JP2016507744A - 単一分子の操作によるdna修飾およびタンパク質結合の検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、物理的操作によって核酸分子に対するタンパク質の結合を判定するための方法に関する。
1)単一の核酸分子に対する、単一のタンパク質またはタンパク質複合体分子の検出に基づくことから高感度であること。単一分子を使用することで、タンパク質がその核酸標的を見つけるのに必要な時間およびそれがその標的上に留まる時間だけでなく、その結合事象の正確な位置も測定することができる。
2)高価な標識ヌクレオチド(蛍光団または何らかの他の基を有する)を使用しないこと。
3)二本鎖核酸分子の二末端間の距離を測定することにより、二本鎖核酸上のタンパク質結合部位の正確な位置(bp単位)を測定可能なこと。
4)秒単位で周期的に測定を繰り返すことができるので、偽陽性が排除され、統計値が改善され、装置のドリフトが有意に軽減されること。
5)同じ分子で実験を何回も繰り返すことができるので、統計値および測定の信頼性が改善されること。
6)いずれの核酸結合タンパク質の検出も可能であること。従って、核酸の構造的修飾を特異的に認識するタンパク質が同定でき、その構造的修飾の部位が検出できる。
・二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;および
・前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
a)前記配列を含んでなる前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)前記タンパク質を準備する工程;
c)前記タンパク質の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程;および
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
a)特定の配列を含んでなる二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)前記タンパク質と前記核酸配列に対応する一本鎖核酸分子を準備する工程;
c)前記タンパク質と前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程;および
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる。
a)ある核酸配列を含んでなる二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)前記タンパク質を準備する工程;
c)前記タンパク質の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程;
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程;および
e)前記二本鎖核酸分子上の前記遮断の位置を決定する工程
を含んでなる方法を提供する。
a)前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)タンパク質と、場合により一本鎖核酸分子を準備する工程;
c)前記タンパク質と、場合により前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程;
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程;および
e)停止の持続時間を決定する工程
を含んでなる。
a)前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)タンパク質と、場合により一本鎖核酸分子を準備する工程;
c)前記タンパク質と、場合により前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程;
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程;
e)停止の持続時間を決定する工程;および
f)タンパク質の不在下での持続時間と比較する工程
を含んでなる。
a)前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)前記タンパク質と、場合により前記二本鎖核酸分子の少なくとも一部に相補的な一本鎖核酸分子を準備する工程;
c)前記タンパク質と、場合により前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程;
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程;および
e)前記タンパク質が結合した核酸配列の配列を決定する工程
を含んでなる。
a)前記核酸配列に対応する二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)一本鎖核酸分子を準備する工程;
c)前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程;および
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる。
a)二本鎖核酸分子の集団を準備する工程;
b)前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、上記の方法によって試験する工程;および
c)前記タンパク質と結合し得る核酸分子を選択する工程
を含んでなる方法を提供する。
a)二本鎖核酸分子の集団を準備する工程;
b)前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
c)前記タンパク質と前記結合部位に相補的な一本鎖核酸分子を準備する工程;
d)前記タンパク質と前記一本鎖核酸分子の存在下で、前記二本鎖核酸分子を復元する工程;
e)前記二本鎖核酸の復元の遮断の有無を検出する工程;および
f)復元が一時的または恒久的に遮断される核酸分子を選択する工程
を含んでなる。
a)前記二本鎖核酸を準備する工程;
b)前記修飾塩基と結合し得るタンパク質を準備する工程;および
c)前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を上記の方法によって試験する工程
を含んでなる方法を提供する。
a)前記二本鎖核酸分子を準備する工程;
