示意性表示在本发明的上下文中，可以将其比作“拉链”(zip fastener)，其被打开(或关闭)：双链核酸的变性就是拉开拉链，复性是重新拉上拉链。
本发明人已经观察到，在一定条件下，当分子结合变性双链核酸分子时，所述双链核酸分子的复性被阻断。结合的分子可以是对所述变性双链核酸分子上的特异性序列具有亲和性的任何类型的分子，如核酸、蛋白质或小分子。
在本发明的第一方面，蛋白用于阻断所述双链核酸的复性。
如本文所用的术语“蛋白”、“蛋白质”和“多肽”是同义词并且是指通过肽键共价连接成链的氨基酸聚合物。在一个氨基酸的羧基基团的和下一个氨基酸的氨基基团之间形成肽键。术语还适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸是相应的天然存在氨基酸的化学类似物或修饰的衍生物。术语“氨基酸”指所有处于其D和L立体异构体形式的天然存在的α氨基酸，以及其类似物和衍生物。类似物被定义为在氨基酸中的原子被通常具有类似性质的不同原子所取代。衍生物被定义为具有附着至其上的其它分子或原子的氨基酸。衍生物包括，例如，氨基的乙酰化、羧基的氨基化、或两个半胱氨酸分子的硫残基氧化以形成胱氨酸。
蛋白可以具有多种功能。“结合蛋白”是能够非共价结合到另一个分子的蛋白。结合蛋白可以结合，例如，DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白-结合蛋白)。在蛋白结合蛋白的情况下，其可以自己结合(以形成多聚体)和/或其可以结合到不同的蛋白或蛋白的一种或更多种分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。因此，根据本发明的“核酸结合蛋白”是能够与核酸相互作用的蛋白。因而，根据本发明的“单链核酸结合蛋白”是能够与单链核酸相互作用的蛋白，而根据本发明的“双链核酸结合蛋白”因此是能够与双链核酸相互作用的蛋白。
根据本实施方式，本发明的方法因此涉及用于确定蛋白结合含有核酸序列的核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过向含有所述序列的双链核酸分子施加物理力，使所述分子变性；
b)提供所述蛋白；
c)在所述蛋白存在时，使所述双链核酸分子复性；以及
d)检测双链核酸分子复性的阻断。
有利地，所述方法包括确定阻断位置的另一步骤。
在本领域中公知，基于核酸结合蛋白能否结合单链核酸(ssDNA和ssRNA)或者核酸结合蛋白能否结合双链核酸(dsDNA、dsRNA、DNA/RNA杂交体等)，区分核酸结合蛋白。
在本发明方法的第一实施方式中，用来阻断变性的双链核酸复性的蛋白是能够结合单链核酸的蛋白。
对单链核酸具有亲和性的核酸结合蛋白将能与变性双链分子本身相互作用，从而导致阻断双链核酸的复性。技术人员将意识到，即使蛋白不结合到特异性的序列，本发明也能够容易和精确地确定结合反应动力学的参数。事实上，单链核酸结合蛋白通常对特异性序列最不具有亲和性，而是通常对核酸具有亲和性。例如，已知解旋酶结合ssDNA缺口(gap)以解旋dsDNA。细菌单链DNA结合蛋白、或SSB结合到DNA的单链区以阻止提前退火，防止单链DNA被核酸酶消化以及从DNA中去除二级结构。Rad52蛋白，是一种对DNA双链断裂修复和同源重组重要的蛋白，其结合单链DNA末端，并介导互补DNA链退火所必须的DNA-DNA相互作用。
这些单链核酸结合蛋白具有对核酸的广泛亲和性，这意味着在本发明上下文中，无论核酸序列如何，所述蛋白都能够结合所述单链核酸。这种非序列特异性核酸结合蛋白以低于100倍、通常低于10倍变化的解离常数结合多个不相关DNA序列的不同序列。
在另一方面，一些核酸结合蛋白对含有特异性序列的核酸分子具有亲和性，即其仅识别和结合含有所述序列的核酸。并不是结合相互作用的所有组份都需要是序列特异性的(例如，与DNA骨架上的磷酸残基接触)，只要这种相互作用作为整体是序列特异性的。事实上，虽然大量单链核酸结合蛋白仅具有广泛的核酸亲和性，这些蛋白中的一些能够在特异性序列上结合单链核酸。因此，序列特异性核酸结合蛋白，以比不相关的序列高至少100倍的亲和性，结合特异性序列或特异性序列的家族，其中特异性序列的家族彼此显示高度序列同一性(例如，至少约80％的序列同一性)。序列特异性核酸结合蛋白与其特异性序列的解离常数通常低于约100nM，以及可以低至10nM、1nM、1pM或1fM。
许多核酸结合蛋白不能结合单链核酸。这些对双链核酸具有亲和性的蛋白将不能与变性的双链分子本身相互作用。这些蛋白将最不可能在这些条件下触发对双链核酸复性的阻断。
大多数这些蛋白识别和结合特异性双链核酸序列。例如，双链DNA结合蛋白在调节新蛋白表达上起到重要作用。取决于蛋白所结合的DNA序列的性质和位置，这些蛋白通过各种结构基序与DNA相互作用，以及可以刺激或抑制信使RNA的转录。
在这种情况下，在所述双链分子变性之后，有利的是提供具有所述双链核酸结合蛋白的单链核酸分子。事实上在技术领域公知，所述单链核酸可与变性双链核酸中的一条链上的互补序列杂交，因此形成可被蛋白结合的双链核酸杂交体。只要单链核酸长到足以阻断复性过程，所述单链核酸可以是任意长度。优选地，单链核酸的长度包括3至50个核苷酸之间，更优选地，3至45个核苷酸之间、3至40个核苷酸之间、3至35个核苷酸之间、3至30个核苷酸之间、3至25个核苷酸之间、3至20个核苷酸之间、3至15个核苷酸之间，以及甚至更优选3至12个之间。本发明的单链核酸尤其可以是DNA或RNA分子，天然的或修饰的。所述单链核酸也可以由修饰的核苷酸构成，如锁核酸(LNA)，其是其中核糖部分修饰有连接2'氧和4'碳的额外桥的核苷酸，或者肽核酸(PNA)，其中主链由通过肽键连接的重复的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元组成。
因此，当单链核酸分子在复性之前添加至变性双链核酸时，重新杂交的阻断表明单链核酸分子的序列与双链核酸分子的至少部分序列是互补的。
发明人已证明，当双链核酸结合蛋白存在时，其能够结合变性双链核酸与单链核酸分子之间所形成的杂交体。蛋白和核酸杂交体之间的这种相互作用导致阻断持续时间的改变。大多数时候，这种相互作用导致复性阻断的增加。例如，引发酶将稳定DNA寡核苷酸(oligo)，否则其不足够稳定以阻断发夹重新杂交以便持续长到足以被检测的时间。同样地，DNA聚合酶结合到用作引物的小寡核苷酸的3'末端增加其稳定性。或者，阻断的持续时间也可以减少。事实上，本发明人已经证明，某些解旋酶的结合触发所述杂交体的去稳定，所述杂交体在更短的阻断时间内被翻译。
根据优选的实施方式，本发明的方法从而包括以下步骤：
a)通过向含有特异性序列的双链核酸分子施加物理力，使所述分子变性；
b)提供所述蛋白以及与所述核酸序列相对应的单链核酸分子；
c)在所述蛋白以及所述单链核酸分子存在时，使所述双链核酸分子复性；以及
d)检测对双链核酸复性的阻断。
因为这种实施方式允许确定所述蛋白与双链核酸内包含的序列的结合，所以这种实施方式特别有利。
在典型的构型中，双链核酸分子可以特异性地锚定在两种固体基质上(如显微镜玻片、微量移液器、微粒)。末端之一可直接或间接地附着到表面，而另一个末端直接或间接附着到可移动的表面。在这种实施方式中，当移开支持物时拉力施加到双链核酸的两个末端。当拉力高于阈值时，两条链分离而核酸分子变性。施加的拉力优选高于或等于15pN；更优选高于或等于16pN；甚至更优选高于或等于17pN；在非常优选的方面，拉力高于或等于18pN。这种力可随温度、核苷酸类型和缓冲液而变化，但本领域技术人员根据这些参数将很容易调整所述力以获得两条链的分离。另一方面，当拉力下降到低于最小值时，变性双链核酸的两条链可以重新杂交。为获得所述两条链的重新杂交，优选施加小于或等于12pN的拉力；更优选地，其小于或等于11pN；甚至更优选地，其小于或等于10pN。
