ES2689676T3

ES2689676T3 - Procedimiento para la detección de modificaciones de ADN por manipulación de una sola molécula

Info

Publication number: ES2689676T3
Application number: ES14701960.8T
Authority: ES
Inventors: David Bensimon; Vincent Croquette; Harold GOUET; Jean-François Allemand; Fang-Yuan Ding
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Normale Superieure; Sorbonne Universite
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Normale Superieure; Sorbonne Universite
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2018-11-15
Anticipated expiration: 2034-01-22
Also published as: CA2898151A1; AU2014209942A1; DK2948774T3; CN108588208B; CA2898151C; RU2678996C2; EP2948774A1; HK1215602A1; RU2015132798A; CN108588208A; KR20160003629A; SG11201505618XA; KR102022427B1; AU2014209942B2; LT2948774T; JP2016507744A; CN105122063A; EP2948774B1; IL239926A0; IL239926B

Abstract

Método para detectar por lo menos una base modificada en una molécula de ácido nucleico bicatenario que comprende una secuencia de ácido nucleico, en el que dicha molécula de ácido nucleico bicatenario es una horquilla, y en el que uno de los extremos del ácido nucleico bicatenario está unido directa o indirectamente a un soporte, y en el que el otro extremo del ácido nucleico bicatenario está unido a un soporte móvil, comprendiendo dicho método las etapas de: a) desnaturalizar dicha molécula de ácido nucleico bicatenario que comprende una secuencia de ácido nucleico aplicando una fuerza física a dicha molécula; b) proporcionar una proteína apta para unirse a dicha base modificada; c) renaturalizar dicha molécula de ácido nucleico bicatenario en presencia de dicha proteína; d) detectar un bloqueo de la renaturalización del ácido nucleico bicatenario; y e) determinar la posición de dicho bloqueo en dicha molécula de ácido nucleico bicatenario, comprendiendo dicha determinación las etapas de: - medir la distancia (z) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están unidos al soporte; - medir la distancia (zelevada) entre los dos extremos de la molécula de ácido nucleico bicatenario que están unidos al soporte, cuando dicha molécula de ácido nucleico bicatenario se desnaturaliza; y - comparar z y zelevada.

Description

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Este ejemplo es particularmente ventajoso debido a que permite la determinación de la unión de dicha proteína a la secuencia comprendida dentro del ácido nucleico bicatenario.

En una configuración típica, las moléculas de ácido nucleico bicatenario se pueden anclar específicamente en dos sustratos sólidos (por ejemplo, portaobjetos de microscopio, micropipeta, micropartícula). Uno de los extremos se puede unir directa o indirectamente a la superficie, mientras que el otro extremo se une directa o indirectamente a una superficie móvil. En este ejemplo, se aplica una tensión en ambos extremos del ácido nucleico bicatenario cuando los soportes se alejan. Cuando la tensión es mayor que un valor umbral, las dos hebras se separan y la molécula de ácido nucleico se desnaturaliza. La tensión aplicada está preferentemente por encima de o es igual a 15 pN; más preferentemente, está por encima o es igual a 16 pN; incluso más preferentemente, está por encima o es igual a 17 pN; en un aspecto mucho más preferido, está por encima o es igual a 18 pN. Esta fuerza puede variar con la temperatura, el tipo de nucleótido y amortiguador, pero el experto en la materia adaptará fácilmente dicha fuerza con respecto a estos parámetros a fin de obtener la separación de las dos hebras. Por otro lado, cuando se disminuye la tensión por debajo de un valor mínimo, las dos hebras del ácido nucleico bicatenario desnaturalizado se pueden volver a hibridar. Para obtener una rehibridación de las mencionadas dos hebras, preferentemente se aplica una tensión menor o igual a 12 pN; más preferentemente, es menor o igual a 11 pN; incluso más preferentemente, es menor o igual a 10 pN.

Lo más preferible, el ácido nucleico bicatenario es una horquilla. Como se usa en la presente memoria, “horquilla” significa una hélice doble en la que el extremo 5’ de una hebra está enlazado físicamente al extremo 3’ de la otra hebra a través de un bucle desemparejado. El mencionado enlace físico puede ser covalente o no covalente. Preferentemente, el mencionado enlace físico es un enlace covalente. De este modo, una horquilla consiste en un tallo bicatenario y un bucle monocatenario desemparejado. En una horquilla, los extremos de las dos hebras que no están acoplados en el bucle están libres, y de este modo se pueden separar. Esto da como resultado el desemparejamiento del ácido nucleico bicatenario, produciendo así una molécula de ácido nucleico bicatenario desnaturalizada. Es posible abrir completamente una molécula de ácido nucleico bicatenario de horquilla al tirar en cada extremo de dicha molécula de ácido nucleico con una fuerza mayor que un valor umbral. Cuando la tensión aplicada a la molécula se disminuye hasta menos de un valor mínimo, la molécula de ácido nucleico se vuelve a hibridar para volver a formar una horquilla. La presencia de una proteína unida a dicha molécula de ácido nucleico desnaturalizado (por ejemplo, ADNmc) conduce a una pausa en la rehibridación. Igualmente, la presencia de una molécula de ácido nucleico bicatenario hibridada a una de las hebras del ácido nucleico de la horquilla abierta conduce a una pausa en la rehibridación, modificándose la duración de dicha pausa (es decir, incrementándose o disminuyéndose) cuando una proteína de unión a ácido nucleico bicatenario se une al complejo. Por lo tanto, la detección de un cambio en la duración de tal pausa indica que una proteína está unida a por lo menos parte del tallo bicatenario.