b)ミスマッチ塩基と結合し得るタンパク質を準備する工程;および
c)前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、上記の方法によって試験する工程
を含んでなる方法を提供することも本発明の一態様である。
a)前記核酸を、その集団の大多数に見られる配列を含んでなる一本鎖核酸とハイブリダイズさせる工程;および
b)生じたミスマッチを、上記の方法によって検出する工程
を含んでなる方法に関する。
a)前記タンパク質と、前記結合部位に対応する配列を含んでなる核酸分子とを準備する工程;
b)化合物を準備する工程;および
c)前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、上記の方法によって試験する工程
を含んでなる方法に関する。
発明の背景
DNAに対するタンパク質の結合は、生物学において主要な現象であり、それは多くの反応を制御する極めて一般的なプロセスである。この機構の熱力学的平衡特性は周知であり、その動態の測定は、より困難な課題である。単一分子を使用することで、タンパク質がそのDNA標的を見つけるのに必要な時間だけでなく、その結合事象の正確な位置も測定することができる。本発明者らは、ここで、これらの目標を達成する新規な単一分子アッセイを記載する。
本発明は、DNAヘアピンの再ハイブリダイゼーションの中断の機械的検出に基づく、多様なDNA修飾およびDNA−タンパク質結合事象の検出のための新規な方法に関する。このアッセイは、単一分子の結合の統計情報を提供する一連のサイクルに頼るものである。一サイクルとしては、単一のDNAヘアピンが、約16pNより大きな力Fopenでその末端を引っ張ることによって時間Topen中にフォールディングを解除される、開放段階で始まる。第2の試験段階では、Ttestを持続して、張力Ftestを約11pNより小さくすると、ヘアピンを再閉することができる。溶液中に存在する分子が特定の配列に結合できるか、または開いたヘアピン上に非特異的に結合(例えば、修飾できればされたまたは修飾されていない特定の一本鎖または二本鎖配列を認識することができるタンパク質)、それは確率PblockでそのDNAと結合し、そうなれば、力が約11pNより小さくなった際にその再閉を一時的に遮断する。この中断は、ヘアピンの再ハイブリダイゼーション中に特定の位置で生じる停止として容易に検出でき、3つのパラメーターをもたらす:
・伸長したDNA上のこの停止の位置Zblockは、認識される配列に特徴的である
・遮断の持続時間Toffは、分子がDNAとの結合を維持していた時間を特徴付ける;および
・分子がその結合部位を見つけるのに必要な時間Tonに関する遮断確率Pblock。
数百〜数千塩基対の間の大きさの二本鎖(ds)DNA断片(例えば、ゲノムDNAの機械的剪断または制限酵素切断から得られる)を、その一方の末端でDNAループと連結する。その他方の末端はdsDNA断片と連結することで、その2本の鎖を異なるコーティング表面に結合させることが可能となる。例えば、一方の鎖の遊離3’末端をビオチンで標識してストレプトアビジンコーティングビーズへの結合を可能とし、反対の鎖の5’末端をジゴキシゲニンで標識して抗Dig抗体でコーティングした表面へのその結合を可能とする。この末端標識は、ビオチン(またはdig)修飾ヌクレオチドを付加するための末端トランスフェラーゼの使用または適宜標識したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションなどの、当業者に知られている様々な方法によって行うことができる。
DNAヘアピンが機械的に開かれる場合にオリゴヌクレオチド(ヌクレオチド数個よりも長いもの)が溶液中に存在すれば、これらのオリゴヌクレオチドは、力が11pNより小さくなった際に、DNA上のそれらの相補配列と対合して、ヘアピンの完全な再閉を一時的に妨げることができる(図1b参照)。同じ分子で一連の複数回の開/再閉サイクルを行い、オリゴヌクレオチドと開状態のDNAとの対合による、再閉時の遮断(停止)を検出することが容易にできる。
kon=−Log(1−Pblock/a(F))/([M]Topen)
kd −1=−(Toff Log(1−Pblock/a(F))/([M]Topen)
ヘリカーゼは、dsDNAをほどくためにssDNAギャップに結合する。これらの酵素の活性は、ssDNAに対するその親和性に直接的に依存する。本発明者らは、ここで、このパラメーターを直接的に、またはアッセイを用いて測定することを提案する。これはATPもしくはADPもしくは他の類似体を用いて、または用いずに行うことができる。本発明者らは、ここに、ATPを用いない場合の、大腸菌由来RecQヘリカーゼに関するいくつかの結果を示す。典型的な結合シグナルは図7に見て取ることができ、これにより、あるヘリカーゼ濃度に対してPblockを測定することが可能となる。[RecQ]に対するPblockの推移を図8に示す。[RecQ]の特性濃度が226pMに相当することが見て取れる。図9では、ヘリカーゼが非特異的に結合することが見て取れる。最後に、この酵素による遮断はズレ挙動(slippage behavior)を示し、Zの位置は、本当は一定ではなく、複数の工程によって小さくなる。この挙動を伴うと、Toffの真の値を定義することは難しいことから、本発明者らは、Tonとkonを測定することしかできない。
図11:5mCに対する抗体による遮断時間のヒストグラム。大部分の遮断は短く、1.3秒を特性時間とする指数分布に合理的によく適合し得る。しかしながら、17.5%という遮断の実質的数字は30秒を超える。この条件では、酵素のToffを決定することはあまり容易ではなく、本発明者らは、2つの異なる結合機構が競合し、一方が他方よりも強くなっていると考えている。
Fopen:20pNの値は、これが多数のビーズが同時に開くことを保証するので良好な選択肢である(それらの磁化、従ってそれらの力は10〜20%変動する)。
Pblock=a(F).[1−exp(Topen.kon.[M])]
に従い、Pblockの実質的値が得られる。
a(F)=exp(−Tdead/Toff)
(式中、Tdeadは、この検出系のデッドタイムであり、Toffは、平均遮断時間である)
を用いてa(F)を評価することもできる。一般に、Tdeadは0.1秒程度である。
Claims (25)
- ある核酸配列を含んでなる核酸分子に対するタンパク質の結合を判定するための方法であって、