最优选地，双链核酸是发夹。如本文所用，“发夹”是指这样的双螺旋，其中一条链的5'端通过未配对的环而物理连接到另一条链的3'端。所述物理连接可以是共价或非共价的。优选地，所述物理连接是共价键。因此，发夹由双链茎和未配对的单链环组成。在发夹中，两条链的未参与到环中的端是游离的，因此可被拉开。这导致双链核酸的未配对，从而产生变性的双链核酸分子。有可能通过用高于阈值的力拉所述核酸分子的每一末端而完全打开发夹双链核酸分子。当施加到分子的拉力下降到低于最小值时，核酸分子重新杂交并重新形成发夹。结合至所述变性的核酸分子(例如，ssDNA)的蛋白的存在导致重新杂交的暂停。同样地，杂交至打开的发夹的核酸链之一的单链核酸分子的存在，导致重新杂交的暂停，当双链核酸结合蛋白结合复合物时，所述暂停的持续时间被改变(即，或者增加或者降低)。因此，检测到这种暂停持续时间的改变说明蛋白结合双链茎的至少部分。
在这方面，有利的是设计环序列和长度以便发夹在短瞬间之后，如1秒后重新折叠。在现有技术中已经描述了达到这种效果的方法，如在Woodside等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103(16):6190-6195,2006中。当力从打开降低至测试值时，打开的发夹的伸展因为单链DNA的弹性而变化。发夹重新折叠前的小延迟允许用户在与用于检测阻断状态所用力相同的力下确定发夹的伸展。
特别是，使用发夹使得有可能进行配对和去配对的循环，从而改善信号/噪音比。
已知允许双链核酸的游离端连接在一起的技术，一些技术将在以下更详细地描述。
确定阻断，在本文意味着确定与阻断相关的物理参数。一个有用的参数是在双链核酸分子上阻断的位置，所述位置对应于蛋白结合打开的双链核酸分子的位置，或者蛋白结合至在所述打开的双链核酸分子上的单链核酸分子的杂交的位置。事实上，本发明人已经发现可精确确定复性中在双链核酸上发生暂停的位置：使用发夹为技术人员提供一种手段，以便确定在变性/复性过程中的任何时间上发夹两个游离端之间的物理距离。
因此，根据本发明特别有利的是，所述方法包括确定阻断位置的另一步骤。
根据此优选的实施方式，本发明提供用于确定蛋白结合含有核酸序列的核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过向含有核酸序列的双链核酸分子施加物理力，使所述分子变性；
b)提供所述蛋白；
c)在所述蛋白存在时，使所述双链核酸分子复性；
d)检测双链核酸复性的阻断；以及
e)确定在所述双链核酸分子上所述阻断的位置。
“游离端”在本文表示没有共价连接到另一条链末端的一条链的端；如上所述，这些游离端中的每个均可以结合不同的表面。例如，这些表面中的一个可以是可移动的，而另一个可以是静止的。因此，技术人员将很容易地认识到，为测量发夹双链核酸游离端之间的距离，有可能仅简单地测量两个表面之间的距离。
当发夹分子完全变性时，这种距离最大(z高(F打开))，因为那时发夹核酸完全伸展；当所述发夹分子完全复性时，这种距离最小(z低(F测试))。有利地，在相同力F测试下进行所有长度的比较，以使得单链核酸具有相同的弹性性能。通过使用环关闭中的延迟，技术人员可以测量z高(F测试)。同样地，当复性过程临时性地暂停时，可以测量两个游离端之间的距离：如预期地，这种距离z介于z高和z低(所有z以F＝F测试进行测量)之间。很清楚地，随着单链核酸结合蛋白的、或者单链核酸所互补的序列的结合位点在发夹分子中定位的变化，这种距离z而变化。如果所述蛋白结合至定位接近发夹游离端的序列，则自己重新杂交的过程就刚好在重新形成完整发夹之前被阻断；在这种情况下，z暂停最小。另一方面，如果所述蛋白结合至接近未配对环的发夹部分，则复性过程将在发夹完全、或几乎完全变性的情况下被阻遏；在这种情况下，z暂停最大。同样地，如果所述单链核酸和位于靠近发夹游离端的序列相杂交，则自己重新杂交的过程就刚好在重新形成完整发夹之前被阻断；在这种情况下，z暂停最小。另一方面，如果所述单链核酸和靠近未配对环的发夹部分相杂交，则复性过程将在发夹完全、或几乎完全变性的情况下被阻遏；在这种情况下，z暂停最大(图1A-1C)。
有可能精确地将双链核酸分子中的物理距离与若干碱基相关联。例如，在10pN力下，0.8nm的距离对应于单链核酸中由两个连续的核苷酸(1bp)所跨越的距离。由单链核酸的弹性给出伸展相对于力的准确校准。因此，通过简单测量部分重拉上的双链核酸分子两个游离端(或在分子上的任意两个参考位置)之间的距离，有可能精确地确定复性在何处被阻断。
因此，在一个实施方式中，本发明由用于确定蛋白结合至核酸分子的方法组成，其中所述双链核酸分子首先通过施加物理力变性，然后在所述蛋白、以及任选地单链核酸存在下重新杂交，以及检测重新杂交中阻断的存在。在一个方面中，当复性过程被阻断时，确定部分复性的双链分子两端之间的距离。优选地，当分子完全变性时，确定所述分子两端之间的距离。更优选地，比较两个距离并确定阻断的位置。更优选地，测量在完全伸展的环和参考杂交位置之间的距离，并用于确定阻断的位置。甚至更优选地，测量两个参考杂交位置之间的距离，并用于确定阻断的位置。
除了其在分子上的位置，与复性中阻断相关的最有用的参数是复性被阻断期间的时间长短(本文称为复性中暂停的持续时间)。事实上，有可能测量重新杂交被阻断期间的时间长短。例如，技术人员可以确定双链核酸的两端之间距离为如上所定义的z(即在z高和z低之间的中间值)的时间长短。
当变性的双链核酸和互补单链核酸之间的杂交造成阻断时，阻断的持续时间取决于两条序列之间的互补性程度。互补性越高，两分子之间建立的键的数目越多，并且因此持续时间越长。还清楚的是，阻断时间将取决于两条序列之间互补性区域的长度。区域越长，两分子之间建立的键的数目越多，因此持续时间越长。因此容易想到，在某些条件下复性暂停的持续时间将几乎是永久的。特别是，当单链核酸包含多于20个，优选多于25个，甚至更优选多于30个能够与变性双链核酸杂交的核苷酸时，即使当向所述双链核酸施加的力降低到F测试时，单链核酸仍然与双链发夹杂交(许多分钟)，从而防止所述双链发夹的自己重新杂交。在这样的情况下，使用酶去除单链核酸分子或者增加第三阶段可能是有利的，其中所述第三阶段中力被降至0.5或1pN持续若干秒以有效排除杂交的寡核苷酸。因此，去除所述单链核酸分子使得可能进行配对和解除配对的循环，从而改善信号/噪音比。
暂停的持续时间也可随着反应条件变化。所述持续时间将随着温度的升高而降低。同样，缓冲条件也可以调节暂停的持续时间：例如，镁、甜菜碱和氯化四甲铵(以摩尔浓度使用的TMAC)增加阻断时间。与GC相比，这些化合物更加加强AT配对，从而减少这些配对之间强度的差异。然而，当温度和缓冲液固定时，暂停的持续时间将仅取决于拉动变性双链核酸的力以及其与单链核酸的互补性。事实上，发明人已经证明，当力降低时阻断时间指数性降低。
最后，阻断的持续时间将也取决于在蛋白、变性的双链核酸和互补的单链核酸之间形成的复合物的性质。双链核酸结合蛋白的存在可稳定复合物。对双链核酸的亲和性越高，暂停出现得越长。还有可能蛋白使双链核酸去稳定(例如，在RNA聚合酶的打开复合物的情况中)导致更短的暂停
同样地，存在能够结合变性的双链核酸的蛋白将短暂阻断所述核酸分子的复性。这种阻断的持续时间也将取决于蛋白对核酸的亲和性。清楚地，对所述分子具有高亲和性的蛋白比具有更低亲和性的蛋白将导致更长的暂停。
技术人员将很快认识到，如在实施例部分所述，测量暂停能够确定阻断的平均时间，从而确定结合反应的动力学参数。
因此，在一个具体方面，本发明的方法包括以下步骤：
a)通过向所述双链核酸分子施加物理力，使所述分子变性；
b)提供蛋白、以及任选地单链核酸分子；
c)在所述蛋白、以及任选地所述单链核酸分子存在下，使双链核酸分子复性；以及