A este respecto, es ventajoso diseñar la secuencia y longitud del bucle de manera que la horquilla se vuelva a plegar después de una transición corta, por ejemplo 1 segundo. Los métodos de este efecto se han descrito en la técnica anterior, por ejemplo en Woodside et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103 (16): 6190-6195, 2006). Cuando la fuerza se disminuye desde el valor de apertura hasta el valor de ensayo, la extensión de la horquilla abierta varía debido a la elasticidad del ADN monocatenario. El pequeño retraso antes de que la horquilla se vuelva a plegar permite al usuario determinar la extensión de la horquilla a la misma fuerza que la usada para detectar el estado de bloqueo.

El uso de una horquilla hace posible, en particular, llevar a cabo ciclos de apareamiento y desemparejamiento, y de este modo mejorar la relación señal/ruido.

Las técnicas que permiten que los extremos libres del ácido nucleico bicatenario se unan juntos son conocidas, y algunas se describirán con mayor detalle en lo siguiente.

Por determinación del bloqueo, se quiere decir en la presente memoria la determinación de los parámetros físicos asociados con el bloqueo. Un parámetro útil es la posición del bloqueo en la molécula de ácido nucleico bicatenario, correspondiendo dicha posición a la posición de unión de la proteína a la molécula de ácido nucleico bicatenario abierta, o a la hibridación de la molécula de ácido nucleico bicatenario en dicha molécula de ácido nucleico bicatenario abierta. De hecho, se ha encontrado que la posición en el ácido nucleico bicatenario en la que se produce la pausa en la renaturalización se puede determinar de forma precisa: el uso de una horquilla da a la persona un medio para determinar la distancia física entre los dos extremos libres de la horquilla en cualquier momento durante el proceso de desnaturalización/renaturalización.

De este modo, según la presente invención, es particularmente ventajoso que el mencionado método comprenda una etapa adicional de determinar la posición del bloqueo.

Según este ejemplo, se proporciona un método para la determinación de la unión de una proteína a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de:

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Cuando el bloqueo está causado por la hibridación entre el ácido nucleico bicatenario desnaturalizado y el ácido nucleico monocatenario complementario, la duración del bloqueo depende del grado de complementariedad entre las dos secuencias. Cuanto mayor es la complementariedad, mayor es el número de enlaces establecidos entre las dos moléculas, y por lo tanto mayor es la duración. También está claro que el tiempo de bloqueo dependerá de la longitud de la región de complementariedad entre las dos secuencias. Cuanto mayor sea la región, mayor es el número de enlaces establecidos entre las dos moléculas, y por lo tanto mayor es la duración. Por lo tanto, es concebible fácilmente que en ciertas condiciones la duración de la pausa de renaturalización será casi permanente. En particular, cuando el ácido nucleico monocatenario comprende más de 20, preferentemente más de 25, incluso más preferentemente más de 30 nucleótidos aptos para hibridarse con el ácido nucleico bicatenario desnaturalizado, el ácido nucleico monocatenario permanece hibridado a la horquilla bicatenaria (durante muchos minutos) incluso cuando la fuerza aplicada al mencionado ácido nucleico bicatenario se disminuye hasta Fensayo, previniendo de este modo la autorrehibridación de dicha horquilla bicatenaria. En tal caso, puede ser ventajoso usar una enzima para eyectar la molécula de ácido nucleico monocatenario o añadir una tercera fase en la que la fuerza se reduce hasta 0,5 o 1 pN durante unos pocos segundos que expele eficientemente oligonucleótidos hibridados. La eyección de dicha molécula de ácido nucleico monocatenario hace posible de este modo llevar a cabo ciclos de apareamiento y desemparejamiento, y mejorar de este modo la relación de señal/ruido.