a)ある核酸配列を含んでなる二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)前記タンパク質を準備する工程;
c)前記タンパク質の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程;
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程;および
e)前記二本鎖核酸分子上の前記遮断の位置を決定する工程
を含んでなる、方法。 - 工程b)において前記配列に対応する一本鎖核酸分子がさらに準備される、請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸分子がヘアピンである、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸の一方の鎖における少なくとも1個の塩基が直接的または間接的に表面に結合され、前記二本鎖核酸の他方の鎖における少なくとも1個の塩基が可動表面に結合されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸が、工程a)において、支持体同士を引き離すことによって変性される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 支持体を引き離すことによって前記二本鎖分子に15pN以上、好ましくは17pN以上、より好ましくは18pN以上の物理的力がかけられる、請求項5に記載の方法。
- 前記変性二本鎖核酸が、工程c)において前記支持体同士を近づけることによって復元される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二本鎖分子にかけられる力が、前記支持体同士を近づけることによって12pN以下、好ましくは11pN以下、より好ましくは10pN以下に低減される、請求項7に記載の方法。
- 支持体に結合されていない二本鎖核酸の末端が共有結合的にまたは非共有結合的に互いに連結される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)〜d)が数回繰り返される(測定値を蓄積し、シグナル/ノイズ比を高めるために)、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 工程d)の検出が、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離(z)を測定することを含んでなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸分子が変性された際に、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離(zhight)を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項11に記載の方法。
- 工程e)がzとzhighを比較する前工程をさらに含んでなる、請求項12に記載の方法。
- 遮断の持続時間を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遮断の持続時間を参照値と比較するさらなる工程を含んでなる、請求項14に記載の方法。
- 前記タンパク質が結合した核酸配列を決定する工程をさらに含んでなる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 特定の核酸結合タンパク質と結合し得る配列を含んでなる核酸分子を同定するための方法であって、
a)二本鎖核酸分子の集団を準備する工程;
b)前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によって試験する工程;および
c)前記タンパク質と結合し得る核酸分子を選択する工程
を含んでなる、方法。 - 二本鎖核酸分子内に含まれる少なくとも1つの修飾塩基を検出するための方法であって、
a)前記二本鎖核酸を準備する工程;
b)前記修飾塩基と結合し得るタンパク質を準備する工程;および
c)前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によって試験する工程
を含んでなる、方法。 - 修飾塩基が4−メチルシトシン(4mC)、5−メチルシトシン(5mC)、5−ヒドロキシメチルシトシン(5hmC)、5−ホルミルシトシン(5fC)、5−カルボキシルシトシン(5caC)、5−ヒドロキシメチルウラシル(5hmU)、およびN6−メチルアデノシン(m6A)からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記修飾塩基が5mCである、請求項18または19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、前記修飾塩基と結合し得る抗体である、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖核酸分子中の少なくとも1つのミスマッチを検出するための方法であって、
a)前記二本鎖核酸分子を準備する工程;
b)ミスマッチ塩基と結合し得るタンパク質を準備する工程;および
c)前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によって試験する工程
を含んでなる、方法。 - 前記タンパク質がMutSダイマー、Msh2/Msh6(MutSα)、およびMsh2/Msh3(MutSβ)からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 核酸分子に含まれる配列中のSNPを検出するための方法であって、
a)前記核酸を、その集団の大多数に見られる配列を含んでなる一本鎖核酸とハイブリダイズさせる工程;および
b)生じたミスマッチを、請求項22または23のいずれか一項に記載の方法によって検出する工程
を含んでなる、方法。 - タンパク質とその結合部位の間の相互作用を妨げ得る少なくとも1つの化合物を同定するための方法であって、
a)前記タンパク質と、前記結合部位に対応する配列を含んでなる核酸分子とを準備する工程;
b)化合物を準備する工程;および
c)前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法によって試験する工程
を含んでなる、方法。
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