d)检测所述双链核酸分子复性的阻断；以及
e)确定暂停的持续时间。
优选地，所述方法包括确定阻断位置的另一步骤。
在此实施方式中，暂停的持续时间可与对照相比较。特别是，当所述蛋白是双链核酸-结合蛋白时，有利地可将所述暂停与不存在所述蛋白时进行此方法所测量的暂停相比较。如上所述，蛋白结合变性双链核酸与互补单链核酸之间形成的复合物改变了复性阻断的持续时间。在暂停的持续时间中，所述阻断翻译或者增加或者减少(取决于特异性蛋白)。
因此，在一个优选的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：
a)通过向所述双链核酸分子施加物理力使所述分子变性；
b)提供蛋白、以及任选地单链核酸分子；
c)在所述蛋白、以及任选地所述单链核酸分子存在下使双链核酸分子复性；以及
d)检测所述双链核酸分子复性的阻断；以及
e)确定暂停的持续时间；以及
f)与不存在蛋白时的持续时间相比较。
有利地，所述方法包括确定阻断位置的另一步骤。
尽管有可能不需要搜索在结合位点序列上的信息而检测和测量蛋白与核酸的结合，其可在一些应用中用于确定所述序列。例如，鉴定取消所述蛋白结合的所述结合位点上的突变可以是有意义的。
因此，在一个优选的实施方式中，本发明的方法因而涉及用于确定蛋白结合含有核酸序列的双链核酸分子的方法，所述方法包括步骤：
a)通过向所述双链核酸分子施加物理力，使所述分子变性；
b)提供所述蛋白以及任选地与至少部分的所述双链核酸分子互补的单链核酸分子；
c)在所述蛋白以及任选地所述单链核酸存在下，使所述双链核酸分子复性；
d)检测双链核酸分子复性的阻断；以及
e)测序所述蛋白结合的核酸序列。
有利地，检测复性的阻断接着是确定阻断位置的步骤。
优选地，在对结合位点进行测序之前，将所述蛋白和所述单链核酸分子从双链核酸分子上洗脱。
因为本发明的方法基于单分子的检测，使用不需要事先扩增就可对单分子进行测序的方法是便利的。这种单分子鉴定和测序方法之前已描述过(WO 2011/147931；WO2011/17929；Ding等人,Nature Met,9(4):367-372,2012)。这些测序方法基于检测变性的双链核酸分子复性的阻断。因此，根据本发明的测序方法包括步骤：
a)通过向双链核酸分子施加物理力，使所述与所述核酸序列对应的双链核酸分子变性；
b)提供单链核酸分子；
c)在所述单链核酸分子存在下使双链核酸分子复性；以及
d)检测双链核酸复性的阻断。
有利地，所述方法包括确定阻断位置的另一步骤。
这些测序方法可以容易地与本发明的方法结合起来，因为它们使用与本发明方法相同的装置。通过拉动将发夹固定在表面的磁珠，可以将分子拉链拉开。在这个打开状态下，当拉力减小时其可以与互补单链核酸杂交，这短暂阻断发夹重新拉上拉链。通过测量从表面到阻断发夹的珠的距离，可以以接近单碱基的精度来确定杂交在分子中的位置，因此确定此处序列是什么(是在溶液中已知单链核酸序列的互补)。因此，有可能直接测序所述蛋白结合的分子，而不改变实验的设置，仅通过将含有蛋白和任选互补单链核酸的缓冲液替换为适于根据所述方法测序的缓冲液。
高效鉴定DNA顺式调控元件是后基因组生物学的主要挑战。鉴定特异性核酸-结合蛋白在基因组中的所有结合位点是特别有用的，因为它鉴定了可能由所述蛋白来调节其表达的所有基因。全面鉴定DNA顺式调控元件对预测理解转录网络动态是至关重要的。
全基因组DNA序列数据、高通量技术和新算法的融合正在快速推进我们鉴定和表征转录调控元件的能力(Eisen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,95:14863-14868,1998；Tavazoie等人,Nat.Genet.,22:281-285,1999；Bussemaker等人,Nat.Genet.,27:167-171,2001；Lee等人,Science,298:799-804,2002)。然而，这些方法有固有局限性。例如，使用基因表达簇(clustering)和顺式调节基序发现的杂交方法的成功受限于在实验室中使用的生理干扰的范围。对于体内方法也是如此，如基于芯片的染色质免疫沉淀(ChIP)，其中DNA-蛋白相互作用由于其调节作用只存在于特定环境条件下(Lee等人,Science,298:799-804,2002)。对于后生动物真核细胞这些限制甚至更严重，其中试验数据更难以获取。
本方法对现有技术的方法提供选择，例如ChIP(染色质免疫沉淀)和DNAse I足迹以测绘(map)转录因子在基因组中的结合位置(The ENCODE Project Consortium,Nature,489:57-74,2012)。
因此，根据另一方面，本发明还涉及用于鉴定含有能够结合特异性核酸-结合蛋白的序列的核酸分子的方法，所述方法包括步骤：
a)提供双链核酸分子的群体；
b)通过上述方法测试所述蛋白与所述核酸分子的结合；以及
c)选择能够结合所述蛋白的核酸分子。
优选地，所述方法涉及提供与所述核酸分子的结合位点互补的单链核酸。
根据这个实施方式，该方法因此包括步骤：
a)提供双链核酸分子的群体；
b)通过向所述双链核酸分子施加物理力，使所述分子变性；
c)提供所述蛋白以及与所述结合位点互补的单链核酸分子；
d)在所述蛋白以及所述单链核酸分子存在下，使所述双链核酸分子复性；以及
e)检测双链核酸复性的阻断或不阻断；以及
f)当复性被短暂或永久阻断时选择核酸分子。
有利地，所述方法包括确定阻断位置的另一步骤。
有待如此分离的核酸分子对应于包含所述特异性结合序列的核酸分子群体。因此，它们与其它核酸分子的不同在于它们含有这种特异性序列。虽然这些分子都具有这个序列，然而它们可能或可能不相同。在某些实施方式中，优选技术人员鉴定每个核酸分子与所述特异性结合序列之外不同的序列。实际上，当鉴定包含特异性核酸-结合蛋白的一个或更多个结合位点的核酸分子时，例如，使用上述测序方法测序鉴定的分子可能是有利的。通过这种步骤获得的信息可以能够在全基因组定位所述分子，从而鉴定出这种结合位点可调控或不可调控的表达单元。通过小心使用测序步骤获得的信息来搜索数据库，这可很容易地实现：本领域技术人员知道借助公开可获得的序列数据库(例如Genbank)如何去寻找包含测序获得序列的克隆，不需在此进一步详述。
在优选的实施方式中，双链核酸分子群体代表整个基因组。
有利地，通过稀切限制性酶消化第一染色体从而获得双链核酸分子的群体。如本领域技术人员所知，稀切限制性酶是具有仅仅非常稀有地存在于基因组中的识别序列的限制性酶，例如识别序列含有7或8个碱基。这种稀切酶的示例包括Sfi I、Xma I、Asc I、AsiSI(同裂酶Sgf I)、Not I(同裂酶CciN I)、Sbf I(同裂酶Sse8387I、Sda I)、Fse I、Pac I等。所有这些酶都是商业上可获得的。在第二步骤中，将由此获得的限制性片段通过常见的6碱基限制性酶，如EcoRI、BamHI、XhoI等进行消化。随后，所得线性双链片段可以被转化成发夹。已知允许双链的游离端连接在一起的技术，并且一些将在下文中进一步详述。
本发明方法的另一个特定应用是检测表观遗传修饰。这样的测试目前非常难以进行并且丢失许多DNA修饰。但表观遗传修饰对于各种病理(包括微生物感染和肿瘤)是极其重要的。有利地，上述发明可以用于筛选在基因组DNA全部或选定区域的修饰。
对DNA的表观遗传修饰在几乎所有活生物体的基因组中存在。它们的类型和位置，随着生物体、组织和细胞类型的不同；随着时间的不同而有所不同；并通过与环境的相互作用而变化。这些修饰中的一些通过仔细控制的细胞过程而产生。其它是DNA损伤的结果。