La duración de la pausa también puede variar con las condiciones de la reacción. Dicha duración disminuirá a medida que aumenta la temperatura. Igualmente, las condiciones del amortiguador también pueden modular la duración de la pausa: por ejemplo, magnesio, betaína y cloruro de tetrametilamonio (TMAC usado a concentración molar) aumentan el tiempo de bloqueo. Estos compuestos refuerzan pares AT más que GC, reduciendo así la diferencia en la fortaleza entre estos pares. Sin embargo, cuando se fija la temperatura y el amortiguador, la duración de la pausa dependerá solamente de la fuerza que tira del ácido nucleico bicatenario desnaturalizado, y de su complementariedad con el ácido nucleico monocatenario. De hecho, los inventores han mostrado que el tiempo de bloqueo disminuye exponencialmente a medida que se reduce la fuerza.

Finalmente, la duración de la pausa también dependerá de las propiedades del complejo formado entre la proteína, el ácido nucleico bicatenario desnaturalizado y el ácido nucleico monocatenario complementario. La presencia de la proteína de unión a ácido nucleico bicatenario puede estabilizar el complejo. Cuanto mayor es su afinidad por el ácido nucleico bicatenario, más prolongada parece la pausa. También es posible que la proteína desestabilice el ácido nucleico bicatenario (como es el caso, por ejemplo, para el complejo abierto de una ARNpolimerasa), conduciendo a una pausa más corta.

Igualmente, la presencia de una proteína apta para unirse al ácido nucleico bicatenario desnaturalizado bloqueará transitoriamente la renaturalización de dicha molécula de ácido nucleico. La duración de este bloqueo también dependerá de la afinidad de la proteína por el ácido nucleico. Está claro que una proteína con una afinidad elevada por dicha molécula conducirá a una pausa más prolongada que una proteína con una afinidad más débil.

El experto en la materia apreciará inmediatamente de que la medida de la pausa permite la determinación del tiempo medio de bloqueo, y por tanto de los parámetros cinéticos de la reacción de unión, como se explica en la sección experimental.

De este modo, en un aspecto particular, el método comprende las etapas de:

a) desnaturalizar dicha molécula de ácido nucleico bicatenario aplicando una fuerza física a dicha molécula;

b) proporcionar una proteína y, opcionalmente, una molécula de ácido nucleico monocatenario,

c) renaturalizar la molécula de ácido nucleico bicatenario en presencia de dicha proteína y, opcionalmente, de dicha molécula de ácido nucleico monocatenario; y

d) detectar un bloqueo de la renaturalización de dicha molécula de ácido nucleico bicatenario, y

e) determinar la duración de la pausa.

Preferentemente, el mencionado método comprende la etapa adicional de determinar la posición del bloqueo.

En este ejemplo, la duración de la pausa se puede comparar con un control. En particular, cuando dicha proteína es una proteína de unión a ácido nucleico bicatenario, puede ser ventajoso comparar dicha pausa con una pausa medida cuando el método se lleva a cabo en ausencia de la proteína. Como se explica anteriormente, la unión de la proteína al complejo formado entre el ácido nucleico bicatenario desnaturalizado y el ácido nucleico monocatenario complementario altera la duración del bloqueo de la renaturalización. Dicho bloqueo se traslada como un incremento, o disminución (dependiendo de la proteína específica), en la duración de la pausa.

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superficie, la molécula se puede abrir. En este estado abierto, se puede hibridar con ácidos nucleicos monocatenarios complementarios, que bloquean transitoriamente el cierre de nuevo de la horquilla cuando se reduce la fuerza de estirado. Midiendo la distancia desde la superficie a la perla de una horquilla bloqueada, se puede determinar la posición del híbrido a lo largo de la molécula con una precisión de casi una única base, estableciendo por tanto cuál es la secuencia local (el complemento de la secuencia de los ácidos nucleicos monocatenarios conocidos en disolución). De este modo es posible secuenciar directamente la molécula unida por dicha proteína, sin alterar el montaje del experimento, sustituyendo solamente el amortiguador que contiene la proteína, y opcionalmente un ácido nucleico monocatenario complementario, por un amortiguador adecuado para la secuenciación según los mencionados métodos.

La identificación eficiente de elementos reguladores en cis del ADN es un reto importante de la biología postgenómica. La identificación de todos los sitios de unión de una proteína de unión a ácido nucleico específica en el genoma es particularmente útil, puesto que identifica todos los genes cuya expresión está regulada potencialmente por dicha proteína. La identificación completa de los elementos cis-reguladores del ADN es crucial para una comprensión predictiva de la dinámica de la red transcripcional.

