CN110470844A - 基于解旋酶检测dna与蛋白质相互作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测DNA与蛋白质相互作用的方法，所述方法基于解旋酶，通过DNA分子长度的变化，确定蛋白质在发卡DNA上的结合位点。与现有技术相比，本发明的方法为单分子操作，直观反映蛋白质分子和DNA分子的相互作用；本方法的精确率很高，达到一个碱基对；本发明的方法还可以检测DNA与蛋白质的各个结合位点的结合强度的强弱；所述方法所需要的DNA和蛋白质的用量很少。

Description

基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法
技术领域
本发明属于分子生物学研究领域，涉及一种用于检测DNA与蛋白质相互作用的方法。
背景技术
在细胞的生命活动过程中，DNA的复制与重组、RNA的转录与修饰，以及病毒的感染与增殖等等，都是涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白质结合因子之间的相互作用。因此，长期以来人们就一直关注DNA结合蛋白的研究。蛋白质与DNA的相互作用也是分子生物学研究的中心问题之一。核酸-蛋白的互作在生命活动中发挥着广泛而重要的作用，二者的协作是各种生命现象的基础。将细胞或细胞器中的蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用联系起来，是综合研究一个完整的生物学途径的核心内容。
有一类非组蛋白，它们能从DNA双链外部的大沟、小沟中识别碱基排列并与碱基形成氢键，从而与一段较短的特异DNA序列结合，这类蛋白质被称为序列特异性DNA结合蛋白质。它们可参与染色体构建，启动基因的复制，调控基因的转录等。这正是我们想要检测的蛋白质类型。
目前，检测序列特异性DNA结合蛋白质结合位点的方法主要有凝胶阻滞实验、染色质免疫共沉淀技术、DNaseⅠ足迹实验、甲基化干扰实验等。但这些技术方法都属于体实验，存在反应物用量大、DNA底物需要放射性标记、实验周期长等缺点。而且，传统的试验方案中常常因为DNA探针需要标记而使实验过程变得比较繁琐，同时，也存在某种程度的放射性核素污染和伤害。
具体地，凝胶阻滞试验(gel retardation assay)是用于研究DNA或RNA与蛋白质相互作用的重要实验技术之一。在凝胶实验中，传统的方法是用放射性同位素或其他生物素标记待检测的DNA片段(又称探针DNA，probe)然后与细胞蛋白质提取物一道温育，于是便形成了DNA蛋白质复合物。将其移入非变性的聚丙酰胺凝胶中，控制蛋白质与探针保持结合状态，电泳。最后借助放射性自显影技术(或其它适当技术)显现DNA条带位置。如果细胞蛋白质中不存在与探针结合的蛋白质，那么，所有DNA条带都将集中出现在凝胶底部；反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的的探针-蛋白质复合物条带就将滞后出现在较靠后位置。凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞提取物中是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，用来研究此种结合作用的DNA序列的特异性，而且还可以用于捕捉在特定条件干预下，双方结合的变化及外界干预对其变化的影响等生物信息。然而，此方法制胶过程繁琐，电泳时间长。
DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay)是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。该方法需对DNA进行单链标记，操作复杂，需要专门的检测手段。
甲基化干扰试验根据DMS能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计。其操作结束后也需要做凝胶阻滞试验，因而操作比较繁琐。
酵母单杂交技术广泛用于DNA与蛋白相互作用的研究，但其基本操作需要三个方面的过程，涉及分子生物学的大量方法，需要酵母菌作为载体。
噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲选择相结合的技术，核酸适体技术首先是利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有1014～1015个单链寡核苷酸序列的随机文库，体内足迹试验原理与甲基化试验基本相同，其实质是体外甲基化试验的变种，免疫沉淀技术操作步骤更加繁琐，
因此，以上常用的研究DNA与蛋白质相互作用的方法都有一定的局限性，不能全面反映DNA与蛋白质相互作用的真实情况。
发明内容