这样的修饰大大扩大可存储在DNA内的信息量。例如，大肠杆菌的dam基因编码DNA甲基转移酶，它将双链DNA上GATC序列中的腺嘌呤甲基化，从而调节基因表达(参见例如Calmann和Marinus,J.Bacteriol.,185(16):5012-5014,2003)。另一方面，在真核生物中最常见的表观遗传标记是5-甲基胞嘧啶(5mC)。需要这种特异性修饰来控制和调节各种各样重要的细胞的以及更广泛的生理过程，人类中与DNA甲基化有关的问题关系到各种疾病，最值得注意的是某些类型的癌症。除了5mC，在真核生物中还存在很多其它各种DNA修饰(Korlach和Turner,Curr.Opin.Struct.Biol.,22:251-261,2012)。
到目前为止，对5mC确定的金标准为“重亚硫酸盐转化”，其中所有胞嘧啶残基(除了那些已经被甲基化的保持不变之外)转换成尿嘧啶。DNA产物的后续扩增将尿嘧啶转换成胸腺嘧啶。然后，可以通过DNA测序来检测这些转换变化(Song等人,Nature Biotechnol,30(11):1107-1116,2012)。然而，这是一个具有5-34％误差率的复杂的、耗时的、且昂贵的过程(Beck,Nature Biotechnol,10:1026-1028,2010)。
本发明提供了一种简单的方法用于检测核酸的表观遗传修饰。“表观遗传修饰”在本文中称为构成核酸分子的碱基在所述核酸分子合成之后发生的修饰。这种表观遗传修饰包括，尤其是DNA中的4-甲基胞嘧啶(m4C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羰基胞嘧啶(5caC)、以及6-甲基腺苷(methyladenosine)(m6A)和RNA中的5-羟甲基尿嘧啶(5hmU)和N6-甲基腺苷(m6A)。
因此，在一个特定的方面，本发明提供用于检测双链核酸分子内包含的至少一个修饰碱基的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述双链核酸；
b)提供能够结合所述修饰碱基的蛋白；以及
c)通过上述方法，测试所述蛋白与所述核酸分子的结合。
任选地，本发明的方法可以包括另一步骤来测试识别可能的修饰位点的简单寡核苷酸的杂交，以更好验证结果。例如，在使用5mC的抗体检测5mC甲基化之后，可用寡NNTACGNN检测序列ATGC。
这种方法是特别有利的，因为它在可逆过程中使用未修饰的结合分子。例如，当用于检测5mC时，不需要DNA上的化学(硫酸氢钠)反应。此外，本发明的方法比任何现有技术的方法更加灵敏，因为它允许检测单分子基础上的修饰碱基。
在优选的实施方式，修饰碱基选自5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)、5-羰基胞嘧啶(5caC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)以及N6-甲基腺苷(m6A)。在更优选的实施方式中，所述碱基选自5mC和5hmC。在甚至更优选的实施方式中，所述碱基是5mC。已描述特异性识别并结合至这些修饰碱基的蛋白。例如，针对5mC的抗体已得以描述，并通过对这种修饰进行染色而用于基于细胞的可视化(Ito等人,Nature,466:1129-1133,2010；Ko等人,Nature,468:839-843,2010；Szulwach等人,Nature Neurosci,14:1607-1611,2011；Haffner等人,Oncotarget,2:627-637,2011；Inoue等人，Science,334:194,2011；Inoue等人,Cell Res,21:1670-1676,2011)。这些抗体是商业上可获得的(例如，克隆33D3；参考：Active Motif的39649)。除了抗体，还已经鉴定了特异性识别并与感兴趣的核苷酸反应的酶(Song等人,Nature Biotechnol,30(11):1107-1116,2012)。例如，T4噬菌体酶β-葡萄糖转移酶(βGT)将葡萄糖部分转移至5hmC。Tet1-3蛋白负责将5mC转换成5hmC。甲基-CpG-结合蛋白2(MeCP2)通过其对含有5-mC的DNA的亲和性而被首先鉴定。优选地，所述蛋白是针对所述修饰碱基的抗体、或特异性识别所述碱基的酶。更优选地，所述蛋白是抗体。
很明显，同样的方法可以适用于检测核酸的其它修饰。例如，它能够检测双链核酸分子上存在的错配。蛋白，如很久以来就知道的细菌MutS识别子链上的错配碱基并结合到突变的DNA。这样的属性可以被投入使用以检测和鉴定双链核酸分子中的任何错配。
因此，本发明的又一方面是提供用于在双链核酸上检测至少一个错配的方法，所述方法包括步骤：
a)提供所述双链核酸；
b)提供能够结合错配碱基的蛋白；和
c)通过上述方法测试所述蛋白与所述核酸分子的结合。
因为已知MutS作为二聚体结合错配，在本发明的方法中有利地使用MutS二聚体。在真核生物中，MutS同系物形成两个主要异二聚体：Msh2/Msh6(MutSα)和Msh2/Msh3(MutSβ)。优选地，所述蛋白选自MutS二聚体、Msh2/Msh6(MutSα)和Msh2/Msh3(MutSβ)。
单核苷酸多态性(SNP，发音为snip；复数为snips)是当生物物种的成员或或人类中配对染色体之间的单一核苷酸A、T、C或G在基因组中(或其它共享序列)中不同时而发生的DNA序列变异。平均而言，在人类群体中发生的SNP多于1％倍(time)。因为只有大约3至5％人类DNA序列编码产生蛋白，大多数SNP见于编码区外。见于编码序列内的SNP是特别令人感兴趣的，因为它们更有可能改变蛋白的生物功能。
当含有SNP的分子与含有在大多数群体中发现的序列的分子杂交时将形成错配。从而，本发明能够容易地检测出SNP。
因而，此实施方式涉及用于在核酸所含有的序列中检测SNP的方法，所述方法包括步骤：
a)将所述核酸杂交至含有在大多数群体中发现的序列的单链核酸；以及
b)通过上述方法检测所得错配。
如果待测核酸是双链核酸，则有利地在步骤a)之前使所述核酸变性。
很显然，通过上述方法的简单调整，这些方法可以以全基因组规模进行。这将导致在基因组中鉴定出含有例如特定修饰碱基的所有位点。通过测序含有这种修饰碱基的核酸分子，可以鉴定出表达易受所述修饰碱基影响的基因。此外，因此可以评估所述修饰碱基至子代的传递。这些信息在像动物或植物选择的领域中是令人感兴趣的，其中重要的是确保某些基因保持沉默而其它基因在代系中保持表达。
在又一方面，提供用于鉴定干扰蛋白与其特异性结合序列结合的化合物的方法。这些化合物减少或消除所述蛋白与其结合位点的结合。这样的化合物可以用于治疗。例如，阻止cMyc的致癌形式与其结合位点相互作用的化合物将用于治疗癌症。
根据这种实施方式，本发明涉及用于鉴定能够阻止蛋白和其结合位点之间相互作用的至少一种化合物的方法，所述方法包括步骤：
a)提供所述蛋白和含有与所述结合位点对应的序列的核酸分子；
b)提供化合物；以及
c)通过上述方法测试所述蛋白与所述核酸分子的结合。
在优选的实施方式中，当所述蛋白与所述核酸分子的结合被减少或消除时，选择化合物。
很明显，大多数涉及癌症的核酸结合蛋白是结合双链核酸的转录因子。因此，在另一优选的实施方式中，所述核酸分子是双链核酸分子。在另一优选的实施方式中，方法还包括提供与所述双链核酸分子的序列互补的单链核酸。当然，在测试结合发生之前提供这些分子。
已可能实现本发明方法，特别是通过设计用于在单分子水平探测实时核酸相互作用的装置的存在。这种装置描述于，例如美国专利No.7,052,650和7,244,391。其中描述的设备使用磁阱来向微米尺寸的超顺磁性珠施加皮牛顿尺度的力。简要地说，所述设备包括光学显微镜、磁体和PC。双链核酸分子的一端在多个点上被锚定至静止元件，如表面，并且另一端被锚定至可移动的表面，在这种情况下所述可移动的表面是磁珠。提供磁体以便作用于珠。特别是，磁体可用于拉动珠离开表面。然而，本发明方法的实施并不限于上述设备。任何允许完全伸展然后重新折叠双链核酸分子并在同一时间监测所述分子的伸展的装置可用来实现本发明的方法。例如，可使用光镊(optical tweezer)；然而它们需要事先进行力的校准，并且不容易进行并行化以便用于高通量测量。其它缺点是核酸的校准扭转控制(adjusting torsional control)的复杂性以及通过聚焦激光所造成的可能的溶液局部加热(这可改变杂交条件)。