La confluencia de datos de secuencias del ADN del genoma completo, tecnologías de alto rendimiento, y nuevos algoritmos está fomentando nuestra capacidad para identificar y caracterizar elementos reguladores transcripcionales (Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 14863-14868, 1998; Tavazoie et al., Nat. Genet., 22: 281-285, 1999; Bussemaker et al., Nat. Genet., 27: 167-171, 2001; Lee et al., Science, 298: 799-804, 2002). Sin embargo, estos enfoques tienen limitaciones inherentes. Por ejemplo, el éxito de métodos híbridos que usan agrupamiento de la expresión génica y el descubrimiento de motivos reguladores en cis está limitado por el intervalo de perturbaciones fisiológicas usadas en el laboratorio. Lo mismo es cierto para enfoques in vivo, tales como la inmunoprecipitación con cromatina a base de chip (ChIP), en la que las interacciones ADN-proteína, en virtud de su papel regulador, solo se producen en condiciones medioambientales específicas (Lee et al., Science,

298: 799-804, 2002). Estas limitaciones son incluso más severas para eucariotas metazoicas, en las que los datos experimentales son más difíciles de adquirir.

El presente método ofrece una alternativa a los métodos de la técnica anterior, tales como ChIP (inmunoprecipitación cromosómica) y obtención de la huella de ADNasa I para cartografiar las localizaciones de la unión en el genoma de factores de transcripción (The ENCODE Project Consortium, Nature, 489: 57-74, 2012).

De este modo, según otro aspecto, se describe en la presente memoria un método para identificar moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia apta para unirse a una proteína de unión a ácido nucleico específica, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar una población de moléculas de ácido nucleico bicatenario;

b) evaluar la unión de dicha proteína a dicha molécula de ácido nucleico mediante el método descrito anteriormente; y

c) seleccionar las moléculas de ácido nucleico aptas para unirse a dicha proteína.

Preferentemente, el método implica la provisión de un ácido nucleico monocatenario complementario al sitio de unión de dicha molécula de ácido nucleico.

Según este ejemplo, el método comprende de este modo las etapas de:

a) proporcionar una población de moléculas de ácido nucleico bicatenario;

b) desnaturalizar dicha molécula de ácido nucleico bicatenario aplicando una fuerza física a dicha molécula;

c) proporcionar dicha proteína y una molécula de ácido nucleico monocatenario complementaria al mencionado sitio de unión;

d) renaturalizar dicha molécula de ácido nucleico bicatenario en presencia de dicha proteína y dicha molécula de ácido nucleico monocatenario; y

e) detectar o no un bloqueo de la renaturalización del ácido nucleico bicatenario; y

f) seleccionar las moléculas de ácido nucleico en las que la renaturalización está transitoria o permanentemente bloqueada.

Ventajosamente, el mencionado método comprende la etapa adicional de determinar la posición del bloqueo.

Las moléculas de ácido nucleico a aislar de este modo corresponden a una población de moléculas de ácido

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a) proporcionar el mencionado ácido nucleico bicatenario;

b) proporcionar una proteína apta para unirse a dicha base modificada; y

c) evaluar la unión de dicha proteína a dicha molécula de ácido nucleico mediante el método descrito anteriormente.

Opcionalmente, el método puede comprender una etapa adicional de evaluar la hibridación de un simple oligonucleótido que reconoce el sitio de posible modificación, para validar mejor los resultados. Por ejemplo, tras detectar la metilación de 5mC con su anticuerpo, se puede detectar la secuencia ATGC con un oligo NNTACGNN.

Este método es particularmente ventajoso, debido a que usa en un proceso reversible moléculas de unión no modificadas. Por ejemplo, cuando se usan para detectar 5mC, no se requiere ninguna reacción química (bisulfato de sodio) en el ADN. Además, el método de la invención es mucho más sensible que cualquiera de los métodos de la técnica anterior, puesto que permite la detección de una base modificada sobre la base de una sola molécula.

En una forma de realización preferida, la base modificada se selecciona de entre el grupo constituido por 5metilcitosina (5mC), 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formilcitosina (5fC), 5-carboxilcitosina (5caC), 5hidroximetiluracilo (5hmU), y N6-metiladenosina (m6A). En una forma de realización más preferida, dicha base se escoge entre 5mC y 5hmC. En una forma de realización incluso más preferida, dicha base es 5mC. Se han descrito proteínas que reconocen y se unen específicamente a estas bases modificadas. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra 5mC se han descrito y usado tiñendo esta modificación para visualización a base de células (Ito et al., Nature, 466: 1129-1133, 2010; Ko et al., Nature, 468: 839-843, 2010; Szulwach et al., Nature Neurosci, 14: 1607-1611, 2011; Haffner et al., Oncotarget, 2: 627-637, 2011; Inoue et al., Science, 334: 194, 2011; Inoue et al., Cell Res, 21: 1670-1676, 2011). Tales anticuerpos están comercialmente disponibles (por ejemplo clon 33D3; ref: 39649 de Active Motif). Aparte de los anticuerpos, se han identificado enzimas que reconocen y reaccionan específicamente con el nucleótido de interés (Song et al., Nature Biotechnol, 30(11): 1107-1116, 2012). Por ejemplo, la enzima -glucosiltransferasa (BGT) del bacteriófago T4 transfiere un resto de glucosa sobre 5hmC. Las proteínas Tet1-3 son responsables de la conversión de 5mC en 5hmC. La proteína 2 de unión a metil-CpG, (MeCP2), se identificó por primera vez mediante su afinidad por ADN que contiene 5mC. Preferentemente, dicha proteína es un anticuerpo dirigido contra dicha base modificada, o una enzima que reconoce específicamente dicha base. Más preferentemente, dicha proteína es un anticuerpo.