因此，本发明的目的是克服传统方法的上述缺陷，提供一种用于检测DNA与蛋白质相互作用的方法。具体地，本发明提供了一种使用单分子操控技术拉伸双链DNA，通过DNA分子长度的变化，确定蛋白质在发卡DNA上的结合位点的方法。本发明的方法能够特异性检测DNA与蛋白质的相互作用，并确定具体的结合位点和结合序列。
一方面，本发明提供了一种基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：
1)根据所检测的蛋白质设计DNA分子；
其中，所述DNA分子包含发卡结构和两个双链DNA手柄，所述发卡上含有解旋酶结合位点，两个双链DNA手柄的末端分别修饰地高辛和生物素，并且所述解旋酶的解旋方向是解旋发卡DNA的方向；
2)将步骤1)得到的DNA分子与链霉亲和素修饰的顺磁性小球溶液混匀，使DNA分子修饰生物素的手柄与顺磁性小球连接，获得DNA分子与顺磁性小球的组合体；
其中，1μL 50pmol的DNA分子使用1～50μL浓度为10mg/ml的磁性小球混匀；
3)将步骤2)获得的DNA分子与顺磁性小球的组合体放入磁镊装置的样品池中，所述样品池的表面耦合抗地高辛，使得所述组合体连接到样品池的表面；利用微流泵向样品池中加入解旋酶，并对DNA分子施加6～8pN的拉力，得到第一信号；
4)将步骤2)获得的DNA分子与顺磁性小球的组合体放入磁镊装置的另一样品池中，所述样品池的表面耦合抗地高辛，使得所述组合体连接到样品池的表面；利用微流泵向样品池中加入待检测的蛋白质，然后加入解旋酶，对DNA分子施加6～8pN的拉力，得到第二信号；
5)比较第一信号和第二信号，得到蛋白质在发卡DNA上的结合位置。
优选地，在步骤1)中，两个双链DNA手柄的末端分别修饰10～30个地高辛和10～30个生物素；更优选地，两个双链DNA手柄的末端分别修饰18个地高辛和18个生物素。DNA手柄末端含多个生物素。它们可以和顺磁性小球的多个链霉亲和素相互连接，使DNA和顺磁性小球的连接更加稳固，与单个相互作用的连接相比，实验成功率明显提高。
优选地，在步骤1)中，所述发卡DNA的碱基个数和碱基序列根据所检测蛋白质分子能够结合的碱基数来决定；
优选地，在步骤1)中，DNA的手柄长度不超过700个碱基对；DNA的手柄长度越短，顺磁性小球的布朗涨落越小，实验的精度越高，因此DNA手柄长度不超过700个碱基对。
优选地，在步骤2)中，1μL 50pmol的DNA分子使用10μL浓度为10mg/ml的磁性小球混匀。
优选地，在步骤3)中，使样品池的表面耦合抗地高辛包括以下步骤：
在样品池中加入DNA分子与顺磁性小球的组合体之前，向样品池中加入100μL的1mg/ml的抗地高辛溶液，孵育2小时，使抗地高辛耦合在样品池表面。
优选地，在步骤3)中，所述磁镊为纵向磁镊。所用纵向磁镊可以对DNA分子施加的纵向拉力的范围为0～20pN，所用磁镊的分辨率为1nm。
优选地，在步骤3)中，所述解旋酶与DNA分子的摩尔比为0.1～10:1000；更优选地为1:1000优选地，在步骤3)中，只有解旋酶时解旋的信号表现为DNA分子长度连续伸长的曲线。此步骤中，在拉力F的选择上，进行了优化，拉力值越大，实验精度越高；而拉力过大，发卡结构的稳定性降低，解旋酶不能正常解旋。综合两方面因素拉力选择为6～8pN。
优选地，在步骤4)中，所述待检测的蛋白质与DNA分子的摩尔比为200000:0.1～10；更优选地，所述待检测的蛋白质与DNA分子的摩尔比为200000:1。
优选地，在步骤4)中，加入待检测的蛋白质后，孵育5分钟。
优选地，在步骤4)中，解旋酶和DNA结合蛋白共同存在时，解旋酶解旋的信号不再是DNA分子长度连续伸长的曲线，曲线中出现暂停或中止的现象。
优选地，在步骤5)中，将结合位置和DNA序列进行对应，得到DNA结合蛋白在DNA上的结合位点和具体的结合序列。
优选地，所述方法还包括使用倒置显微镜观测顺磁性小球的位置，以表征DNA分子的长度变化；
优选地，所述方法还包括通过DNA分子长度的变化来测量DNA与蛋白质相互作用中各个结合位点的结合强度的强弱。
优选地，所述方法包括通过发卡DNA分子长度的变化确定发卡DNA与蛋白质结合位点的初始位置和/或末端位置。
优选地，所述方法还包括：对发卡DNA执行旋转180度操作，确定发卡DNA与蛋白质结合位点的末端位置。
与现有技术相比，本发明的方法具有以下优点：
1)本发明的方法为单分子操作，直观反映蛋白质分子和DNA分子的相互作用；
2)本发明的方法精确率取决于所用的磁镊装置，目前的磁镊装置可以将精确率提高到一个碱基对，也就是说此方法的精确率是一个碱基对，精确率很高；
3)对于存在多个结合位点的蛋白质，使用本发明的方法还可以得到所检测蛋白质对各个结合位点的结合强度的强弱；
4)本发明的方法整个操作过程简单且所用时间短，而传统的检测蛋白质和DNA相互作用的方法操作复杂且实验周期时间长(传统的方法需要的步骤：蛋白-DNA复合物相互结合，加入抗体和复合物相结合，加入抗原，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀对沉淀下来的复合物进行清洗，洗脱，得到富集的目的蛋白-DNA复合物，解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析)；