双链核酸在有充足珠(例如，链霉亲和素包被的珠)的溶液中孵育数分钟，双链核酸通过其标记(例如生物素)端之一结合至珠。如果之后使用光镊进行操作，那么珠可以是透明的，或者如果使用磁阱或镊子进行操作，那么珠可以是磁性的。
将组装的珠-核酸注射至流体室，其表面已被处理过以便结合分子的另一标记端(例如抗地高辛包被的表面结合至核酸的地高辛标记端)。因此，珠经由核酸发夹锚定至表面，参见图1A。然后，通过本领域技术人员已知的各种手段监测珠到表面的距离：例如，其在相机图像上的衍射环可用来推导其距离，或者当它们处于衰减模式(evanescent mode)被照射时它们散射(或通过荧光发射)的光强度可以用来测量其距离。或者，(使用磁传感器，如GMR或Hall传感器)可以测量它们所产生的磁场从而推导它们到锚定表面上的传感器的距离。
已描述了将锚定珠的核酸分子牵拉至表面的各种技术。可以使用聚焦激光束的光来捕获靠近聚焦点的透明珠。通过相对于锚定表面的相对束的平移(translation)，可以向固定分子施加力(典型的光镊实验)。施加的力与珠距离其平衡位置的位移(displacement)成比例，为了对固定分子施加恒定的力，需要捕获束上的反馈环路。
为在珠上施加恒定力，已描述使用通过环绕珠的流动所产生的流体动力阻力(hydrodynamic drag)，但它通常产生低的空间精确度(>100nm)。优选的实施方式使用磁阱来拉动通过如上所述的核酸发夹而锚定到表面上的超顺磁性珠。在此构型中，放置在样本之上的小磁体用于在锚定的珠上施加恒定的力，其位置可以以<1nm的精确度来确定(取决于拉力和归因于流体动力阻力的损耗)。
在每一个情况下，注意到可以通过用大于约16pN的力拉动珠，来机械地完全打开固定的发夹。分子上的拉力降低至约11pN之下时允许发夹自发地重新拉上拉链(拉开拉链的转换尽管滞后但是可逆的)。如果在打开拉链阶段期间，溶液中一些分子(例如蛋白质或DNA、RNA、LNA或PNA的互补寡核苷酸)已结合至伸展开的单链核酸，当力降低到11pN之下时这些分子将阻断重新拉上发夹。因此，分析原理是两种力之间的切换：大者F打开用于打开发夹，而较小者F测试用于允许重新拉上拉链以及测量在短暂阻断时分子的伸展。在完全伸展和阻断部分之间，阻断位置和序列以线性关系相关联。对于最佳的精确度，优选地在测试力F测试下测量完全伸展。这通过设计这样的发夹环来实现，即一旦力从F打开降低到F测试，发夹环需要几分之一秒去重新折叠。
可以使用本领域中已知的任一技术将核酸附着至表面或支持物。实质上，核酸直接锚定至支持物如微珠，其涉及这种表面的官能化，例如通过使用链霉亲和素、COOH基团等对所述表面进行包被，以便能够与核酸官能化的末端进行反应。
在一般情况下，这样的方法必须官能化核酸，尤其在3'和5'端，也就是说在其上接枝合适的化学基团。此外，优选通过环连接分子的另两个游离端以防止链在操作结束时解离，从而如果适当时可以重复后者。为了这个目的，可以采用不同的程序。
最简单的是使用合成的寡核苷酸用两个不同的官能团(例如，生物素和胺)对双链核酸末端之一进行官能化，其允许锚定到两个不同的预处理表面。使用部分配对的合成核苷酸可以使两条链在其另一端被连接成环的形状。以这种方式，从双链核酸产生配对的单链核酸，即发夹。这种方法的优点在于其能够官能化大核酸片段的异质群(如通过基因或染色体的片段化所获得的)，然后可以对其同时进行分析。在这种情况下，使用两种(或更多)限制性酶将核酸样本片段化，使得能够获得在其端部具有两种不同的限制性位点的亚群，这在所有片段中都是相似的。这使两端能够进行不同的处理(例如，通过环的形式将一端连接到寡核苷酸，环在其端部具有适当的限制性位点)。这种方法的缺点在于两个相邻官能团之间的立体干扰，使得难以偶联至表面。为了解决这个问题，有利地可在发夹分子每个游离端添加碱基的“间隔”序列，然后向碱基“间隔”序列的末端加入官能团；两个间隔序列是非互补的，为每一个官能团提供足够的空间来结合至其专门的表面。更有利的是，设计每一个间隔序列的序列以便在本发明的测序方法中使用已知序列的单链测序引物。可以用分子生物学中任何常用方法向双链核酸分子添加环和/或间隔。这些方法是本领域技术人员众所周知的，因此没有必要在此详述。
至于实际的锚定技术，有许多这种技术并且它们源自用于将大分子(蛋白质、DNA等)锚定至的商业上可获得的预处理表面的技术。大多数这些技术已被开发用于免疫学测试以及将蛋白(免疫球蛋白)连接至表面，所述表面携带能够与蛋白羧基(-COOH)或氨基(-NH2)端反应的基团(-COOH、-NH2、-OH等)。
可以通过分子5'端的游离磷酸直接完成核酸的共价锚定，其中游离磷酸与仲胺(由斯特拉斯堡的Polylabo销售的Covalink-NH表面)反应形成共价键。也可以用氨基将DNA官能化，然后如同处理蛋白质一样进行处理。
也有链霉亲和素包被的表面(Dynal珠等)，其允许链霉亲和素和生物素化DNA分子之间的准共价锚定。最后，通过将针对地高辛的抗体接枝到表面上(通过上面提到的方法)，用地高辛官能化的核酸可以锚定于此表面。这仅仅代表许多可能的锚定技术中的一个样本。
在附着与锚定技术当中还应该提到的是，例如专利EP 152 886所描述的技术，其使用酶偶联用于将DNA附着到固体支持物如纤维素上。
专利EP 146 815也描述了各种将DNA附着到支持物上的方法。
相似地，专利申请WO 92/16659建议使用聚合物来附着DNA的方法。
当然，核酸可以直接附着至支持物，但必要时，特别是考虑到限制表面的影响时，核酸可以附着至肽或其它性质的惰性臂的末端，例如在专利EP 329 198中描述的。
下面的实施例将带出本发明的其它特征和优点。
附图说明
图1A-1C：寡核苷酸杂交至其在发夹DNA上的互补序列的检测原理。将珠锚定至表面的发夹DNA(a)通过将拉动珠子的力增加到16pN以上的值，瞬间拉开拉链。在该阶段，溶液中的互补片段杂交至打开DNA发夹上的其靶点，从而短暂防止当力降低回到其初始值时发夹(b)重新拉上拉链。从阻断点和发夹初始长度之间的分子伸展(z高-z)的变化，推导出互补序列在发夹中配对的位置。根据阻断的平均时间间隔，可以知道可能存在错配及其在杂交体中的位置。(c)随着力从11.4pN提高到17.8pN然后降低回其初始值，发夹伸展的时间追踪。人们注意到重新杂交期间存在约10秒的暂停。只有在溶液中存在长度>7个核苷酸的互补(或几乎互补)的寡聚物时(此处信号是10聚体所致)才能观察到这种暂停。
图2A-2B：a)在F测试＝9pN时获得10nt寡核苷酸的阻断时间的指数分布。b)T闭相对9nt寡核苷酸获得的F测试的指数依赖。
图3：阻断概率P阻断＝阻断的循环数(Nb.)/循环数(Nb.)随着打开阶段持续时间Τ打开(Topen)的演化(evolution)，Τ打开是12nt的寡核苷酸找到其互补位点的时间。拟合(fit)表明T开(Ton)是当寡核苷酸浓度为20nM时分子找到其靶所需的时间，通常是15秒。这个时间不依赖于在测试阶段所用的力。如果检测到所有的事件，参数a(F)将等于1，但由于短的事件丢失，特别是当F测试小的时候a(F)小于1。
图4：阻断概率增加，并随着寡核苷酸浓度饱和。在这里，对于打开阶段持续10秒并且F测试＝8pN，浓度为27.5nM的12nt寡核苷酸导致每两个循环存在一次阻断。如图3中所见，P阻断的饱和不会完全达到1；这是因为我们丢失了非常短的阻断。