Resulta evidente que se podría aplicar el mismo método a la detección de otras modificaciones de ácidos nucleicos. Por ejemplo, es posible detectar un error de apareamiento presente en una molécula de ácido nucleico bicatenario. Se sabe desde hace mucho tiempo que las proteínas tales como la MutS bacteriana reconocen la base emparejada erróneamente en la hebra hija, y se unen al ADN mutado. Tal propiedad se puede poner en uso para detectar e identificar cualquier apareamiento erróneo en una molécula de ácido nucleico bicatenario.

Por lo tanto, también es un aspecto de la presente invención proporcionar un método para detectar por lo menos un apareamiento erróneo en un ácido nucleico bicatenario, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar el mencionado ácido nucleico bicatenario;

b) proporcionar una proteína apta para unirse a una base emparejada erróneamente; y

c) estudiar la unión de dicha proteína a dicha molécula de ácido nucleico mediante el método descrito anteriormente.

Puesto que se sabe que MutS se une como dímero a un apareamiento erróneo, es ventajoso usar un dímero de MutS en el método de la invención. En eucariotas, los homólogos de MutS forman dos heterodímeros principales: Msh2/Msh6 (MutS) y Msh2/Msh3 (MutS). Preferentemente, dicha proteína se selecciona entre un dímero de MutS, Msh2/Msh6 (MutS), y Msh2/Msh3 (MutS).

Un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, pronunciado snip; plural, snips) es una variación de secuencia de ADN que ocurre cuando un solo nucleótido – A, T, C o G – en el genoma (u otra secuencia compartida) difiere entre miembros de una especie biológica o cromosomas emparejados en un ser humano. De media, los SNPs ocurren en la población humana más de 1 por ciento de las veces. Debido a que solamente alrededor de 3 a 5 por ciento de una secuencia de ADN de una persona codifica la producción de proteínas, la mayoría de los SNPs se encuentran fuera de las secuencias codificantes. Los SNPs encontrados dentro de una secuencia codificante son de particular interés debido a que muy probablemente alteran la función biológica de una proteína.

Una molécula que comprende un SNP formará un apareamiento erróneo cuando se hibride con una molécula

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de la fase abierta Tabierta para a por un oligonucleótido de 12-nt para encontrar su sitio complementario. Un ajuste demuestra que Ton en el tiempo requerido para que la molécula encuentre su diana es típicamente 15 s cuando la concentración de oligonucleótido es 20 nM. Este tiempo no depende de la fuerza usada en la fase de ensayo. El parámetro a(F) sería igual a 1 si se detectasen todos los sucesos, pero puesto que se pierden sucesos cortos, a(F) es menor que 1, especialmente cuando Fensayo es pequeña.

Figura 4: La probabilidad de bloqueo aumenta y se satura con la concentración de oligonucleótido. en la presente memoria, un oligonucleótido de 12 nt, a una concentración de 27,5 nM, conduce a un bloqueo que sucede una vez cada dos ciclos para una fase abierta que dura 10 s y Fensayo = 8 pN. Como se puede observar en la figura 3, la saturación de Pbloqueo no alcanza suficientemente 1; esto es debido a que estamos perdiendo bloqueos muy cortos.

Figura 5: Parámetros cinéticos que definen la propiedad de unión de un oligonucleótido de 12 nts a su sustrato complementario como función de la fuerza iónica del amortiguador. koff varía poco con la fuerza iónica, mientras que kon presenta una fuerte dependencia. kon aumenta en un factor de 3 añadiendo Mg2+. La constante de equilibrio kd se puede calcular para ambos parámetros cinéticos.