5)本发明的方法所需要的DNA结合蛋白的用量很少，传统方法需要消耗大量的DNA结合蛋白。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实验所用的磁镊装置的示意图；
图2为所涉及的发卡DNA分子的连接图；
图3显示了未被蛋白质结合了的发卡DNA分子被解旋前的形态；
图4显示了未被蛋白质结合了的发卡DNA分子被解旋后的形态；
图5显示了被蛋白质结合了的发卡DNA分子被解旋前的形态；
图6显示了被蛋白质结合了的发卡DNA分子被解旋过程中出现暂停的状态；
图7显示了未被Sso7d结合的发卡DNA被解旋酶BLM解旋的曲线；
图8显示了被Sso7d结合的发卡DNA被解旋酶BLM解旋的曲线。
具体实施方式
实施例1使用本发明的方法检测DNA与蛋白质相互作用
本实施例中所用的DNA结合蛋白为Sso7d，Sso7d是硫化叶菌中的一中DNA结合蛋白，Sso7d能与DNA的四个碱基对相结合。目前的研究方法，没有观察到Sso7d和DNA结合的序列特异性，本实施例所用的解旋酶为BLM，BLM全称为Bloom，它与人类的基因疾病有关，如果BLM蛋白没有被正确表达，会导致布鲁姆综合症。布鲁姆综合症是一种严重的常染色体基因疾病，容易诱导癌症的发生。
1)DNA分子的设计；
在此例子中，所用的发卡DNA含有42个碱基对，DNA的发卡结构的碱基序列如SEQID NO:1所示：
5’-ACAGGCAGTCGTGGGGTAGAGTTTCAGCATCGGCGTTAGCTTTTGCTAACGCCGATGCTGAAACTCTACCCCACGACTGCCTGT-3’，
发卡部分在上海生工生物工程有限公司合成。
手柄DNA的长度为700个碱基对；
两个DNA手柄的末端分别连有平均约18个地高辛和18个生物素，其合成过程为：在正常的PCR过程中加入地高辛或生物素标记的dUTP，dUTP与dTTP浓度比为1:10，使其在PCR过程中随机替代dTTP插入新合成的DNA链中。
发卡部分与两端的手柄通过T4DNA连接酶连接。
2)取1μL50pmol的DNA分子与10μL10毫克每毫升的顺磁性小球(购买于Invitrogen公司，Dynabeads M-280,表面Streptavidin修饰)溶液，置于离心管中，两者混合均匀，DNA的一个手柄与顺磁性小球通过生物素-链霉亲和素之间的共价相互作用相链接。
特别的，我们设计的DNA的这个手柄末端含有多18个生物素，它们可以和顺磁性小球表面的多18个链霉亲和素相互连接，使DNA和顺磁性小球的连接更加稳固，与单个相互作用的连接相比，实验成功率明显提高。所用的DNA结合蛋白为Sso7d，Sso7d是硫化叶菌中的一中DNA结合蛋白，目前文献报道，Sso7d能与DNA的四个碱基对相结合。所用的解旋酶为BLM。
3)将步骤2)获得的顺磁性小球和发卡DNA分子的组合体放入磁镊装置的样品池中，完成图2所示的DNA分子的连接(DNA分子一端连接在样品池的玻璃表面，一端连接着顺磁性小球)；此连接是利用样品池表面的抗地高辛(向样品池中加入顺磁性小球和DNA分子的组合体之前，预处理样品池表面，具体是指，向样品池中加入100μL的1mg/ml的抗地高辛溶液，孵育2小时，使抗地高辛耦合在样品池表面)和DNA手柄上的地高辛相互作用；实验所用磁镊为纵向磁镊。在磁镊装置的样品池中，加入已经完成连接的磁球和发卡DNA的组合体，完成图2所示的DNA分子的连接。此连接是利用样品池表面的抗地高辛和DNA手柄上的地高辛相互作用。利用微流泵，向体系中加入浓度为5nM的解旋酶BLM，对DNA分子施加适当的拉力F＝8pN，得到DNA解旋信号，此时的信号表现为DNA分子长度连续伸长的曲线。图7展示了此条件下的解旋曲线。
4)在新的样品池里，重新完成图2所示的DNA分子的连接，之后利用微流泵，加入1μM浓度的DNA结合蛋白Sso7d，孵育5分钟，使DNA结合蛋白结合在DNA上，之后，向体系中加入5nM浓度的解旋酶BLM，对DNA分子施加适当的拉力F＝8pN，可以得到新的一组DNA解旋信号。图8展示了此实验条件下的解旋曲线。
5)把步骤4)中曲线与步骤3)中所得的解旋信号进行比对，观察步骤5中曲线上升过程中停留的位置，即图8中单线线段和双线线段标注的位置，此位置到曲线基线的距离和整个上升长度做对比，得到蛋白质在发卡DNA上的结合位置：距离发卡开口处12个碱基对(红色线段标注处)和距离发卡开口处26个碱基对(蓝色线段标注处)的位点。
6)利用步骤5)中所得的结合位置和DNA序列进行对应，得到DNA结合蛋白在DNA上的结合位点。结合位点为和且可以通过统计结合在两个位点的时间概率，得到两个位点的结合强弱的比较，曲线中Sso7d与位点的结合的时间概率(即双线线段所覆盖区域的时间占总时间的比例，25％)高于与位点的结合(即单线线段所覆盖区域的时间占总时间的比例，11％)，因此Sso7d与位点的结合强于与位点的结合。