图5A-5C：限定12nt寡核苷酸与其互补底物的结合属性的动力学参数作为缓冲液的离子强度的函数。随着离子强度变化k闭(koff)变化很小，而k开(kon)呈现出强的依赖性。通过加入Mg2+，k开提高了3个因子。可以从两个动力学参数计算平衡常数kd。
图6A-6B：引发酶导致的发夹阻断，其中引发酶稳定与引发(priming)DNA序列互补的5nt RNA寡核苷酸。图6A：阻断事件在序列上的位置。图6B：在使用F测试＝9pN时观察到的T4引发酶产生的阻断时间的分布，所述T4引发酶在引发过程中稳定五聚体RNA寡核苷酸。所述5nt RNA寡核苷酸不以可见的方式阻断发夹重新折叠。使用T4引发酶WT，在序列的预期位置发生阻断并且阻断时间为5秒。使用E248Q突变体，我们观察到同样的现象但阻断时间显著减少。
图7：采用三个阶段，测试解旋酶RecQ与ssDNA结合的一系列循环：F打开＝20pN时的打开阶段，在F测试＝10pN时的测试阶段，和在F清理(Fclean)＝0.5pN时的清理阶段。对一个循环显示呈现一些阻断事件的10个轨迹。低力时的清理阶段保证任何结合的酶都从模板移除。在没有ATP时，RecQ只是结合和阻断重新折叠，重新折叠叉的压力产生解旋酶的滑动，阻断位置通过连续步骤减少。
图8：RecQ阻断概率相对其浓度的演化。随着浓度增加P阻断增加并饱和，这限定了此处226pM的表征浓度。
图9：没有ATP时，RecQ解旋酶的阻断位置在模板上的分布。
图10：针对甲基化胞嘧啶的抗体在1.2kb DNA发夹上产生的阻断的原始(raw)信号。三个轨迹显示经5个循环的发夹伸展。使用20pN的力持续5.5秒打开发夹来开始每个循环，接着是在F＝6.5pN时持续37秒的测试阶段。
循环的大部分时间不会显示阻断(1)，一个发夹可以在相同的循环过程中显示连续阻断(2)，以及阻断可以延长超过几个循环。[Ac]抗体浓度为35nM，缓冲液是含有0.2％BSA的Tris 100mM以防止非特异性结合。
为清楚起见，轨迹在y中位移(shift)。
图11A-11B：使用人DNA甲基转移酶对1.2kb的发夹进行甲基化之后，甲基化位置在1.2kb发夹序列中的直方图。显示不同珠的四个直方图。在结合位置具有一致性；我们观察到四个预期结合位置与真核甲基化相关，以及在882的结合位置对应DNA原始来源的大肠杆菌所产生的甲基化。
图12A-12B：记录30个打开和闭合发夹的循环，其中采用2秒的力使光滑斜坡(ramp)上升，再使用2秒的力使光滑的斜坡下降。逆时针转动的循环中代表性的点(见箭头)，开始于F＝1.5pN和Z＝0；随着力增加伸展仍然很小，直到力达到15pN处分子打开并且Z达到1.3μm。当力随着斜坡减小时，Z慢慢减小直到F＝11pN，在此点发夹重新折叠直到其碰上(bump)12nt寡核苷酸。随着力不断降低，Z的阻断也是如此，但随着力降低其很快达到逐出寡核苷酸的点，这显示为在Z中由菱形符号标记的快速降低。在右侧显示寡核苷酸脱离时所对应的力的分布；其最大值约7pN对应着T闭等于几分之一秒处的力。
图13：对获自人类细胞的人类DNA检测甲基化位点。从2.5kb人类基因组DNA分子制备发夹DNA。A)整个测量循环所施加的力的变化：由19pN力打开发夹5秒钟；然后力降低到8.5pN持续10秒钟。B)在针对5mC的抗体存在时，在ca.20循环时获得的信号的叠加，显示出分子打开拉链，随后短暂阻断中断其重新拉上拉链。这些阻断由抗体结合5mC引起。C)阻断位置的直方图显示对应存在5mC的良好限定的位置。大约有20个位置，这表明每ca.100个碱基具有一个甲基化。
具体实施方式
实验实施例
发明背景
蛋白与DNA的结合是在生物学中的重要现象；它是控制许多反应的非常普遍的过程。虽然这种机制的热动力学平衡性质是公知的，测量其动力学却是更具挑战性的问题。使用单分子不仅提供测量蛋白寻找其DNA靶所需时间的能力还有测量结合事件准确位置的能力。我们在此描述实现这些目标的新的单分子分析。
虽然这种分析范围很广，我们首先说明其适用于特异性寡核苷酸的结合、以及解旋酶与ssDNA的非特异性结合。
最后，我们讨论识别DNA中甲基化位点的抗体的特异性结合。
摘要
本发明涉及基于机械检测DNA发夹重新杂交的阻塞来检测各种各样的DNA修饰和DNA蛋白结合事件的新方法。分析依赖于提供单分子结合统计信息的一系列循环。在一个循环中，当在时间T打开期间通过使用大于约16pN的力拉动单DNA发夹末端来展开所述单DNA发夹时，拉开拉链阶段开始。在持续T测试的第二测试阶段中，张力F测试减小到低于约11pN时允许发夹重新拉上拉链。如果溶液中存在的分子可以结合到打开的发夹中的确定序列、或者非特异性结合至打开的发夹(例如，能够识别修饰的或未修饰的特异性单或双链序列的蛋白)，所述分子将以概率P阻断结合DNA，在这种事件中当力降低至低于约11pN时将短暂阻断发夹重新拉上拉链。因为在发夹重新杂交期间在确定的位置出现暂停，这种阻塞是很容易检测到的，从而产生三个参数：
·这个暂停在伸展的DNA上的位置Z阻断表征着待识别的序列；
·阻断的持续时间T闭表征着分子仍然结合DNA的时间；以及
·阻断的概率P阻断关系到分子寻找其结合位点所需的时间T开。
T开和T闭都表征DNA和阻断分子之间相互作用的强度。因此，通过使用识别甲基化的蛋白质或抗体探查DNA序列(发夹以一端结合至珠，在另一端结合至表面)，可以通过发夹打开和闭合的反复循环来鉴定被探测的甲基化位点的存在(通过一些发夹重新杂交期间阻断的存在)。通过测量存在与不存在蛋白时互补寡核苷酸之间杂交体稳定性的增加，可以同样测量蛋白与推定的dsDNA位点的结合。
本发明允许不经过亚硫酸氢盐反应和PCR扩增步骤就检测基因组DNA上的DNA修饰。它需要一些将DNA加工成发夹片段所必须的DNA预处理，其可用于将珠结合至表面(用足够的片段进行片段化和连接)。本发明不需要蛋白或DNA的荧光标记。在本实施中，技术需要光学(显微镜)来检测发夹重新杂交期间的阻断。
详细技术说明
尺寸在几十至几千个碱基对之间的双链(ds)DNA片段(例如获自对基因组DNA的机械剪切或限制性切割)以其末端之一连接至DNA环。其另一末端连接到dsDNA片段，从而允许其两条链结合至不同包被的表面。例如，一条链的游离3'端可标记有生物素，从而允许结合到链霉亲和素包被的珠，而另一条链的5'端可标记有地高辛，从而允许其结合至包被有抗地高辛抗体的表面。通过本领域技术人员已知的各种方法可以实现这种末端标记，如使用末端转移酶来添加生物素(或地高辛)修饰的核苷酸，或者与适当标记的寡核苷酸进行杂交。
这种DNA构建体在具有充足珠(例如，链霉亲和素包被的珠)的溶液中孵育数分钟，以使DNA构建体通过其标记(例如生物素)端之一结合至珠。如果之后使用光镊进行操作，那么珠可以是透明的，或者如果使用磁阱或镊子进行操作，那么珠可以是磁性的。
将组装的珠-DNA注射至流体室，其表面已被处理过，以便结合分子的另一标记端(例如，抗地高辛包被的表面结合至DNA的地高辛标记端)。因此，珠经由DNA-发夹锚定至表面(参见下图1A)。然后，通过各种手段监测珠到表面的距离。例如，珠在相机图像上的衍射环可用来推导其距离。
当处于衰减模式中被照亮时，珠散射(或作为荧光发射)的光强度可以用来测量其距离。或者，当使用磁珠时，(使用GMR或Hall传感器)可以测量产生的磁场，从而推导珠-表面到锚定表面上的传感器的距离。
各种技术已描述将锚定珠的DNA分子拉至表面的各种技术。可以使用聚焦激光束的光来捕获靠近聚焦点的透明珠。通过相对于锚定表面的束的相对平移，可以向固定的分子施加力(典型的光镊分析)。施加的力与珠距离其平衡位置的位移成比例，为了对固定的分子施加恒定的力需要捕获束上的反馈环路。
为在珠上施加恒定力，已描述使用通过环绕珠的流动所产生的流体动力阻力，但它通常产生低的空间精确度(>100nm)。优选的实施方式使用磁阱来拉动通过如上所述的DNA发夹被锚定到表面上的超顺磁性珠。在此构型中，放置在样本之上的小磁体用于在锚定的珠上施加恒定的力，其位置可以以～1nm的精确度来确定(取决于拉力和归因于流体动力阻力的损耗)。