Figura 6: Bloqueo de una horquilla por una primasa que estabiliza un oligonucleótido de ARN de 5 nt complementario a la secuencia de ADN cebadora. b) Posición del suceso de bloqueo a lo largo de la secuencia. c) Distribución del tiempo de bloqueo producido por la T4 primasa que estabiliza un oligonucleótido de ARN pentamérico en el proceso de cebado observado con Fensayo = 9 pN. El oligonucleótido de ARN de 5 nt no bloquea de manera visible el replegamiento de la horquilla. Con la T4 primasa WT, el bloqueo se produce en la posición esperada a lo largo de la secuencia, y el tiempo de bloqueo es 5 s. Con el mutante E248Q, observamos el mismo fenómeno, pero el tiempo de bloqueo se reduce significativamente.

Figura 7: Serie de ciclos que evalúan la unión de helicasa RecQ a ADNmc con tres fases: abierta en Fabierta = 20 pN, ensayo a Fensayo = 10 pN, y una fase de limpieza a Flimpieza = 0,5 pN. Se muestran 10 trazas, presentando unas pocas un suceso de bloqueo para un ciclo. La fase de limpieza a fuerza baja asegura que se elimine cualquier unión enzimática del molde. En ausencia de ATP, RecQ solamente se une y bloquea el replegamiento, la presión de la horquilla de replegamiento produce un deslizamiento de la helicasa, disminuyendo la posición de bloqueo por las etapas sucesivas.

Figura 8: Evolución de la probabilidad de bloqueo de RecQ frente a su concentración. Pbloqueo aumenta y se satura a medida que aumenta la concentración; esto define una concentración característica en la presente memoria de 226 pM.

Figura 9: Distribución de la posición de bloqueo de la helicasa RecQ sin ATP a lo largo del molde.

Figura 10: Señal bruta del bloqueo producida por el anticuerpo frente a la metilación de citosina a lo largo de una horquilla de ADN de 1,2 kb. Tres trazas presentan la extensión de las horquillas a lo largo de 5 ciclos. Cada ciclo comienza abriendo la horquilla durante 5,5 s con una fuerza de 20 pN, seguido de una fase de ensayo que dura 37 s a F = 6,5 pN.

La mayoría del tiempo, el ciclo no presenta bloqueo (1), una horquilla puede presentar bloqueo sucesivo durante el mismo ciclo (2), y el bloqueo se puede prolongar a lo largo de varios ciclos. [Ac] la concentración de anticuerpo es 35 nM, el amortiguador es Tris 100 mM con 0,2% de BSA para evitar la unión no específica.

Las trazas se han desplazado en y por claridad.

Figura 11: Histograma de la posición de metilación a lo largo de la secuencia de una horquilla de 1,2 kb después de que se ha metilado por una ADN metiltransferasa humana. Se presentan cuatro histogramas de diferentes perlas. Existe un consenso sobre las posiciones de unión; se observan las cuatro posiciones de unión esperadas con relación a la metilación eucariótica, así como aquella en 882, que corresponde a la metilación realizada por E. coli en la que se produjo originalmente el ADN.

Figura 12: Registro de 30 ciclos de cierre y apertura de la horquilla con una pendiente suave en la fuerza con 2 s hacia arriba y 2 s hacia abajo. Los puntos representativos en el ciclo giran en sentido contrario a las agujas del reloj (véanse las flechas) partiendo en F = 1,5 pN y Z = 0; a medida que aumenta la fuerza, la extensión permanece muy pequeña hasta que la fuerza alcanza 15 pN, en ese momento la molécula se abre y Z alcanza 1,3 m. Cuando la fuerza se disminuye con una pendiente, Z disminuye lentamente hasta F = 11 pN, en este punto la horquilla se vuelve a plegar hasta que golpea en el oligonucleótido de 12 nt. A medida que la fuerza continúa disminuyendo, también lo hace la Z del bloqueo, pero a medida que la fuerza disminuye alcanza pronto el punto en el que el oligonucleótido es expelido, como se puede observar por la rápida disminución en la marca de Z mediante un símbolo de diamante. La distribución de la fuerza que corresponde al desprendimiento del oligonucleótido se presenta a la derecha; su máximo, alrededor de 7 pN,

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corresponde a la fuerza a la que Toff es igual a una fracción de un segundo.

Figura 13: Detección de los sitios de metilación en un ADN humano obtenido a partir de células humanas. Se preparó un ADN de horquilla a partir de una molécula de ADN genómico humano de 2,5 kb. A) Variación de la fuerza aplicada a lo largo de los ciclos de medida: la horquilla se abre durante 5 segundos mediante una fuerza de 19 pN; la fuerza se reduce entonces hasta 8,5 pN durante 10 segundos. B) Superposición de las señales obtenidas en aprox. 20 ciclos en presencia de anticuerpos dirigidos contra 5mC, que muestra la apertura de cremallera de la molécula, seguido por su cierre nuevamente de la cremallera, interrumpido por bloqueos transitorios. Estos bloqueos están causados por la unión del anticuerpo a 5mC. C) Un histograma de las posiciones de bloqueo muestra posiciones bien definidas que corresponden a la presencia de 5mC. Existen aproximadamente 20 posiciones, lo que sugiere una metilación cada aprox. 100 bases.