目前，通过传统的研究蛋白质和DNA相互作用的方法，关于Sso7d并没有序列特异性结合的报道，我们的方法在检测结合位点方面灵敏度较传统方法高，因此可以检测出Sso7d对不同碱基序列的结合的强弱。
具体地，在实施例中通过对结合位置和DNA序列进行对应，得到DNA结合蛋白在DNA上的结合位点。结合位点为和且可以通过统计结合在两个位点的时间概率，得到两个位点的结合强弱的比较，曲线中Sso7d与位点的结合的时间概率高于与位点的结合，因此Sso7d与位点的结合强于与位点的结合。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院物理研究所
<120> 基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法
<130> DIC18110028
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaggcagtc gtggggtaga gtttcagcat cggcgttagc ttttgctaac gccgatgctg 60
aaactctacc ccacgactgc ctgt 84

Claims (10)

1.一种基于解旋酶检测DNA与蛋白质相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：
1)根据所检测的蛋白质设计DNA分子；
其中，所述DNA分子包含发卡结构和两个双链DNA手柄，所述发卡上含有解旋酶结合位点，两个双链DNA手柄的末端分别修饰地高辛和生物素，并且所述解旋酶的解旋方向是解旋发卡DNA的方向；
2)将步骤1)得到的DNA分子与链霉亲和素修饰的顺磁性小球溶液混匀，使DNA分子修饰生物素的手柄与顺磁性小球连接，获得DNA分子与顺磁性小球的组合体；
其中，1μL 50pmol的DNA分子使用1～50μL浓度为10mg/ml的磁性小球混匀；
3)将步骤2)获得的DNA分子与顺磁性小球的组合体放入磁镊装置的样品池中，所述样品池的表面耦合抗地高辛，使得所述组合体连接到样品池的表面；利用微流泵向样品池中加入解旋酶，并对DNA分子施加6～8pN的拉力，得到第一信号；
4)将步骤2)获得的DNA分子与顺磁性小球的组合体放入磁镊装置的另一样品池中，所述样品池的表面耦合抗地高辛，使得所述组合体连接到样品池的表面；利用微流泵向样品池中加入待检测的蛋白质，然后加入解旋酶，对DNA分子施加6～8pN的拉力，得到第二信号；
5)比较第一信号和第二信号，得到蛋白质在发卡DNA上的结合位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，两个双链DNA手柄的末端分别修饰10～30个地高辛和10～30个生物素；优选地，两个双链DNA手柄的末端分别修饰18个地高辛和18个生物素。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2)中，1μL 50pmol的DNA分子使用10μL浓度为10mg/ml的磁性小球混匀。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，使样品池的表面耦合抗地高辛包括以下步骤：
在样品池中加入DNA分子与顺磁性小球的组合体之前，向样品池中加入100μL的1mg/ml的抗地高辛溶液，孵育2小时，使抗地高辛耦合在样品池表面。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，所述解旋酶与DNA分子的摩尔比为0.1～10:1000；更优选地为1:1000。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4)中，所述待检测的蛋白质与DNA分子的摩尔比为200000:0.1～10；更优选地，所述待检测的蛋白质与DNA分子的摩尔比为200000:1。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4)中，加入待检测的蛋白质后，孵育5分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤5)中，将结合位置和DNA序列进行对应，得到DNA结合蛋白在DNA上的结合位点和具体的结合序列。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括使用倒置显微镜观测顺磁性小球的位置，以表征DNA分子的长度变化；
优选地，所述方法还包括通过DNA分子长度的变化来测量DNA与蛋白质相互作用中各个结合位点的结合强度的强弱。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括通过发卡DNA分子长度的变化确定发卡DNA与蛋白质结合位点的初始位置和/或末端位置。
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