在每一个情况下，注意到可以通过用大于约16pN的力拉动小珠来机械地完全打开固定的发夹。分子上的拉力降低至约11pN之下时，允许发夹自发地重新拉上拉链(拉开拉链的转换尽管滞后但是可逆的)。
如果在打开拉链阶段期间，溶液中一些分子(例如蛋白质和/或DNA、RNA、LNA或pNA的互补寡核苷酸)已结合至伸展开的单链(ss)DNA，当力降低到约11pN之下时这些分子将短暂阻断发夹重新拉上。
经过一系列循环在这些重新拉上拉链的暂停之一期间，测量DNA分子的伸展Z(t)(珠至表面的距离)，可以以接近1nm(其对应在10pN力下，ssDNA中两个核苷酸跨越的距离(1bp))的精确度来确定阻断的位置。此外，通过测量阻断的平均时间，可以确定T闭＝1/k闭。通过测量P阻断和了解分子浓度[M]，有可能获得T开以及由此获得k开。这些参数中的一个或两个有助于表征结合性质。有可能，例如，确定是否其是由于与互补寡核苷酸的完全杂交，或者蛋白是否使杂交稳定，以及是否有错配以及错配在哪(例如，在杂交的寡核苷酸的中心或靠近其末端之一)。
这些观察表明各种实现应用于检测DNA修饰和更通常应用于检测蛋白与ss或dsDNA相互作用。
通过机械检测在重新杂交期间的阻断来检测DNA修饰
当机械打开DNA发夹的拉链时，如果溶液中存在(长度大于7个核苷酸)寡核苷酸，这些寡核苷酸可与其互补序列在DNA上配对，而当力降低到低于11pN时，其短暂阻止发夹全部重新拉上拉链，参见图1B。由于在打开拉链阶段寡核苷酸与DNA配对，可容易以相同分子进行一系列打开拉链/重新拉上拉链的循环，并检测在重新拉上拉链中的阻断(暂停)。
阻断时间的持续时间通常呈现指数分布，其平均值T闭随着F测试呈指数降低。这种概率分布表明这种分析的单分子的性质。它有一些后果：最可能的阻断时间为0，这意味着存在相当大比例的阻断，因为比我们的实验分辨率更短而使我们不能检测到。阻断发夹重折叠的分子在压力之下脱离DNA叉。如果F测试接近15pN(发夹展开机械力)，则这种压力弱，相反如果F测试减小，则叉的压力急剧增加而逐出分子。我们发现，如图2A-2B所示，T闭随着F测试呈指数降低。这种依从性如此强，以致我们只能在几个pN的范围内测量T闭。还要注意，当F测试＝F打开拉链＝15pN(此处未实现)时，T闭(F)将自发地只与未结合分子的经典T闭一致。
如图3所示，阻断概率P阻断随着打开阶段T打开的持续时间以指数行为增加：P阻断＝a(F).[1–exp(T打开/T开)]。
正如可以预期的，P阻断随着分子浓度增加，在图4中我们证明对于12nt寡核苷酸而言，P阻断随着[M]增加并达到饱和。
已知T打开和分子浓度[M]，可以使用下列关系式从P阻断推导出k开：
k开＝-Log(1-P阻断/a(F))/([M]T打开)。
结合强度(参见图5A-5C)可以表征为：
Kd -1＝-(T闭Log(1-P阻断/a(F))/([M]T打开)
阻断的平均时间T闭取决于寡核苷酸的尺寸、重新拉上拉链期间施加的力F测试、温度，但不显著取决于所用缓冲液的离子强度。
所述T开也取决于寡核苷酸的尺寸温度(size of the oligonucleotide of thetemperature)、缓冲液离子强度，但不显著取决于F测试。如图5A-5C所示也可通过测量这些动力学常数表征寡核苷酸与底物间的错配。例如完全互补的12nt寡核苷酸呈现1.5x 10-6M-1s-1的k开，在距离一端3个碱基远的位置引入单错配不改变太多k开。
将错配移动至寡核苷酸中间，k开降低了10个因子。
T闭还取决于可稳定杂交体的dsDNA结合蛋白的存在。例如，我们已经表明引发酶将稳定DNA寡核苷酸，否则DNA寡核苷酸将不够稳定来阻断发夹重新杂交长到足以被检测的时间，参见图6A-6B。同样地，聚合酶结合到用作引物的小寡核苷酸的3'端增加其稳定性；这种分析可用于确定聚合酶对其引物位点的亲和性。同样地，如果蛋白结合至特异性ssDNA位点(例如，甲基化的碱基)，其将在特异性位点阻断重新拉上拉链，并且时间长至足以被检测。
技术可以用来鉴定在ss或dsDNA上的DNA修饰。因此，使用针对DNA发夹碱基之一特异性修饰的抗体(Ab)，来探测将珠锚定至表面的DNA发夹，人们通过在发夹重新杂交时Ab结合发夹所导致的短暂阻断，可以检测这种修饰碱基在链上的存在与位置。使用一组互补寡核苷酸探测结合位点，将允许鉴定显示这种修饰的DNA片段。
检测RecQ与ssDNA模板的结合亲和性
解旋酶结合ssDNA缺口以解旋dsDNA。这些酶的活性直接取决于其对ssDNA的亲和性。我们建议此处直接测量或分析这种参数。这可以使用或不使用ATP或ADP或其它类似物来完成。我们在此显示关于没有ATP时来自大肠杆菌的RecQ解旋酶的一些结果。典型的结合信号可参见图7，其允许对于一种解旋酶浓度测量P阻断。P阻断相对于[RecQ]的演化显示在图8中。我们观察到，[RecQ]的表征浓度等于226pM。在图9中，我们看到解旋酶的非特异性结合。最后，酶所产生的阻断显示下滑(slippage)行为：Z位置不是一直恒定的而是通过多个步骤减少的。由于这种行为，很难定义T闭的真实值，因此我们只能测量T开和k开。
在Z＝0处的峰不对应阻断，而只对应直接的重新折叠。发现RecQ阻断沿着模板是均一的，在0.9μm处的衰减是因为具有略微不同伸展的分子进行平均。
检测甲基化
图11A-11B：针对5mC的抗体的阻断时间的直方图。大部分阻断短并且可以合理地拟合至具有1.3秒表征时间的指数分布中。然而，实质上阻断数目的17.5％超过30秒。在此条件下不是很容易确定酶的T闭，我们认为两种不同的结合机制以一个比另一个更强的方式进行竞争。
或者，可以通过存在(或不存在)识别修饰的蛋白时(如识别甲基化胞嘧啶的甲基结合结构域蛋白1(MBD1)，或针对特异性修饰的dsDNA产生的合适Ab)时，通过将互补寡核苷酸杂交至推定的修饰位点来探测已知DNA修饰的存在。蛋白存在时的阻断时间将显著增加，这使得易于鉴定和定位修饰碱基。
通过使用识别错配的蛋白，类似地可以使用上述方法来鉴定DNA中的错配(即，SNP)。也可以使用该分析来检测将影响给定蛋白/DNA复合物稳定性的蛋白(或药物)。
影响分析的参数。
F打开：20pN值是很好的选择，因为这确保了大量的珠将同时打开(其磁化强度和它们由此而来的力变化10至20％)。
T打开表现为与分子浓度相结合的重要参数：为观察阻断，必须使用根据下式推导出(lead to)P阻断实质值的两个参数的组合：
P阻断＝a(F).[1–exp(T打开.k开.[M])]。
如果想要测量k开，最好避免饱和的P阻断，以及调整[M]和T打开以达到范围为0.2至0.5的P阻断将确保最少的循环数以实现合理的统计。请注意，可以通过在获得的程序中调整参数而简单改变T打开，改变酶的浓度需要改变流室中的缓冲液。另一方面，如果不测量k开，则有必要使P阻断饱和，这将服从于(yield to)阻断的最佳统计。可通过分子浓度供应或不希望的结合而限制分子浓度，例如，在使用针对5mC的抗体研究中，在高浓度中这种酶结合到在其关闭状态的发夹的双链DNA以防止其展开。我们已经发现，将酶浓度限制到低于35nM以解决这个问题。在这些实验中，增加T打开是增加P阻断的唯一途径。
如图3和4所示，参数a(F)在原理上接近1，评估其值的最佳方法是直到P阻断逐渐达到a(F)时改变T打开或[M]进行饱和分析。或者，使用下列式估计a(F)：
a(F)＝exp(-T空载/T闭)
其中T空载是检测系统的空载时间(dead time)以及T闭为平均阻断时间。通常，T空载是0.1秒的量级。