Ejemplos experimentales

Antecedentes de la invención

La unión de proteína a ADN es un fenómeno importante en biología; es un proceso muy general que controla muchas reacciones. Aunque las propiedades de equilibrio termodinámico de este mecanismo son bien conocidas, la medida de su cinética es un problema más desafiante. El uso de moléculas individuales ofrece la capacidad de medir el tiempo requerido para que una proteína encuentre su diana de ADN, pero también la localización exacta del suceso de unión. Describimos en la presente memoria un nuevo ensayo de una sola molécula que logra estas metas.

Aunque el ensayo es amplio, ilustramos en primer lugar su aplicabilidad a la unión de un oligonucleótido específico, y a la unión no específica de una helicasa a un ADNmc. Finalmente, explicamos la unión específica de un anticuerpo que reconoce sitios metilados en el ADN.

Sumario

Este método se refiere a un nuevo procedimiento para la detección de una amplia variedad de modificaciones del ADN y sucesos de unión de proteína a ADN, que se basa en la detección mecánica de la obstrucción de la rehibridación de una horquilla de ADN. El ensayo se basa en una serie de ciclos que proporcionan información estadística de la unión de una sola molécula. Durante un ciclo, se comienza mediante una fase de apertura de la cremallera, en la que una única horquilla de ADN se despliega durante un tiempo Tabierta tirando de sus extremos con una fuerza Fabierta mayor que alrededor de 16 pN. En una segunda fase de ensayo, que dura Tensayo, la tensión Fensayo se reduce por debajo de hasta alrededor de 11 pN, que permite que la horquilla vuelva a cerrar la cremallera. Si una molécula presente en disolución se puede unir a una secuencia definida, o no específicamente, en la horquilla abierta (por ejemplo, una proteína apta para reconocer una secuencia específica mono-o bicatenaria, modificada o no), se unirá al ADN con una probabilidad Pbloqueo y, en ese caso, bloqueará transitoriamente el cierre nuevamente de la cremallera cuando la fuerza se reduce por debajo de alrededor de 11 pN. Esta obstrucción es fácilmente detectable como una pausa que ocurre en una posición definida durante la rehibridación de la horquilla, que conduce a tres parámetros:

 la posición Zbloqueo de esta pausa a lo largo del ADN estirado es característica de la secuencia que se reconoce;

 la duración del bloqueo Toff caracteriza el tiempo durante el cual la molécula ha permanecido unida a ADN; y

 la probabilidad del bloqueo Pbloqueo, que está relacionado con el tiempo Ton requerido para que la molécula encuentre su sitio de unión.

Ton y Toff son ambos característicos de la fuerza de la interacción entre el ADN y la molécula que bloquea. De este modo, sondando una secuencia de ADN (unida como una horquilla a una perla en un extremo y a una superficie en el otro) con una proteína o anticuerpo que reconoce la metilación, se puede identificar mediante ciclos repetidos de apertura y cierre de la horquilla la presencia del sitio de metilación sondado (vía la presencia de un bloqueo de algunas de las horquillas durante la rehibridación). De forma similar, se puede medir la unión de una proteína a un sitio de ADNbc putativo midiendo el incremento en la estabilidad del híbrido entre un oligonucleótido complementario en presencia frente a la ausencia de la proteína.

Este método permite la detección de modificaciones del ADN en ADN genómico sin pasar a través de la reacción del bisulfito y etapas de amplificación mediante PCR. Requiere algún procesamiento previo del ADN, necesario para procesarlo en fragmentos de horquilla que se pueden usar para unir perlas a una superficie (fragmentación y ligación con fragmentos adecuados). La presente invención no requiere marcaje fluorescente de las proteínas o del ADN. En su presente forma de realización, la técnica necesita un (microscopio) óptico para detectar el bloqueo de la horquilla durante la rehibridación.

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Descripción técnica detallada

Un fragmento de ADN bicatenario (bc) de un tamaño comprendido entre unas pocas decenas y unos pocos millares de pares de bases (obtenido, por ejemplo, a partir de cizallamiento mecánico o cortes de restricción de ADN genómico) se liga a uno de los extremos de un bucle de ADN. Sus otros extremos se ligan a un fragmento de ADNbc que permite la unión de sus dos hebras a superficies revestidas diferentemente. Por ejemplo, el extremo 3’ libre de una hebra se puede marcar con biotina, que permite la unión a perlas revestidas con estreptavidina, mientras que el extremo 5’ en la hebra opuesta se puede marcar con digoxigenina, que permite su unión a superficies revestidas con un anticuerpo anti-Dig. Este marcaje de los extremos se puede realizar de diversas maneras conocidas por el experto en la materia, tal como el uso de transferasa terminal para añadir nucleótidos modificados con biotina (o dig), o la hibridación con oligonucleótidos marcados adecuadamente.