F测试是非常重要的调整参数：其范围取决于所使用的发夹，但一般跨度为[12pN，2pN]。对于高于12pN的力，由于二级结构形成ssDNA，发夹的重新折叠表示已经存在一些阻断，这掩盖了感兴趣的信号。在力低时，DNA的伸展变得非常小而且噪音骤增。发夹叉的压力非常有效地推动分子进行去杂交，我们观察到的T闭＝T0exp F/F0；因此，随着F测试降低T闭下降非常快。例如，9nt寡核苷酸在约F测试＝11pN时会产生1秒阻断，在力低于9pN时很难看到阻断(a(F)变小)。对于12nt寡核苷酸，观察范围是[10pN，6pN]。对于37nt寡核苷酸，在6pN时阻断永远持续，但在F测试＝3pN时阻断下降到几秒钟。对于结合蛋白观察到相同的：结合越强且力越低之处观察到阻断。
我们调整F测试从而使阻断时间可测量(a(F)～1)但不会太长，这样T测试相对较短以便允许进行多循环。
在这种分析中，我们可以在0.2秒至20秒范围内测量T闭。可以使用更快的测量装置如快速摄像机观察到更短的时间，较长时间导致获取时间非常长，因为我们需要实现一些循环以进行分布的平均。对于寡核苷酸，T闭随F测试指数性变化；因此，我们可以通过调整F测试将T闭带至可用范围。对于蛋白，不知道T闭随着F测试的变化，但我们观察到减小F测试通常急剧减小T闭。然而，之前的T闭是未知的并且可以在大范围内变化。为了获知F测试的典型值，我们发现如图12A-12B所示，随着力在几秒钟内以斜坡的形式升高和降低，方便地先实现一系列的循环。阻断阶段的终点对应力Fc。Fc峰值的分布对应着这样的值，在此处T闭是斜坡持续时间的量级(order)。
然后，当循环在F测试比<FC>稍微大的力(F打开和F测试)中进入平台期(plateaus)时，可以进行循环以获得在可测量范围内的T闭。
T测试和N循环：T测试应比T闭大2或3倍。最后，循环数限定测量的整体精确度。为了获得X％的准确度，我们需要X/100＝1/N阻断 1/2comme P闭合＝N阻断/N循环；在N循环＝10000/(X2P阻断)。
改进分析：由于各种问题频繁出现，酶的结合可以呈现短的以及很长的事件(图9)；最后的情况将会导致在测试阶段结束以及新循环开始的起始时，这种阻断仍然是有活性的(图7)。由于阻断在打开阶段期间是隐藏的，延续连续循环的阻断是有可能的但未经证实的事件。为了避免这种尴尬的局面，有可能采取这样的事实，即阻断通常在力低时很短。因此，通过在测试后增加第三阶段，使用低的力时能够清理发夹任何结合的分子，当F清理＝0.5pN时T清理＝2秒，我们为下一循环去除任何结合的分子并制备干净的发夹。分子还可能存在几个结合位点，因此当在第一阻断之后分子又在第二结合位点进行阻断以及如此等等时，阻断信号将具有阶梯表观(图10)。对于第二阻断，有效打开阶段是T打开+T阻断1(图10)；如果T阻断1大于T打开，你更有可能在第一阻断弄乱动力学参数测量之后观察到第二阻断。所以最好使用与T测试相比更大的T打开以使这种影响最小化。
序列表
<110> 国家科学研究中心(CNRS)
巴黎高等师范学院
皮埃尔和玛利居里大学(巴黎第六大学)
<120> 通过单分子操作来检测DNA修饰和蛋白结合的方法
<130> 680468CG-650864
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 1
acagccagcc ga 12

Claims (21)

1.一种用于检测含有核酸序列的双链核酸分子中至少一个修饰碱基的方法，所述方法包括步骤：
a)提供由双链茎和单链环组成的核酸发夹分子，其中双链核酸的末端之一直接或间接地附着到表面，并且双链核酸的另一个末端附着到可移动的表面，其中双链核酸未附着至表面的末端与另一末端共价或非共价相连；
b)施加力以使表面之一从另一个表面移开，从而产生变性的发夹分子；
c)使变性的发夹分子与能够特异性结合修饰碱基的蛋白接触；
d)在所述蛋白存在时降低力使发夹分子复性，
其中结合修饰碱基的蛋白引起发夹分子复性的短暂阻断，
e)检测由于发夹分子中蛋白与修饰碱基的结合导致的发夹分子复性的短暂阻断，以及其包括：
1)测量双链核酸分子附着至表面的两末端之间的距离z；
2)当所述双链核酸分子变性时，测量所述双链核酸分子附着至表面的两末端之间的距离z高；以及
3)比较z和z高；以及
f)通过确定短暂阻断的位置确定修饰碱基在双链核酸分子中的位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)中进一步提供与所述序列互补的单链核酸分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述单链核酸的长度包括3至50个核苷酸。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的力高于或等于15pN。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的力高于或等于17pN。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的力高于或等于18pN。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤d)中的力降低到少于或等于12pN。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤d)中的力降低到少于或等于11pN。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤d)中的力降低到少于或等于10pN。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中重复步骤a)至f)。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括测量阻断的持续时间。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其包括将阻断的持续时间与不存在蛋白时阻断的持续时间相比较的另一步骤。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括测序所述蛋白结合的核酸序列的步骤。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中可移动的表面是磁珠。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中力是拉力。
16.根据权利要求15所述的方法，其中力是磁力。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少一个修饰碱基选自表观遗传修饰、错配或SNP。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中修饰碱基选自4-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶、5-羰基胞嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶和N6-甲基腺苷。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白是抗体或能够结合所述修饰碱基的酶。
20.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白选自MutS二聚体、Msh2/Msh6异二聚体和Msh2/Msh3异二聚体。
21.根据权利要求2所述的方法，其中在双链核酸分子所含有的序列中检测SNP包括步骤：
a)将所述变性的发夹分子与含有在大多数群体中发现的序列的单链核酸杂交；以及
b)通过权利要求2所述的方法检测所得的错配。
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