Este constructo de ADN se incuba durante unos pocos minutos en una disolución de perlas adecuadas (por ejemplo las revestidas con estreptavidina), a las cuales se une mediante uno de sus extremos marcados (por ejemplo biotina). Las perlas pueden ser transparentes si se usan más tarde pinzas ópticas para la manipulación,

o magnéticas si se usan trampas o pinzas magnéticas para la manipulación.

El ensamblaje de perla-ADN se inyecta en una cámara fluídica, cuya superficie se ha tratado para unirse al otro extremo marcado de la molécula (por ejemplo una superficie revestida con anti-Dig, para unir el extremo con Dig del ADN). Las perlas se anclan así a la superficie vía una horquilla de ADN (ver la figura 1a a continuación). La distancia de la perla a la superficie se monitoriza entonces por diversos medios. Por ejemplo, para deducir su distancia, se pueden usar los anillos de difracción de la imagen de las perlas en una cámara.

Para medir su distancia, también se podría usar la intensidad de luz dispersada por las perlas (o emitida como fluorescencia) cuando se iluminan en un modo evanescente. Como alternativa, cuando se usan perlas magnéticas, el campo magnético generado se puede medir (usando sensores GMR o Hall) para deducir la distancia de las perlas a la superficie, enviado a un sensor en la superficie de anclaje.

Para tirar de la molécula de ADN que ancla las perlas a la superficie, se han descrito diversas técnicas. Se puede usar la luz de un haz de láser enfocado, para atrapar una perla transparente cerca del punto focal. Mediante la translación relativa del haz con respecto a la superficie de anclaje, se puede aplicar una fuerza en la molécula anclante (un ensayo de pinzas ópticas típico). La fuerza ejercida, que es proporcional al desplazamiento de la perla desde su posición de equilibrio, para ejercer una fuerza constante sobre la molécula anclante requiere un bucle de retroalimentación en el haz que atrapa.

Para ejercer una fuerza constante en una perla, se ha descrito el uso del arrastre hidrodinámico generado por un flujo alrededor de la perla, pero habitualmente produce una baja exactitud espacial (>100 nm). El ejemplo particular usa una trampa magnética para tirar de las perlas superparamagnéticas ancladas a una superficie mediante una horquilla de ADN como se describe anteriormente. En esta configuración, se usan pequeños imanes colocados encima de la muestra para aplicar una fuerza constante sobre la perla anclada, cuya posición se puede determinar con una exactitud de – 1 nm (dependiendo de la fuerza de tracción y la disipación debido al arrastre hidrodinámico).

En cada caso, se observa que la horquilla anclante se puede abrir mecánicamente de forma total tirando de las perlas con una fuerza mayor que alrededor de 16 pN. La reducción de la tensión en la molécula por debajo de 11 pN permite que la horquilla vuelva a cerrarse espontáneamente (la transición de la apertura de la cremallera es reversible, aunque histerética).

Si, durante la fase de cremallera abierta, algunas moléculas en disolución (tales como proteínas y/u oligonucleótidos complementarios de ADN, ARN, LNA o PNA) se han unido a un ADN(bc) monocatenario estirado, estas moléculas bloquearán transitoriamente el cierre nuevamente de la cremallera de la horquilla cuando la fuerza se reduce hasta por debajo de -11 pN.

Midiendo la extensión de la molécula de ADN Z(t) (la distancia de la perla a la superficie) a lo largo de una serie de ciclos durante una de estas pausas de reapertura de la cremallera, se puede determinar la posición del bloqueo con una precisión de aproximadamente 1 nm (que corresponde a la distancia abarcada por dos nucleótidos (1 pb) en un ADNmc bajo una fuerza de 10 pN). Además, midiendo el tiempo medio de bloqueo, se puede determinar Toff = 1/koff. Midiendo Pbloqueo, y conociendo la concentración de la molécula [M], es posible obtener acceso a Ton, y de este modo a kon. Uno o ambos de estos parámetros ayuda a caracterizar la naturaleza de la unión. Por ejemplo, es posible determinar si es debido a una hibridación perfecta con un oligonucleótido complementario o no, o si una proteína estabiliza la hibridación o no, o si hay un error de apareamiento y dónde está (por ejemplo en el centro del oligonucleótido hibridado o cerca de uno de sus extremos).

Estas observaciones sugieren diversas formas de realización para aplicaciones en la detección de modificaciones del ADN, y más generalmente en la detección de la interacción de proteínas con ADNmc o

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Claims

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